论文摘要
昆虫E93转录因子是蜕皮激素下游的初级应答因子之一,在昆虫由蛹向成虫变态发育期间发挥着重要作用。E93既参与调控昆虫变态期间幼虫组织的细胞程序性死亡,同时也调控成虫组织器官的形成。但目前有关E93调控成虫组织器官形成的分子机制的研究还很少。E93最早在果蝇中被鉴定到,其在预蛹期和蛹期特异性表达;在蛹变态期,果蝇幼虫器官如唾液腺和中肠等发生凋亡,而翅原基却经历剧烈的形态变化过程最终发育为成虫的翅。基于蛹期翅的剧烈变态发育及成虫翅表型易于观察等优点,翅常作为研究器官发育的理想模型。在本研究中,我们以果蝇为模式生物探究了E93转录因子调控翅发育的分子机制。采用Gal4/UAS系统对果蝇E93基因进行翅特异性RNAi后观察表型,利用ChIP-seq数据分析筛选E93下游的潜在作用靶标,并通过在细胞及组织水平的分子生物学检测和个体水平的表型观察,最终解析了E93转录因子调控果蝇翅发育的分子机制。取得的主要研究结果如下:1.果蝇E93基因的翅特异RNAi对翅发育的影响为了探究果蝇翅中E93的表达对翅发育的影响,我们采用Gal4/UAS系统对果蝇E93基因进行翅特异性RNAi。本实验中共选用了4种果蝇翅特异性Gal4品系（nubbin-Gal4、MS1096-Gal4、ptc-Gal4和en-Gal4）和2种E93基因RNAi品系（V104390和#57868）。首先,利用Gal4/UAS系统检测了4种翅特异性Gal4在翅中的表达模式。通过将翅特异性Gal4品系的处女蝇分别与表达红色荧光蛋白的UAS-Cherry品系的雄蝇杂交,取其子代翅原基检测红色荧光蛋白的表达部位。结果显示,nubbin-Gal4驱动红色荧光蛋白在整个翅囊区表达;MS1096-Gal4驱动红色荧光蛋白在背区（D区）的翅囊区表达;en-Gal4和ptc-Gal4分别驱动红色荧光蛋白在翅原基后区（P区）和前区/后区（A/P）分界处表达。我们选取表达范围最广的nubbin-Gal4分别与果蝇E93基因的两种RNAi品系（V104390和#57868）及相应的对照品系进行杂交,并取其子代翅原基通过RT-PCR和qRT-PCR检测E93基因的表达。结果显示,与对照组相比,E93基因的翅特异性RNAi导致翅中E93的表达水平显著降低。表型观察和统计结果显示,果蝇E93基因的翅特异性RNAi引起成虫翅变小和翅脉发育异常,两组中E93基因RNAi后的翅面积分别减少了76.2%和82%。另外,我们利用MS1096-Gal4、ptc-Gal4和en-Gal4这三种翅特异性Gal4分别与E93基因RNAi品系V104390进行杂交,其子代同样表现出了翅变小和翅脉缺陷的表型。以上结果表明,E93在果蝇翅发育过程中发挥着极为重要的调控作用。2.基于ChIP-Seq数据筛选果蝇E93的潜在靶基因为了解析E93调控果蝇翅发育的分子机制,我们对果蝇E93在翅中的ChIP-seq数据进行了分析,以筛选E93的潜在靶基因。全基因组定位分析显示,28.51%的E93 ChIP峰位于基因启动子区（定义为转录起始位点上游2000bp的区域）,共对应1868个基因;43.96%的E93 ChIP峰位于内含子区;13.65%的E93 ChIP峰位于基因间区。鉴于转录因子常通过与靶基因启动子区的关键DNA基序结合发挥其转录调控作用,我们重点关注了启动子区分布有E93 ChIP峰的1868个基因。GO功能注释显示,1868个基因中的513个基因富集于翅原基-翅变态这一生物学进程。进一步基于果蝇翅在蛹变态发育期的转录组数据,分析了这513个基因在化蛹后6 h、18h、24 h、36 h和44 h共五个时间点的翅中的协同表达变化。根据其不同的表达模式,共聚类为8个簇,其中E93基因位于簇2中,其表达变化趋势为在预蛹期开始逐渐上调表达,直至化蛹后24 h表达水平达到最高,而后表达又逐渐降低;513个基因中共有60个基因在蛹期具有和E93类似的表达模式。进一步对这60个基因进行KEGG通路富集分析,4条与翅发育相关的信号通路被富集,分别为:Dpp、MAPK、Notch和Hippo信号通路;4条信号通路中共富集到Dpp、Tkv、Sog、Nej、Numb、Ser、Wts、Baz、Kibra、Cka、Cic、Ttk共12个基因。3.果蝇E93调控翅发育的分子机制在基于ChIP-Seq数据筛选得到的果蝇E93的潜在靶基因中,我们注意到编码Dpp信号通路配体的Dpp基因被富集且在蛹期的表达变化与E93类似,鉴于Dpp信号通路在果蝇翅发育过程中的重要作用已有广泛报道,我们选择了Dpp基因作为E93的潜在靶基因进行了深入探究。通过果蝇基因组数据库FlyBase检索发现,果蝇Dpp基因共有4种亚型,分别为Dpp-RA、Dpp-RB、Dpp-RC和Dpp-RE。这4种亚型具有不同的启动子区,但经剪切加工后编码相同的蛋白产物。ChIP-Seq数据显示,在Dpp基因启动子区共存在6个E93 ChIP峰。Dpp-RA和Dpp-RB的启动子区各有两个峰,根据其距离转录起始位点的远近分别命名为Dpp-RA-D（D,远端）和Dpp-RA-P（P,近端）、Dpp-RB-D和Dpp-RB-P;在Dpp-RC和Dpp-RE的启动子区各有一个E93 ChIP峰。果蝇S2细胞中的ChIP-PCR实验结果表明,E93与Dpp启动子区的6个ChIP峰均能直接结合。我们利用荧光素酶报告基因实验分析了果蝇E93对Dpp启动子活性的调控作用。结果显示,E93过表达显著上调了Dpp-RA和Dpp-RC亚型启动子的活性,但对Dpp-RB和Dpp-RE亚型的启动子活性无显著影响。我们随后检测了E93对Dpp-RA和Dpp-RC亚型不同截短形式的启动子活性的影响,结果显示,E93过表达同样可诱导只含有近端ChIP峰的Dpp-RA启动子（Dpp-RA-P）的活性;但将Dpp-RA和Dpp-RC亚型启动子上的ChIP峰区域全部截除后,E93过表达对其启动子活性不再有显著影响。以上结果表明,E93可以与Dpp启动子直接结合并激活其启动子活性。我们进一步分析了果蝇E93基因的表达改变对Dpp信号通路基因转录的影响。qRT-PCR结果显示,nubbin-Gal4驱动的E93基因翅特异性RNAi导致翅中Dpp信号通路关键基因Dpp、Tkv和Mad的表达下调;在果蝇S2细胞中过表达E93则显著上调了Dpp、Tkv和Mad的表达。另外,免疫荧光结果显示,果蝇E93基因的翅特异性RNAi抑制了蛹期翅中Dpp的表达,并抑制了其对下游Mad的磷酸化和激活作用。我们还探究了Dpp信号通路基因表达改变对果蝇翅发育的影响。用果蝇翅特异的UAS-dicr2;nubbin-Gal4品系分别与Dpp、Tkv、Mad这三个Dpp信号通路关键基因的RNAi品系杂交,观察子代表型。与野生型果蝇的翅相比,对Dpp、Tkv、Mad基因的翅特异性RNAi均导致成虫翅显著减小和翅脉的缺失,这与E93基因翅特异性RNAi所导致的表型类似。综合分析表明,果蝇E93通过直接正调控Dpp信号通路关键基因影响了翅的发育。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 王伟娜
导师: 程道军
关键词: 果蝇,翅发育,信号,转录调控
来源: 西南大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 西南大学
分类号: Q963
总页数: 79
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