刘红[1]2003年在《HBV蛋白相关免疫应答致HBV转基因小鼠肝组织病理损伤的研究》文中研究指明乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)严重危害人类的健康，感染机体后可发生急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化和肝癌。全球约有3.5亿慢性感染者，亚洲属于高流行区，以围产期传播为主，约有1／3～1／4的慢性HBV感染者将会发生进展性肝病(肝硬化和肝癌)。 对乙型肝炎发病机制的研究一直受到人们的广泛关注。目前认为，乙型肝炎患者肝脏等脏器的病理改变主要是由病毒各基因编码的蛋白与宿主间的免疫反应造成的，但是其具体病理损伤机制还不甚清楚。在HBV各基因编码的蛋白中，HBV中蛋白和核心蛋白均具有较强的免疫原性，能诱导机体产生较强的体液和细胞免疫应答；而且HBV中蛋白和核心蛋白相关的免疫应答成分能否造成肝脏病理损伤还不清楚。为了解乙型肝炎的发病机制，尤其是HBV中蛋白相关的免疫应答成分在乙型肝炎发病中的作用，我们利用已建立的含HBV preS2.S基因的转基因小鼠Balb／c-TgN(preS2-S／ayw)为慢性HBV携带者模型，采用DNA免疫和过继转移的实验方法进行了乙型肝炎发病机制方面的研究。而且，目前对人肝细胞核内核心蛋白的功能还不了解，国内也没有乙肝病毒核心蛋白基因转基因小鼠，为进一步探讨乙肝病毒核心蛋白在乙型病毒性肝炎发病机制中的作用，需建立一个合适的动物模型。本实验分两部分。 第一部分HBV中蛋白相关免疫应答致乙型肝炎转基因小鼠病理损伤的研究 用已建立的含HBV preS2.S基因的转基因小鼠Balb／c-TgN(preS2-S／ayw)与正常同品系小鼠交配，获得127只子代小鼠，经PCR和肝脏活检组织免疫组织化学筛选，得到二者均阳性的转基因小鼠41只。用含HBV preS2.S基因的质郑州人学博l_学位沦义中文摘要粒PcDNA3一S2，S经胫骨前肌肌肉注射免疫正常Balb/c小鼠，获得抗血清和致敏脾细胞。将抗血清、致敏脾细胞(受体小鼠经SGy亚致死剂量照射，以下简称照射)、抗血清十致敏脾细胞(照射)、致敏脾细胞(受体小鼠未经SGy亚致死剂量照射，以下简称未照射)、纯化的单克隆抗体和正常脾细胞经尾静脉注射到含HBv preSZ.S基因的转基因小鼠体内。设同窝非转基因小鼠为对照。在不同时间点(O、2 or4、7、14 or Zld)经眼眶球后静脉采血，检测受体小鼠血清HBsAg、抗HBS抗体、前S2抗原、抗前S2抗体、转氨酶、尿素氮和肌配的变化。并同时颈椎脱臼处死小鼠，取肝、脾、肾、肠、肺和肌肉组织常规石蜡包埋、切片、H一E染色和免疫组织化学检测，观察各器官、组织的病理改变和HBsAg的表达情况。 DNA免疫有效诱导出免疫应答后，将免疫后小鼠抗血清、致敏脾细胞和抗血清+致敏脾细胞分别过继转移到转基因小鼠体内后，转基因小鼠肝脏均不同程度地出现类似人急性乙型肝炎的病理改变，表现为肝细胞广泛的气球样变，血窦内皮细胞肿胀，KuPfl七r细胞增生，汇管区和肝小叶内肝细胞的坏死伴不同程度的单个核细胞的浸润。抗血清组无致敏脾细胞的输入，单个核细胞的浸润出现最早，程度最重，说明肝小叶内浸润的单个核细胞是受体小鼠来源的，是非HBV特异性的，非特异性的免疫应答参与了转基因小鼠肝组织的免疫病理损伤。抗血清+致敏脾细胞组(照射)、致敏的脾细胞组(照射)、致敏的脾细胞组(未照射)叁组肝组织的病理变化较抗血清组出现晚，程度较同期为轻，而且致敏的脾细胞组(照射)较致敏的脾细胞组(未照射)病理变化出现晚、程度较同期为轻。经照射的转基因小鼠第7d脾脏萎缩，第14d脾脏增生，镜下可见淋巴细胞增生和多核巨细胞。脾脏的增生与肝小叶内单个核细胞浸润出现的时间是一致的。这些结果进一步的说明肝内浸润的单个核细胞是受体小鼠来源的，可能来源于脾脏，是非抗原特异性的，非特异性免疫应答参与了乙型肝炎的免疫病理损伤。而过继转移正常小鼠的脾细胞没有引起受体小鼠出现类似人急性乙型肝炎的改变，提示特异性免疫应答在乙型肝炎免疫病理损伤中的关键性作用。抗血清+致敏脾细胞 (照射)和抗血清组肾脏有少量单个核细胞的浸润。肺、小肠和肌肉组织等组织无明显的病理改变。对照组小鼠未出现类似人急性乙型肝炎的病理改变，仅有肝细胞的轻微肿胀。转移单克隆抗一HBs抗体和抗前S2抗体导致了肝细胞的广泛水郑州人学博卜，i-一f办_论丈中文摘要肿，但无肝小叶内和汇管区的单个核细胞浸润，两种抗体引起的病理改变无明显差别。而抗血清组除有肝细胞的广泛水肿外，还有肝小叶内单个核细胞浸润，提示单个核细胞浸润是由抗血清中抗体外的成分引起的。抗血清组或/和致敏脾细胞组肝细胞气球样变后有HBsAg表达的减少(P<0.05)，提示气球样变可能是肝细胞清除乙肝病毒的病理表现，肝细胞在乙肝病毒的清除中起着重要作用。 第二部分乙型肝炎病毒核心蛋白基因转基因小鼠的产生 应用受精卵原核显微注射技术，将线性化的含有核心蛋白基因恤Fw亚型)的真核表达质粒peDNA3一HB。注射入C57BU6小鼠受精卵雄性原核中，然后植入12只假孕母鼠。共注射211个受精卵，生产24只仔鼠，全部存活。抽提仔鼠尾组织DNA，PCR筛选到6只Founder小鼠(F。代)，转基因整和率为250/0，与通常25
曹力波[2]2009年在《酒精致HBV-Tg小鼠肝损伤及水飞蓟素和/或拉米夫定的保护作用及机制探讨》文中研究说明目的:本研究旨在研究酒精对HBV转基因小鼠体内病毒复制、肝功能、肝脏形态学的影响,并从小鼠肝脏NF-κB、TGF-β1等细胞因子基因转录和蛋白水平表达变化来探讨其可能的机制,以明确酒精和HBV对肝脏的损害是否有协同作用并探讨其机制;进一步用拉米夫定和/或水飞蓟素对其进行治疗,观察其治疗效果,并对其机制进行探讨。方法:50只HBV转基因小鼠随机分为5组,每组10只,20只同种系(Balb-c)野生型小鼠作为对照组和酒精刺激组。A组:野生型小鼠+生理盐水灌胃;B组:野生型小鼠+酒精灌胃;C组:HBV转基因小鼠+生理盐水灌胃;D组:HBV转基因小鼠+酒精灌胃;E组:HBV转基因小鼠+酒精+拉米夫定(100mg/kg体重)灌胃;F组:HBV转基因小鼠+酒精+拉米夫定(100mg/kg体重)+水飞蓟素(200mg/kg体重)灌胃;G组:HBV转基因小鼠+水飞蓟素(200mg/kg体重)灌胃。于10周末处死小鼠,摘除眼球法收集血液进行肝功能和HBV病毒滴度检查,组织病理HE染色后观察肝脏形态,RT-PCR观察各组小鼠肝脏组织NF-κB、TGF-β1 mRNA的表达水平,免疫组化观察肝脏组织NF-κB、TGF-β1蛋白表达水平。结果:(1)HBV转基因小鼠NF-κB、TGF-β1 mRNA和蛋白的表达增加,但肝功能和肝脏形态无变化。(2)酒精可以引起HBV转基因小鼠肝损伤:表现为血清AST、ALT水平的增高,肝脏内炎症细胞浸润增加;体内病毒复制水平、NF-κB、TGF-β1 mRNA和NF-κB、TGF-β1蛋白的表达均增加(与C组比P＜0.05)。(3)拉米夫定不能降低酒精引起的血清AST、ALT水平的增高,不能降低酒精引起的HBV转基因小鼠体内病毒复制的增加(与D组比P＞0.05);但可降低酒精引起的HBV转基因小鼠肝脏NF-κB、TGF-β1mRNA的转录增加(与D组比P＜0.05);而对HBV转基因小鼠肝脏NF-κB、TGF-β1蛋白表达增加的影响不明显(与D组比P＞0.05)。(4)水飞蓟素可降低酒精引起的HBV转基因小鼠血清AST、ALT水平的增高,减少肝脏内炎症细胞浸润,并可降低酒精引起的小鼠肝脏NF-κB、TGF-β1 mRNA和NF-κB、TGF-β1蛋白的表达增加(与D组比P＜0.05),但对HBV转基因小鼠血清HBV-DNA水平影响不明显(与D组比P＞0.05)。(5)水飞蓟素和拉米夫定联用可明显降低酒精引起的小鼠血清AST、ALT水平、减少肝脏内炎症细胞浸润;并可降低小鼠肝脏NF-κB、TGF-β1 mRNA和NF-κB、TGF-β1蛋白表达的增加(与D组比P＜0.05),虽HBV复制水平也有下降趋势,但无统计学差异(P＞0.05)。结论:(1)酒精可增加HBV转基因小鼠体内HBV的复制,引起HBV转基因小鼠肝损伤;其机制可能与促进NF-κB、TGF-β1等炎症因子的表达有关。(2)单用拉米夫定不能够降低由酒精引起的HBV转基因小鼠体内HBV-DNA复制水平和AST、ALT水平的增高。(3)水飞蓟素及水飞蓟素和拉米夫定联用可降低酒精引起的HBV转基因小鼠血清AST、ALT水平,减轻肝组织内炎症细胞浸润程度,对肝脏起一定保护作用,其保护机制可能与降低肝脏NF-κB、TGF-β1mRNA转录和NF-κB、TGF-β1蛋白表达有关。
李小松[3]2015年在《顺铂诱导HBV再激活和肝细胞损伤的分子机制研究》文中指出乙型病毒性肝炎是一种严重威胁人类健康的重要公共卫生问题,据世界卫生组织报道,全世界约20亿人曾感染过HBV,其中近4亿成为HBsAg性的慢性携带者,而其中的3/4是来源于中国；全球每年因HBV感染所致死的近100万,其中约半数在中国。同时据世界卫生组织统计,癌症是目前人类最主要的死亡原因之一；而这些肿瘤患者合并有HBV感染的数目也极其庞大,当这些患者在接受化疗或免疫抑制剂治疗时,其中部分患者会发生HBV再激活的现象,大量瞬时活化的HBV则可能导致机体出现严重的肝功能损伤甚至是肝衰竭,从而引起治疗减缓或是中断,继而耽误肿瘤患者的有效治疗,必将严重影响其预后甚至是危及其生命。近年来,国内外已有多项临床实验证实顺铂等化疗药物可以诱导HBV再激活,从而引起HBV复制增强,同时伴随急性肝功能损伤或肝衰竭的危象,导致病死率急剧上升。但是顺铂诱导HBV再激活的分子机制至今仍不清楚。本研究中,我们首先在体外成功构建了基于环化自连的HBV DNA (circularized HBV DNA)感染的细胞和动物模型,并通过与线性HBV DNA感染模型比较,发现circularized HBV DNA的感染效率和复制水平明显优于线性的HBV DNA (P<0.05),由于circularized HBV DNA在结构上完全等同于HBV cccDNA,因而在没有外源载体DNA的干扰下,可以更加真实地反应HBV感染的基本病理生理过程；进而为下一步的实验研究及HBV慢性持续感染的机制和抗病毒的治疗提供强有力的依据。其次,我们分别在体内和体外证实：顺铂一方面可以通过直接上调HBV复制相关转录因子PGC-1α和HNF-4α的表达,从而增强HBV核心启动子活性,继而在转录水平上调HBV的复制；另一方面可以直接上调HBV cccDN A的表达,从而导致HBV D NA水平显着增加。最后,我们通过RT-PCR、Western-blot、BrdU、siRNA和流式细胞术等实验证实,DDP诱导HBV再激活致肝细胞损伤的分子机制主要通过以下两个途径来完成：其一,顺铂可以直接诱导肝细胞氧化应激(ROS水平上调),并抑制其细胞的增殖从而阻滞于S期；高氧化状态下的内环境导致内质网应激,从而引发未折迭蛋白反应,当UPR超载时,诱发细胞凋亡,参与急性肝细胞损伤甚至肝功能衰竭的病理生理过程；其二,顺铂显着上调细胞Alix蛋白表达,并增加HBV核心颗粒的直接释放,显着增加的HBcAg有可能作为一种强免疫原,从而激发机体发生强烈的免疫反应,继而导致急性肝细胞损伤及肝衰竭；同时姜黄素和NAC可以成功规避在临床上由顺铂所引发的HBV再激活的风险,因此可将姜黄素和NAC作为阻断其关键靶点的潜在靶向性药物。本实验研究发现,顺铂诱导HBV再激活的主要机制为：顺铂通过直接上调HBVcccDNA、PGC-1α和HNF-4α的表达,从而引起HBV的复制水平显着增加,同时诱导细胞内质网应激及ROS的产生和病毒核心颗粒的直接释放,参与了患者急性肝细胞损伤及肝衰竭的病理生理过程,该研究有望为全面解析临床HBV再激活奠定坚实的基础。
参考文献：
[1]. HBV蛋白相关免疫应答致HBV转基因小鼠肝组织病理损伤的研究[D]. 刘红. 郑州大学. 2003
[2]. 酒精致HBV-Tg小鼠肝损伤及水飞蓟素和/或拉米夫定的保护作用及机制探讨[D]. 曹力波. 中南大学. 2009
[3]. 顺铂诱导HBV再激活和肝细胞损伤的分子机制研究[D]. 李小松. 重庆医科大学. 2015
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