铜绿假单胞菌DN1参与石油烃降解基因功能及趋化性研究

论文摘要

石油烃化合物的污染治理是亟待解决的问题,微生物修复是一种理想的方法,而目前烃类污染物的成分复杂及疏水特性限制了降解菌对其摄取和降解。本研究以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DN1作为出发菌株,对其参与石油烃化合物降解及趋化性过程中的关键基因展开功能探索,以期揭示微生物如何摄取利用烃类污染物的分子转运机制,进而实现烃类污染物修复。前期的研究表明,铜绿假单胞菌DN1具有降解原油、烷烃和芳烃的能力。为进一步了解其降解机制,首先利用比较基因组学手段预测分析了6株石油烃降解菌株中烷烃羟化酶、环羟基化双加氧酶及趋化系统,比对结果显示:石油烃降解菌的降解酶系统呈现多样性,但这些基因的同源性及分布之间存在一定差异,在一定程度上影响并决定了菌株底物降解谱的多样性。其次,我们通过气相色谱技术检测了菌株DN1对原油和不同正构烷烃的降解情况,同时利用RT-qPCR技术监测了烷烃羟化酶基因的实时表达,并通过同源重组技术构建基因缺失突变株进一步研究其基因功能。实验结果表明:DN1能够利用原油和链长为8-40个碳原子的多种正构烷烃作为唯一碳源,降解率高达85%。RT-qPCR分析显示,五种烷烃羟化酶基因可以被C8至C40的正构烷烃诱导,且不同正构烷烃条件下基因表达量不同。而在所有的正构烷烃中,alkB2基因表达基本上调,尤其是长链烷烃如C20和C32存在的条件下。同时,长链烷烃(C20-C36)诱导下cyp153表达水平显著提高,而两个almA基因仅在链长为C32以上的烷烃存在时表达量上调。此外,基因敲除实验表明,alkB2在广谱的烷烃生物降解中可能起关键作用,其它的羟化酶系统确保了链长为C20-C40的正构烷烃能被利用。将多株具有降解能力的铜绿假单胞菌的AlkB2氨基酸序列进行比对分析发现其同源性约99.65%。甲基受体趋化蛋白（methyl-accepting chemotaxis proteins,MCPs）在细菌接收和感应外界化学信号刺激中发挥了重要作用。前期菌株DN1在荧蒽诱导下转录组学分析表明,部分mcp基因表达量上调,其中包括mcp04325,mcp10445,mcp28325,mcp29160等。在此基础上,我们研究了菌株DN1中部分mcp突变株对不同芳烃、烷烃及中间代谢产物的趋化特性,通过其趋化特性的改变,进一步利用蛋白外源表达及等温滴定热量技术（ITC）验证其结合能力。实验结果表明:菌株DN1对检测的不同中间产物、芳烃及烷烃基本上都具有趋化特性,推测趋化性可能与烃类化合物降解密切相关,其有助于烃类化合物的降解。同时部分mcp突变株趋化性表型显示mcp00975、mcp04325、mcp10445基因缺失导致菌株对原儿茶酸及部分长链烷烃的趋化性明显减弱;mcp04325基因缺失使菌株对荧蒽和芘的趋化性略微减弱,mcp00975和mcp04325的缺失使菌株对萘和菲的趋化性减弱。进一步通过构建双/三突变株,检测趋化表型,发现三突变株对原儿茶酸的趋化性影响最大,趋化性减弱率最高。比较而言,在这三个基因中mcp04325基因缺失对原儿茶酸趋化性影响最大,但对Mcp04325蛋白进行外源表达纯化,通过ITC未能检测到Mcp04325蛋白与原儿茶酸之间有明显的结合能力,推测mcp04325基因可以介导趋化性,但是不具有与原儿茶酸分子结合能力,其确切机制还有待于进一步研究。

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摘要

ABSTRACT

缩略语对照表

第一章绪论

1.1 石油烃污染物及其治理

1.1.1 石油烃的危害及组分

1.1.2 石油烃污染物的治理技术

1.2 石油烃污染物微生物降解概述

1.2.1 石油烃降解微生物

1.2.2 石油烃降解酶

1.2.3 提高石油烃污染物降解的措施

1.3 趋化性在石油烃污染物降解过程中的作用

1.3.1 细菌趋化性概述

1.3.2 甲基受体趋化蛋白在趋化过程中的作用

1.4 本文研究内容及意义

第二章实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验所用菌株、质粒及引物

2.1.2 实验所用试剂

2.1.3 实验所用仪器

2.1.4 培养基及抗生素的配制

2.2 基础实验方法

2.2.1 感受态细胞的制备

2.2.2 质粒DNA的小量提取

2.2.3 目的片段的PCR及纯化回收

2.2.4 酶切和连接

2.2.5 化学转化

2.2.6 突变株的构建

2.2.7 RNA的提取、纯化及浓度测定

2.2.8 RNA反转录

2.2.9 实时荧光定量PCR

2.2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

2.3 烷烃降解酶基因功能初探

2.3.1 DN1对原油的降解

2.3.2 DN1对不同正构烷烃生物降解性能分析实验

2.3.3 原油中烷烃降解谱的测定

2.3.4 烷烃含量的测定

2.3.5 烷烃降解相关基因的预测

2.3.6 RT-qPCR分析烷烃降解酶基因的实时表达

2.3.7 烷烃羟化酶突变株的构建

2.3.8 DN1和突变株对烷烃的生物降解

2.4 趋化性在烃类污染物降解过程的作用探索

2.4.1 铜绿假单胞菌趋化系统的比较分析

2.4.2 甲基受体趋化蛋白（MCP）的结构预测及分析

2.4.3 MCP基因缺失突变株的构建

2.4.4 滴定法（Drop assay）

2.4.5 游动平板法（Swarm plate assay）

2.4.6 甲基受体趋化蛋白的体外表达及纯化

2.4.7 等温滴定热量法（Isothermal Titration Calorimetry,ITC）实验

第三章结果与讨论

3.1 铜绿假单胞菌DN1参与烃类污染物降解的比较基因组学分析

3.1.1 铜绿假单胞菌属烷烃单加氧酶alk B基因簇分析

3.1.2 铜绿假单胞菌属环羟基化双加氧酶比较分析

3.1.3 铜绿假单胞菌属趋化系统分析

3.2 DN1对烷烃的降解及烷烃羟化酶基因功能分析

3.2.1 菌株DN1对原油的降解

3.2.2 菌株DN1对不同正构烷烃的生物降解

3.2.3 DN1中烷烃羟化酶编码基因分析

1,alkB₂,p450,almA₁和almA₂的实时表达'> 3.2.4 不同烷烃诱导下alk₁,alkB₂,p450,almA₁和almA₂的实时表达

3.2.5 烷烃羟化酶系统在烷烃降解中的作用

3.3 菌株DN1及部分MCP突变株的趋化性研究

3.3.1 菌株DN1的趋化性

3.3.2 部分mcp突变株对烃类污染物的趋化性

3.3.3 甲基受体趋化蛋白mcp04325基因外源表达

3.3.4 ITC分析Mcp04325蛋白与原儿茶酸的结合能力

第四章结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间取得的科研成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李艳鹏

导师: 马艳玲

关键词: 铜绿假单胞菌株,烃类污染物,烷烃羟化酶,趋化性,甲基受体趋化蛋白

来源: 西北大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用

单位: 西北大学

分类号: X172

DOI: 10.27405/d.cnki.gxbdu.2019.000045

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铜绿假单胞菌DN1参与石油烃降解基因功能及趋化性研究

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