杨炼[1]2004年在《HBV感染对人T细胞免疫及免疫相关细胞因子TNF-α、TGF-β_2的影响》文中提出目的 通过检测乙型肝炎病毒（HBV）感染后外周血及感染肝组织内CD4+T和CD8+T细胞的数量及功能，以及检测HBV感染者肝组织内细胞因子TNF-α及TGF-β2表达的变化，探讨HBV对人体T细胞免疫的影响及其可能机制。方法 （1）用流式细胞仪检测36例HBV感染者和20例正常人外周血中T细胞亚群的数量。2）收集64例慢性肝病的肝脏标本，包括10例慢性乙型肝炎，37例肝硬化， 17例肝细胞癌（其中14例带有癌旁肝硬化），用免疫组化S-P法检测HBsAg和HBcAg，并以此为标准，将HBsAg和（或）HBcAg阳性的50例作为HBV感染组，而将肝组织HBsAg和HBcAg及血清病原学检查均为阴性的10例作为非HBV感染组（HBV阴性组）。检测其中CD4、CD8、CD25和细胞因子TNF-α、TGF-β2 的表达情况，并作相应比较。结果 （1）HBV感染组外周血T细胞亚群测定值中，CD4+T细胞和CD4+T/CD8+T比值明显低于对照组（ Pb<0.05）；CD8+T细胞升高，明显高于对照组（ Pb<0.05）；2）肝组织内浸润的淋巴细胞主要聚集在汇管区和小叶坏死区，免疫组化结果显示HBV感染组肝组织内的 CD8+T
杨炼, 管小琴, 肖明[2]2005年在《HBV感染对人T细胞免疫及细胞因子TNF-α、GF-β_2的影响》文中研究说明目的:检测HBV感染后外周血及感染肝组织内CD4+T 和CD8+T细胞的数量及功能,以及肝组织内TNF-α及TGF-β2表达,探讨HBV对人体T细胞免疫的影响及其可能机制. 方法:用流式细胞仪检测HBV感染者36例和正常人20 例外周血中T细胞亚群的数量.用免疫组化法HBV感染肝组织50例中CD4,CD8,CD25和TNF-α,TGF-β2 的表达,并作相应比较. 结果:HBV感染组外周血,CD4+和CD4+/CD8+比值明显低于对照组(P<0.05);CD8+细胞升高,明显高于对照组(P<0.05).肝组织内浸润的淋巴细胞主要聚集在汇管区和小叶坏死区,免疫组化结果显示HBV感染组肝组织内的CD8+和CD4+细胞数量多于非HBV感染组(P<0.01).HBV感染组肝组织内CD25+细胞数量减少,但统计学上无显着意义.HBV感染组肝组织TNF-α表达明显增强,与非HBV感染组相比有显着差异(P<0.05);而TGF-β2在HBV感染组肝组织的表达与非HBV感染组相比无显着差异.TGF-β2及TNF-α在肝硬化、癌旁肝硬化、肝细胞癌中均较强表达,且与慢性乙肝组和正常对照组比较有非常显着差异(P<0.01). 结论:HBV感染者外周血和肝内的T细胞亚群紊乱, 活性下降,功能受损.TNF-α表达与HBV感染和免疫损伤密切相关,而HBV对TGF-β2的影响微弱.
万裴琦[3]2014年在《TGF-β1基因多态性及表达水平与广西人群肝癌家族聚集性的相关研究》文中研究指明背景：肝癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，近几十年来发病率及死亡率均居高不降。全球每年原发性肝癌新发例数超过74万，居恶性肿瘤的第五位，死亡59.8万例，死亡人数仅次于胃、食道癌而居第叁位，已经严重威胁到人类的健康及寿命[1]。全球约有一半的肝癌发生在中国，其分布具有明显的地区差异性。广西是全国肝癌高发区之一，多次的流行病学调查结果显示广西肝癌发病率及死亡率均明显高于全国平均水平，并且广西肝癌的发生呈现家族聚集倾向现象，很大一部分的肝癌病例有肝癌家族史，其一级亲属、二级亲属罹患肝癌的风险性增高。大多数肝癌起病隐匿、进展快、病程短，迄今为止，没有特效的治疗手段来阻止肿瘤的进展，故有必要从内在遗传因素及外在环境暴露因素着手对原发性肝癌及其家族聚集性的发病机理进行深入的研究。国内外专家经过多年来不懈的努力，对于原发性肝癌的病因研究取得了一定成果。通过对原发性肝癌的高发地区进行调查，专家普遍认为肝癌是由于以下多种因素共同引起的：肝炎病毒慢性感染、黄曲霉毒素及化学毒物（亚硝胺、重金属等）摄入、饮用水污染、放射线接触、酒精、嗜肝寄生虫、遗传因素等，但其中生物、环境、遗传因素间错综复杂的交互作用的具体机制尚未完全清楚。导致肝癌家族聚集的原因更复杂，为数不少的研究提示乙肝病毒感染是乙肝相关性肝癌的致病因子，我们既往的研究HBV感染是我区家族聚集性肝癌高发的主要致病因子，另环境因素包括饮用水污染、黄曲霉毒素及丙肝病毒感染外，尚有遗传因素。不管生物、环境、遗传因素的具体致癌机制如何，机体都会出现免疫功能的改变，多种免疫细胞的功能和（或）细胞因子表达或表达水平异常[2-5]。体内炎症抑制因子和炎症促进因子网络平衡被打破，机体体液免疫和细胞免疫功能异常，免疫应答功能异常形成恶性循环。譬如，原发性肝细胞癌患者体内IL-1、2、12、18、TNF-a、IFN-r等Th2类促炎因子与IL-4、5、8、10等Th1类炎症抑制因子网络平衡失调，CD4+、CD8+、NK细胞、细胞毒性T细胞、巨噬细胞等专职免疫细胞功能下降或异常，致使肿瘤逃避免疫监视及免疫清除，肿瘤得以发生、进展及转移，同时也说明肝癌是很典型的炎症相关性肿瘤[6-14]。已知多种细胞因子如IL-1、IL-10、IL-12、IL-18、TGF-β1、TNF-α、NQo1、XPD、COX2等细胞因子基因及其多态性与肝癌有关。其中转化生长因子β1（TGF-β1）及其多态性在原发性肝癌发生中起到了十分重要的作用。TGF-β1是一类调节细胞增殖、分化、细胞功能作用的激素样活性多肽，对淋巴细胞、上皮细胞增殖、分化具有抑制作用，对间充质细胞增殖分裂具有促进作用，同时调节细胞外基质蛋白质的合成，在组织修复、细胞恶性突变中具有重要的作用。正常水平的TGF-β1通过抑制T淋巴细胞、B淋巴细胞活化，抑制NK细胞、细胞毒性T细胞杀伤功能而发挥适度的免疫抑制功能[13,14]。病理情况下，TGF-β1水平明显升高，破坏机体免疫监督功能，使机体失去对外来病原或肿瘤细胞的正常免疫应答，导致疾病或肿瘤的发生、发展[15]。近年来，以上各种细胞因子与肝癌家族聚集的相关性也陆陆续续有报道，TGF-β1及其基因多态性在肝癌家族聚集的发生中起到的作用迄今为止尚未见有相关报道，TGF-β1蛋白质表达水平与肝癌家族聚集性的关系也尚不十分清楚。为更好地了解广西肝癌家族聚集发生的相关因素，我们从转化生长因子β1基因多态性及其蛋白表达的角度探讨肝癌家族聚集发生的原因。本研究分为两大部分。第一部分对广西11个肝癌高发区的35个肝癌高发家族的214名成员（其中壮族105人、瑶族49人、汉族60人）、37个无癌对照家族中214名成员（其中壮族105人、瑶族49人、汉族60人）进行转化生长因子6个位点基因多态性的分析，获得研究组与对照组6个位点基因型分布频率的遗传学数据，并重点探讨在吸烟、饮酒、饮用水及HBV-DNA阳性等外暴露因素共同作用下，TGF-β1基因多态性与原发性肝癌家族聚集性的关系。第二部分研究分两小部分：第一小部分是用免疫酶联吸附法检测全部428例样本的血清TGF-β1水平，比较肝癌高发家族与无癌对照家族血清TGF-β1水平差异、比较肝癌风险位点各基因型对应的血清TGF-β1水平差异，按血缘关系分层分析血清TGF-β1水平差异。第二小部分是用免疫蛋白印迹法检测82例（包括11名先证者及其配对、10名随机抽取的肝癌高发家族Ⅰ级亲属及其配对、10名随机抽取的肝癌高发家族Ⅱ级亲属及其配对、10名随机抽取的肝癌高发家族Ⅲ级亲属及其配对）研究对象全血TGF-β1蛋白表达情况，比较肝癌高发家族与无癌对照家族全血TGF-β1蛋白灰度值差异，按血缘关系分层分析全血TGF-β1蛋白灰度值差异。从细胞因子TGF-β1表达水平角度探讨其与原发性肝癌家族聚集性的关系。第一部分TGF-β1基因多态性等因素与中国广西人群肝癌家族聚集的相关性研究目的：探讨TGF-β1（转化生长因子β1）基因多态性及外暴露因素与广西壮、汉、瑶族肝癌家族聚集发生的关系。方法：在广西11个肝癌高发区收集到符合条件的肝癌高发家族35个，共214名成员，无癌对照家族37个，以相同年龄（±5岁）、乙肝表面抗原（HBsAg）、民族、居住地、性别为配对条件，选取无癌家族成员214名作为无癌对照家族组。研究对象的基本信息及肝癌相关风险因素采用流行病学调查表采集。采集所有研究对象的空腹外周静脉血抗凝标本5毫升，用于提取全血基因组DNA，采集非抗凝血5毫升（乙二胺四乙酸抗凝）分离出血清用于检测HBV、HCV病毒标志物、TGF-β1水平。以上所提取的DNA样品，经引物特异性PCR方法扩增TGF-β1rs1800469、rs2241715、rs2241716、rs11466345、rs8105161、rs747857共6个位点，采用Snapshop方法进行基因分型检测。应用Haploview软件进行哈-温（Hardy-Weinberg）遗传平衡检测，SHEsis软件进行连锁不平衡检验及单倍型频率分析统计。经SPSS17.0统计软件进行数据录入及统计分析，采用卡方检验和条件Logistic回归模型分析TGF-β1SNP位点与肝癌家族聚集性的关系，选取有统计学意义的位点及环境因素，采用叉生分析法进行基因-环境交互作用分析，应用SAS9.1编程假设验证。结果：（1）肝癌可能的风险因素分布：饮酒、饮用塘水、HBV-DNA阳性在肝癌高发家族与无癌对照家族中分布差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）各基因型分布的哈-温平衡检验：经Haploview软件检验，6个位点基因型频率在无癌对照家族与肝癌高发家族中分布符合遗传平衡定律，观察值与理论值符合（P＞0.05），选取样本具有群体代表性。（3）TGF-β1各位点基因型及等位基因在无癌对照家族与肝癌高发家族组的分布：1. TGF-β1rs1800469T/C位点基因型TT、CT、CC在肝癌高发家族组与无癌对照家族组中分布频率分别为47.2%、41.1%及11.7%，33.7%、45.3%及21．0%，两组间分布具有统计学差异（P=0.004）；等位基因T、C在肝癌高发家族组与无癌对照家族组中分布频率分别为：67.8%和32.2%，56.3%和43.7%，等位基因在两组间分布具有统计学差异（P=0.001）。rs1800469TT基因型及T等位基因在肝癌高发家族分布明显高于无癌对照家族（P=0.004； P=0.001）。2.TGF-β1rs2241715G/T位点基因型TT、GT、GG在肝癌高发家族组与无癌对照家族组中分布频率分别为46.7%、41.6%、11.7%与33.2%、44.9%、21．9%，两组间分布具有统计学差异（P=0.003）；等位基因T、G在肝癌高发家族组与无癌对照家族组中分布频率分别为：67.5%和32.5%，55.6%和44.4%，等位基因在两组间分布具有统计学差异（P=0.000）。rs2241715TT基因型及T等位基因在肝癌高发家族分布明显高于无癌对照家族（P=0.004； P=0.000）。3. TGF-β1rs8105161C/T位点基因型TT、CT、CC在肝癌高发家族组与无癌对照家族组中分布频率分别为29.4%、51.9%、18.7%与42.5%、45.8%、11．7%，两组间分布具有统计学差异（P=0.009）；等位基因T、C在肝癌高发家族组与无癌对照家族组中分布频率分别为：55.4%和44.6%，65.4%和34.6%，等位基因在两组间分布具有统计学差异（P=0.003）。rs8105161TT基因型及T等位基因在无癌对照家族分布明显高于肝癌高发家族（P=0.005；P=0.003）。4.TGF-β1rs747857A/G位点基因型AA、AG、GG在肝癌高发家族组与无癌对照家族组中分布频率分别为82.7%、15.0%及2.3%，90.7%、9.3%及0%，两组间分布具有统计学差异（P=0.005）；等位基因G、A在肝癌高发家族组与无癌对照家族组中分布频率分别为：90.2%和9.8%，95.3%和4.7%，等位基因在两组间分布具有统计学差异（P=0.004）。rs747857GG基因型及G等位基因在无癌对照家族分布明显高于肝癌高发家族（P=0.005；P=0.003）5.TGF-β1rs2241716C/T位点基因型及等位基因在肝癌高发家族组与无癌对照家族组中分布频率无统计学差异（P=0.105；P=0.160）。6.TGF-β1rs11466345T/C位点基因型在肝癌高发家族组与无癌对照家族组中分布频率无统计学差异（P=0.161）；等位基因T、C在两组间分布具有统计学差异（P=0.049）。（4）TGF-β1多态性位点连锁不平衡分析：rs2241715、 rs2241716、rs1800469叁个位点间存在强连锁不平衡。 TGF-β1rs1800469与TGF-β1rs2241715间D‘=1，r2=0.984,与TGF-β1rs2241716间D‘=1，r2=0.547。TGF-β1rs2241715与TGF-β1rs2241716也存在强LD，D‘=1，r2=0.538。（5）环境与遗传的多因素条件Logistic回归分析：将rs1800469、rs2241715、rs8105161、rs747857连同肝癌可能的相关危险因素吸烟、饮酒、饮用水、HBV-DNA带入Logistic回归模型分析（因所有研究对象均以大米为主食、抗HCV均阴性，故该两项因素未列入模型），最终进入模型的危险因素由高到低为：饮用塘水＞饮酒＞HBV-DNA阳性＞rs1800469TT基因型＞rs2241715TT基因型。（6）环境与遗传的多因素条件Logistic回归分析： rs1800469、rs2241715、rs8105161、rs747857、rs2241716、rs11466345连同肝癌可能的相关危险因素吸烟、饮酒、饮用水、HBV-DNA带入Logistic回归模型分析（因所有研究对象均以大米为主食、抗HCV均阴性，故该两项因素未列入模型），最终进入模型的危险因素由高到低为：饮用塘水＞饮酒＞HBV-DNA阳性＞rs1800469TT基因型＞rs2241715TT基因型。（7）风险基因型的分层分析：rs1800469TT基因型及T等位基、rs2241715TT基因型及T等位基因在各级血缘亲属中总体分布无统计学差异（P=0.416,P=0.185）；(P=0.348,P=0.133），但二者分布频率随着与先证者血缘级别降低而降低。（8）基因-环境交互作用分析：基于相加模型的TGF-β1rs1800469TT与饮用塘水存在正交互作用（OR=6.44，S=1.50，AP=0.28,P＜0.05）,经相加模型的叉生分析假设检验U=0．394，P＜0．05，具有统计学意义；TGF-β1rs1800469TT与饮酒交互作用也有统计学意义（OR=3.45，S=1.29，AP=0.16,P＜0.05），假设检验U=0．432， P＜0.05具有统计学意义；TGF-β1rs1800469TT与HBV-DNA相加交互作用同样也有统计学意义（OR=5.38，S=4.13，AP=0.62,P＜0.05），假设检验U=1．105，P＜0.05）。结论：（1）TGF-β1rs1800469T/C基因多态性可能是广西肝癌家族聚集发生的遗传因素。（2）TGF-β1rs2241715G/T基因多态性可能是广西肝癌家族聚集发生的遗传因素。（3）饮用塘水、饮酒、HBV-DNA阳性可能是广西肝癌家族聚集发生的主要环境因素。（4）广西肝癌家族聚集现象的发生是综合因素所致，多种遗传因素之间、多种环境因素之间或遗传与环境因素之间有相互协同作用。第二部分TGF-β1基因表达与中国广西人群肝癌家族聚集的相关性目的：探讨转化生长因子β1血清中表达水平、全血中蛋白表达情况与广西人群肝癌家族聚集的相关性。方法：在广西11个肝癌高发区收集到符合条件的肝癌高发家族35个，共214名成员，无癌对照家族37个，以相同年龄（±5岁）、乙肝表面抗原（HBsAg）、民族、居住地、性别为配对条件，选取无癌家族成员214名作为无癌对照家族组。本研究分两小部分：第一小部分是用免疫酶联吸附法检测全部428例样本的血清TGF-β1水平，比较肝癌高发家族组（FHCC）与无癌对照家族组（FNC）血清TGF-β1水平差异、比较肝癌家族聚集性风险位点各基因型间的血清TGF-β1表达水平差异、按血缘关系分层分析血清TGF-β1水平差异。第二小部分是用免疫蛋白印迹法（Western blot）检测82例（包括11名先证者及其配对、10名随机抽取的肝癌高发家族Ⅰ级亲属及其配对、10名随机抽取的肝癌高发家族Ⅱ级亲属及其配对、10名随机抽取的肝癌高发家族Ⅲ级亲属及其配对）研究对象全血TGF-β1蛋白表达情况（包括蛋白表达的量、蛋白结构），比较肝癌高发家族与无癌对照家族全血TGF-β1蛋白灰度值差异，按血缘关系分层分析全血TGF-β1蛋白灰度值差异。探讨其与肝癌家族聚集性是否相关。采用SPSS17.0软件进行数据分析，指标以均数±标准差(x±S)表示。两组间比较采用配对样本t检验，多组间比较采用多独立样本Kruskal-Wallis检验，以P＜0.05为有统计学意义，检验水准α=0.05。结果：1血清TGF-β1水平结果（1）血清TGF-β1水平在肝癌高发家族组TGF-β1水平明显高于无癌对照家族组（28.495±17.495ng/mlVS20.24±7.56ng/ml，P=0.000）。（2）按基因型分析TGF-β1水平：Rs2241715TT基因型对应的血TGF-β1水平明显高于GT型（30.33±15.66ng/mlVS23.55±11.45ng/ml，P=0.000）及GG型（30.33±15.66ng/mlVS20±10ng/ml，P=0.000）。而GT与GG基因型对应的血TGF-β1水平无差异（23.55±11.45ng/mlVS20±10ng/ml，P=0.061）。Rs1800469TT基因型对应的血TGF-β1水平明显高于CT基因型（39.445±7.445ng/mlVS26.33±13.65ng/ml，P=0.000）及CC基因型（39.445±7.445ng/mlVS26.245±13.555ng/ml，P=0.000）。CT及CC基因型对应的血清TGF-β1水平无差异（26.33±13.65ng/mlVS26.245±13.555，P=0.347）。（3）风险位点基因型对应的血清TGF-β1在肝癌高发家族组无癌对照家族组的比较：肝癌高发家族组TT基因型对应的血清TGF-β1水平明显高于无癌对照家族组rs1800469TT基因型（43.395±3.495ng/mlVS35.95±3.95ng/ml，P=0.000）。肝癌高发组rs2241715TT基因型对应的血TGF-β1水平明显高于无癌对照家族组（18.815±4.145ng/mlVS38.995±6.995ng/ml，P=0.000）。2. Western blot检测结果（1）肝癌高发家族组与无癌对照家族组均表达TGF-β1蛋白且未发现异常条带，但表达程度有明显不同。（2）肝癌高发家族组血浆TGF-β1蛋白含量比无癌对照家族组多，差异有统计学意义（p＜0.05）。（3）分层分析：血浆TGF-β1蛋白含量在肝癌高发家族先证者、Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级亲属中无差异（p＞0.05）。先证者血浆TGF-β1蛋白灰度值很高，但随着与先证者血缘关系的变远，TGF-β1蛋白灰度值减少。结论：（1）血清高TGF-β1水平可能与肝癌家族聚集性相关。（2）全血高TGF-β1蛋白水平可能与肝癌家族聚集性相关。（3）血清高TGF-β1水平或全血TGF-β1蛋白高表达可能与机体免疫抑制状态有关，尚待进一步验证T细胞、B细胞功能。
李红[4]2006年在《肠源性内毒素血症对慢性肝炎患者免疫功能的影响及其机制的探讨》文中进行了进一步梳理目前,越来越多的资料揭示了宿主免疫系统在慢性乙型肝炎病毒(Hepatic B virus,HBV)感染中的重要作用。疾病发展和转归的主要因素在于宿主的免疫功能,肠源性内毒素血症(intestinal endotoxemia,IETM)为其主要的影响因素之一。我所诸多动物实验和临床研究发现,急慢性肝炎、肝硬化动物和患者所伴之IETM与肝脏免疫功能密切相关。然而,具体机制仍有待进一步研究。本论文共分叁个部分。第一部分:IETM阳性与阴性对慢性肝炎患者免疫功能的影响;第二部分:IETM相伴之高组胺血症的发生机制及其对免疫功能的影响;第叁部分:IETM对细胞免疫功能的影响。第一部分:探讨IETM阳性与阴性对慢性肝炎患者免疫功能的影响。实验一、二:选取慢性乙肝患者80例,根据测定的血浆内毒素水平,将其分为内毒素(ET)阳性组和阴性组,分别检测血清白细胞介素10、12(IL-10、IL-12)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)浓度。并结合乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)、血清谷丙转氨酶(ALT)以及总胆红素(TBIL)进行分析研究。结果显示,1.肝炎患者(total patients)的各项指标均有不同程度异常。在慢性肝炎患者中,内毒素血症的发生率为41/80(51.25%),内毒素阳性组(ET positive)与阴性组(ET negative)比较,ALT、TBIL、IL-4、IL-10水平均显着升高,而IL-12水平和Th1/Th2比值明显降低。2.HBeAg阳性组IL-4与IL-10水平明显高于阴性组,而IL-12和IFN-γ水平明显低于阴性组。HBVDNA阳性组ET、IL-4与IL-10水平明显高于阴性组,而IL-12水平明显低于阴性组,提示HBeAg阳性与HBVDNA阳性也与IETM有关。3.乙肝患者内毒素水平分别与IL-4、IL-10水平呈显着正相关,与IL-12水平呈明显负相关。在内毒素阳性组患者,内毒素水平分别与IL-4、IL-10水平呈显着正相关,与IL-12、Th1/Th2比值呈负相关,而在阴性组则无此相关性。结果提示:IETM是引起Th1/Th2比值下降的原因之一。IETM可以引起IL-12水平降低即Th1降低,IL-4、IL-10水平升高即Th2升高而导致Th1/Th2失衡,病毒难以清除导致乙肝慢性化。实验叁:连续收集31例患者,根据临床分型:慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC)15例,丙肝后肝硬化(HCV-related liver cirrhosis,CLC)10例,丙肝相关性肝癌(HCV-related hepatocellular carcinoma,HCC)6例,选取18例健康体检人群为正常对照,采血检测血浆内毒素(ET)、血清谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、血清白细胞介素10、12(IL-10、
李凤芬[5]2013年在《乙型肝炎病毒感染与TGF-β1和TNF-α的相关性研究》文中指出目的:探讨HBV感染与TGF-β1和TNF-α的相关性。方法:酶联免疫吸附法(ELISA)检测慢性乙型肝炎患者血清TGF-β1和TNF-α水平;免疫组化法检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、TGF-β1和TNF-α的表达。结果:HBV感染者血清TGF-β1和TNF-α明显高于对照组,差异有统计学意义。肝组织TGF-β1和TNF-α表达明显增强,与非HBV感染组相比,差异有统计学意义。结论:HBV感染与TGF-β1和TNF-α水平密切相关,可以作为诊断和治疗的一个判断指标。
张玉卓[6]2012年在《TIPE2和FOXP3 mRNA在原发性肝癌患者PBMCs及肝组织中的表达及临床意义的初步探讨》文中提出目的TIPE2（Tumor necrosis factor-alpha-induced protein-8like-2,TNFAIP8L2）是由美国宾夕法尼亚大学Youhai H. chen教授在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中首先发现的新基因，其与肿瘤坏死因子诱导蛋白-8（tumor necrosis factor-α-induced protein-8，TNFAIP8）高度同源，负性调节特异性免疫和固有免疫，是体内调节免疫动态平衡的重要基因之一。敲除TIPE2基因的鼠(TIPE2-/-)可表现为多器官的炎症，脾脏肿大和过早的死亡。TIPE2包含一个类似死亡效应结构域(death effect domain，DED)样蛋白区域，可与caspase-8蛋白结合，从而影响TNFα介导的凋亡，在肿瘤的发生中发挥重要作用。先前研究表明TIPE2不仅高表达于免疫细胞和免疫组织，如淋巴结、淋巴细胞和单核细胞等，也表达于其他非免疫细胞，如，腺上皮细胞、分层或假复层上皮细胞及肝细胞、神经元细胞、软骨细胞。而且对人TIPE2特性的研究表明TIPE2可能参与了很多疾病的发生发展，但具体机制尚不清楚。最近Luan等应用蛋白印迹法（Westernblot）和RT-PCR检测发现，从BALB/C小鼠脾脏分离提取的CD4+CD25+Treg细胞（简称Treg细胞）中可检测到TIPE2表达，并可增强Treg细胞免疫抑制功能，提示TIPE2基因可能与Treg细胞介导的免疫调控有关，具体机制尚不清楚。Treg细胞是一群具有免疫抑制功能的T细胞亚群，在感染、肿瘤和移植中发挥重要作用。据报道，Treg细胞可分泌免疫抑制因子从而直接抑制效应性T细胞功能。在很多肿瘤疾病中，Treg细胞的广泛浸润提示预后差、生存率低。研究发现Treg细胞缺失或功能抑制可有效提高机体肿瘤免疫。人FOXP3基因是转录因子forkhead/winged-helix家族成员之一，已被广泛认可是Treg细胞的特异性标记物，是调控Treg细胞发育、分化及成熟的关键转录因子。FOXP3不仅表达于T细胞系，很多肿瘤细胞也均组成性表达（黑色素瘤、神经胶质瘤等）FOXP3，提示FOXP3赋予肿瘤细胞免疫逃逸机能。鉴于免疫系统内TIPE2基因的正常表达可以有效的防止机体过度反应和维持免疫稳态，我们推测TIPE2基因和FOXP3在PLC发病机制中具有某种关系。原发性肝癌(Primary Liver Cancer, PLC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病隐匿，进展迅速，预后差，死亡率位居第叁，近年来其发病率呈上升趋势，严重危害人类健康，攻克癌症已成为世界性的难题。肿瘤的发生是细胞的恶性增殖与细胞凋亡之间平衡失调的结果，同时机体炎症免疫微环境在肿瘤形成和发展中具有重要调控作用，而机体免疫功能低下及免疫监视功能降低是肿瘤形成和发展的关键。因此，本课题的主要目的是通过检测TIPE2及FOXP3mRNA在PLC患者PBMCs及肝癌组织中的表达情况，一方面了解PLC患者PBMCs及肝癌组织中TIPE2表达情况，另一方面探讨TIPE2和FOXP3在PLC发病机制及进展中的作用，为进一步阐明TIPE2在PLC发生和发展中的调控作用奠定基础。方法1病例收集：参照2009年最新《原发性肝癌规范化诊治专家共识》，选择2010-3/2012-2河北医科大学第叁医院中西医结合肝病科40例PLC患者和肝胆外科20例PLC肝移植术患者，共60例，同时排除应用免疫药物治疗的患者。男43例，女17例，年龄54.83±13.58岁，均合并肝硬化，其中HBV感染者30例，HCV感染者8例，酒精性肝病5例,不明原因者17例。同期选择健康对照组30人，男13例，女17例，年龄39.23±11.53岁。40例PLC患者及健康对照者均清晨空腹抽取抗凝静脉血6ml，其中3ml用于分离PBMCs，3ml用于流式技术检测；抽取不抗凝静脉血5ml，分离血清备用。收集20例住院PLC患者肝移植术后新鲜的组织标本，分别留取肝癌组织及距癌组织3-5cm的癌旁组织各20份，高分化8例，中分化7例，低分化5例。取部分肝癌组织应用RT-PCR法检测TIPE2和FOXP3mRNA的表达，其余置于-80℃备用。2PLC患者PBMCs中TIPE2和FOXP3基因表达的检测：分别收集40例PLC患者及健康对照者新鲜外周肝素抗凝血3ml，Ficoll密度梯度离心法分离PBMCs，应用Trizol一步法提取PBMCs中的总RNA，应用半定量RT-PCR检测，了解TIPE2mRNA和FOXP3mRNA的表达情况，并比较各组的差异。3PLC患者肝组织中TIPE2和FOXP3基因表达的检测：收集20例PLC患者肝移植术后的肝癌组织和癌旁组织标本各20份，Trizol一步法抽提肝组织总RNA，半定量RT-PCR法分别检测肝组织TIPE2mRNA和FOXP3mRNA表达情况，并比较各组的差异。4外周血T淋巴细胞亚群检测：收集40例PLC患者及健康对照者抗凝的静脉全血3ml，应用流式细胞技术检测外周血T细胞亚群的表达5TIPE2mRNA与PLC患者临床参数以及FOXP3的相关性分析利用SPSS13.0软件对PLC患者PBMCs及肝癌组织中TIPE2的mRNA与FOXP3的mRNA水平进行相关性检验，了解两者之间的相关关系。并对PLC患者TIPE2的mRNA水平与PLC临床参数—血清AFP水平、AST/ALT、T淋巴细胞亚群及肿瘤组织分化程度的相关性进行分析。结果1PLC患者和健康对照者临床资料及实验室各指标的汇总分析见Table1。2TIPE2mRNA在PLC患者PBMCs及肝组织中的表达结果显示，PLC患者PBMCs中TIPE2mRNA阳性检测率（75%）明显低于健康对照组PBMCs中TIPE2mRNA的阳性检测率（100%），两组有显着统计学差异（P=0.003）；RT-PCR半定量分析结果显示：PLC患者PBMCs中TIPE2mRNA水平较健康对照组明显降低[0.33(0.39) vs1.16(0.45)]，二组比较差异有统计学意义(P<0.05)。肝癌组织及癌旁组织TIPE2mRNA阳性检测率均为75%，两组无统计学差异（P>0.05）。RT-PCR半定量分析结果显示PLC患者肝癌组织中TIPE2水平较癌旁组织下降（0.25±0.19vs0.26±0.20），但结果无统计学差异（P>0.05）。3FOXP3mRNA在PLC患者PBMCs及肝组织中的表达结果显示，PLC患者PBMCs中FOXP3mRNA阳性检出率（92.5%）明显高于健康对照者PBMCs中FOXP3mRNA的检测率46.67%，两组阳性率有显着差异（P<0.001）。RT-PCR半定量分析结果显示：PLC患者PBMCs中FOXP3水平较健康对照组明显升高[5.17(3.13) vs1.10(2.92)]，二者比较差异有统计学意义(P<0.001)。肝癌组织及癌旁组织FOXP3mRNA阳性检出率均为85%，结果无统计学差异（P>0.05）。RT-PCR半定量分析结果显示PLC患者肝癌组织中FOXP3水平较癌旁组织显着升高（3.72±2.03vs2.54±1.58），二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。4TIPE2mRNA与PLC临床参数的相关性分析根据血清AFP、AST/ALT水平，将PLC患者分为AFP低水平组(AFP≤400ng/ml)和高水平组(AFP>400ng/ml)， AST/ALT低水平组（AST/ALT≤1.0）、中水平组（10.05），可能与患者例数较少有关3FOXP3mRNA在PLC患者PBMCs中的表达较健康人显着升高，在癌组织中的表达较癌旁组织显着升高4TIPE2基因可能通过负性调控免疫细胞活性及细胞凋亡，从而参与PLC的发病进程。
杨静悦[7]2007年在《腺病毒介导的基因修饰树突状细胞肝癌瘤苗的制备及其抗HBV相关肝癌的免疫实验的研究》文中提出原发性肝癌是中国和部分亚洲地区最常见的恶性肿瘤之一,流行病学资料显示乙型肝炎表面抗原阳性人群肝癌发病率是其他人群的12-300倍。我国人群HBV的携带率在10%左右,而90%的原发性肝癌患者发现HBsAg阳性。尽管目前对原发性肝癌的治疗已取得一些进展,但对于晚期患者的治疗和预防复发及转移效果仍不理想[1～3]。因此,有必要探索一种新的、有效治疗途径。随着人类肿瘤抗原以及肿瘤抗原基因的发现和确认,为肿瘤的免疫治疗尤其是主动性免疫治疗提供了新的手段。直接作用于肿瘤特异性抗原或相关抗原的治疗性瘤苗是目前研究的热点。其抗肿瘤免疫的重要目的就是诱导针对肿瘤的特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytocoxic T lymphocyte,CTL)反应,而CTL的激活依赖于抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell,APC)提供的抗原多肽和共刺激信号。在抗原提呈细胞中,尤以树突状细胞(Dendritic cell,DC)的抗原提呈功能最强,可启动并调节免疫应答,有效刺激T、B淋巴细胞活化,在抗肿瘤、抗感染、移植排斥以及自身免疫性疾病发病过程中起重要作用。目前DC在抗肿瘤免疫治疗方面的研究已经取得一些进展,并且在肿瘤的临床治疗上已显示其良好的治疗效果。但是由于大多数肿瘤来说,肿瘤组织中仅部分肿瘤细胞表达一种肿瘤相关抗原,针对单一肿瘤相关抗原的免疫应答无法清除所有肿瘤细胞。并且肿瘤细胞本身存在多种肿瘤相关抗原,针对单一抗原的免疫治疗有时并不能发挥其应有的作用,激发的免疫效应弱。故近来为使DC能够负载更多肿瘤抗原,发挥更大免疫治疗效应,人们研究了DC负载多种抗原的制备方法,包括:经照射的肿瘤细胞与DC共培养,肿瘤细胞来源的RNA转染DC,腺病毒介导多种肿瘤相关抗原感染DC以及多种肿瘤相关抗原肽冲击致敏DC等方法。在这些方法中以肿瘤细胞来源的RNA转染DC以及腺病毒介导多种肿瘤相关抗原感染DC最为有效,但肿瘤细胞来源的RNA具有生物活性不稳定等缺点。因此,在本研究中,我们根据中国人原发性肝癌独有的流行病学特点,应用HBV相关性肝癌中HBV病毒特异性抗原,联合肝癌相关抗原AFP作为免疫治疗靶点,制备AFP、HBsAg基因的腺病毒载体,体外转染人树突状细胞,比较HBsAg- DC、AFP-DC以及AFP / HBsAg-DC瘤苗体外对HBsAg表达的人肝癌细胞株的杀伤活性。探讨腺病毒介导的HBsAg、AFP基因共感染较单基因感染DC能否增强其体外诱导的特异性抗肿瘤免疫效应,以期选择更为有效的DC肝癌瘤苗,为原发性HBV感染肝癌的治疗寻求新的途径。第一部分:HBsAg、AFP基因重组腺病毒表达载体的构建及鉴定目的构建能高效转导HBsAg、AFP基因的重组腺病毒,进行病毒扩增和滴度测定,并检测HBsAg、AFP抗原表达,以用于DC基因治疗的实验研究。方法应用Adeno-XTM腺病毒表达载体系统分别构建表达AFP、HBsAg的重组腺病毒和对照载体Ad-GFP。目的基因首先克隆到pShuttle形成穿梭载体,用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切后将所获HBsAg、AFP基因片段再与线性化的腺病毒载体Adeno-X连接,形成重组腺病毒质粒,再以PacⅠ酶切线性化,转染HEK293细胞包装为重组腺病毒。检测病毒滴度后,进一步对重组腺病毒分别感染HEK293和H1299细胞的结果进行IFA法检测目的基因在靶细胞中的有效表达。结果经酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒和重组腺病毒质粒插入片段为HBsAg、AFP基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒。滴度测定结果为Ad-S 2.65×109 PFU/ml;Ad-AFP采用同样方法测定的滴度为3.16×109 PFU/ml。重组腺病毒感染H1299细胞后IFA法检测结果显示目的基因表达于感染细胞中,表明腺病毒介导的HBsAg、AFP基因感染的有效性。结论成功构建了复制缺陷型AFP、HBsAg重组腺病毒及对照重组腺病毒Ad-GFP;重组腺病毒Ad-S、Ad-AFP能高效介导基因在被感染细胞内有效表达。第二部分:树突状细胞的体外诱导及其体外感染腺病毒效率的测定目的以经动员富集的肝癌患者外周血单个核细胞(Mono nuclear cell,MNC)为来源,建立体外诱导培养DC的方法;以健康供者MNC为对照,检测肝癌DC的形态、表型及功能;利用Ad-GFP作为研究对象,测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率。方法选择肝癌患者及正常人外周血,血细胞分离机分离富集外周血MNC,经淋巴细胞分离液梯度离心、聚苯乙烯细胞培养板贴壁纯化后,加入含GM-CSF和IL-4的X-VIVO 15培养液联合诱导DC分化,诱导d6加入TNF-α促进DC成熟。分别以倒置显微镜、电子显微镜观察DC形态变化,FCM检测细胞表型变化。利用Ad-GFP作为研究对象,测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率,MTT法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。取培养第7天的DC,按不同的MOI将重组腺病毒加入培养孔中,FCM检测细胞感染前后的表型变化以及腺病毒的感染效率。结果肝癌患者DC鉴定:诱导后,患者DC显示出典型的形态及表型特征。诱导d8(加TNF-α活化48h),各抗原表达量明显升高,分别为:CD1a( 71.45士4.39)%、CD11c( 89.68士3.16)%、CD86(91.17士4.43)%、CD80 ( 91.37士4.12)%、HLA-DR( 94.03士3.01 )%,为典型DC表型;健康对照DC各抗原表达量为CD1a( 68.45士5.02)%、CD11c( 91.09士2.01)%、CD86(92.19士4.36)%、CD80 ( 90.81士3.15)%、HLA-DR( 93.49士4.18 )%,二者间无显着性差异(P>0.05 )。混合淋巴细胞反应结果显示,患者DC具有高效地刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,其刺激指数( SI)与健康对照DC的SI无显着差异(P>0.05 )。用Ad-GFP感染培养的DCs时,有较好的量效关系和时效关系。当感染增殖率(multiplicity of infection, MOI)为100时,感染24小时接近80.62%的DCs被转染。且转染后的DCs的形态与对照组相比无明显异常。当MOI为100,感染48小时后接近85.25%的DC被转染。并且DC经腺病毒感染DC 48小时后,FCM检测细胞表型为成熟DC表型特征。证明Ad-GFP能高效、安全感染培养的DC。结论以肿瘤患者经动员富集的外周血MNC为来源,联合应用GM-CSF、IL-4及TNF-α,在体外可诱导培养出具有典型形态、表型及免疫活性的DC。腺病毒介导的基因可感染人外周血MNC来源的DC可高效表达。第叁部分:重组腺病毒介导HBsAg和AFP基因修饰树突状细胞体外诱导抗HBV相关肝癌免疫实验的研究目的以腺病毒载体介导AFP基因与HBsAg基因修饰树突状细胞,使之作为抗原呈递细胞,同时呈递HBV肝癌相关抗原AFP和HBsAg,从而诱导更强的特异性CTLs,即可对恶性肿瘤细胞发挥杀伤效应,又可诱导抗HBV免疫的作用。并探讨AFP、HBsAg基因修饰树突状细胞较单基因修饰DC瘤苗作为HBV持续感染的肝癌免疫治疗是否更具优势。方法分别以Ad-S、Ad-AFP以及Ad-S和Ad-AFP转染DC,以IFA法检测叁组细胞抗原表达,以FCM检测感染后DC表型变化。以S-DC、AFP-DC与S/AFP-DC作为刺激细胞,取患者外周静脉血单个核细胞(PBMC )中非贴壁细胞(淋巴细胞,L),调整细胞密度为1×106/mL,以含1L-2,10%FCS的RPMI1640培养;将S-DC、AFP-DC与S/AFP-DC以5×104mL密度分别加入上述淋巴细胞中,共同孵育72h (设未致敏DC组和单独淋巴细胞组为对照),再次加入同剂量DC孵育72h,收获细胞分别称为S/AFP-DC-L、AFP-DC-L、S-DC-L、DC-L和L。以S/AFP-DC-L、AFP-DC-L、S-DC-L、DC-L和L作为效应细胞,肝癌细胞株HepG2.2.15,SMMC-7721和人肺腺癌H1299作为靶细胞,以不同效靶比接种于96孔板,4h后LDH法测定效应细胞对各肿瘤细胞的杀伤作用。结果IFA法检测结果显示目的基因均表达于转染的叁组细胞中。FCM结果显示共感染的DC细胞均高表达CD1a、CD11c、CD80、CD86和HLA-DR,表现为成熟DC表型特征。CTL结果显示S/AFP-DC-L、S-DC-L、AFP-DC-L组均显示对HepG2.2.15高效特异的杀伤活性,显着高于DC-L组和单纯L组,其杀伤能力与效应细胞数量成正比;在同一效靶比时S/AFP-DC-L对HepG2.2.15的杀伤率明显高于S-DC-L、AFP-DC-L组;而S-DC-L、AFP-DC-L组对HepG2.2.15的杀伤率无明显区别;S/AFP-DC-L、S-DC-L、AFP-DC-L刺激的T细胞组IFN-γ分泌显著高于DC刺激的L细胞组和L细胞组;但S/AFP-DC-L刺激组IFN-γ分泌显著高于S-DC-L、AFP-DC-L组;而S-DC-L、AFP-DC-L刺激组IFN-γ分泌无明显区别;对照组DC-L和L组IFN-γ分泌亦无明显区别。结论腺病毒介导AFP和HBsAg基因修饰DC,能够在体外诱导特异性CTL效应,对表达HBsAg的肝癌细胞有明显的杀伤作用,而且对HepG2.2.15细胞杀伤率大于单独转基因者。
朱清静[8]2006年在《丹黄方对急性肝衰竭及肝再生大鼠作用的实验研究》文中研究表明目的： (1) 探讨丹黄方对硫代乙酰胺所致急性肝衰竭大鼠肝损伤及肝再生的作用及机制。 (2) 探讨丹黄方对部分肝切除大鼠肝再生的作用及机制。 方法： (1) 113只Wistar大鼠，雄性56只，雌性57只，体重230～250g，随机分为6组：正常对照组(8只)、急性肝衰竭组(25只)、丹黄方大剂量组(20只)、丹黄方中剂量组(20只)、丹黄方小剂量组(20只)、促肝细胞生长素组(20只)。试验第2天除正常对照组皮下注射同等剂量的生理盐水外，其余各组用TAA600mg／kg~(-1)体重皮下注射造模，24h后相同剂量重复注射1次。试验开始至实验结束，正常组、急性肝衰竭模型组、促肝细胞生长素组予生理盐水5ml·kg~(-1)灌胃，丹黄方大、中、小剂量组分别给等体积／重量比的相应药物灌胃(叁组分别给予丹黄方成人等效剂量、成人等效剂量的5倍、成人等效剂量的10倍剂量进行灌胃)；除正常对照组外所有动物每日皮下注射5ml混合液(10％葡萄糖3ml、含适量生理盐水与20μmol／L KCl 2ml)以防低血糖，促肝细胞生长素组予促肝细胞生长素2mg／kg体重溶于上述防止低血糖的混合液中，每日皮下注射1次，持续3d，观察造模后48h内大鼠病死率．并于第2次注射TAA后24h后腹主动脉采血测定肝功能(ALT、AST、TB)，ABC-ELISA法检测血清TNF-α水平。迅速取肝组织，用10％甲醛液中固定，石蜡切片，检测肝组织病理变化及有丝分裂指数。用链霉菌抗生物素—过氧化酶法(SP法)检测增殖细胞核抗原、肝再生信号调节蛋白α1和白细胞分化抗原14。逆转录聚合酶链反应法检测白细胞分化抗原14mRNA的表达。 (2) 雄性Wistar大鼠24只，体重230～250g，随机分为正常组(假手术对照组)、模型组(肝切除手术组)、丹黄组和pHGF组4组，每组6只。大鼠自由喂养1周后，术前12h禁食，6h禁饮。丹黄组和pHGF组于手术前3天至实验结束，每日1次分别腹腔注射生理盐水4.0ml·kg~(-1)体重、灌胃丹黄方10g·kg~(-1)体重、和灌胃生理盐水4.0ml·kg~(-1)体重、腹腔注射pHGF1 ml／100g，假手术对照组、肝切除手术组模型组分别给予腹腔注射0.85％生理盐水1 ml／100g，同时两组分别灌胃等体积的生理盐水。按照Higgins和Panis等介绍方法无菌条件下操作。1％戊巴比妥钠(用量40mg／kg体重~(-1))皮下注入麻醉动物，固定在自制的简易手术台上，剪去上腹部鼠毛，体积分数为2％的碘酊消毒，体积分数为75％的乙醇脱碘，盖洞巾，在大鼠上腹部做一个纵形长约1cm的切口，拉出左叶和中叶，用手术线在左叶和中叶根部结扎，切除肝脏左叶和中叶(占70％)，术毕皮下给予生理盐水1ml，缝合刀口，消毒。假手术组动物仅开腹翻动肝左叶和中叶，不作肝叶切除，术后自由饮食水，所有动物无1例死亡。除正常组大鼠仅进行肝叶的牵拉，其余大鼠均进行70％肝叶切除复制模型。48h后，杀死动物，迅速取肝组织，采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA，逆转录聚合酶链反应法检测细胞癌基因fosmRNA、肝细胞生长因子mRNA、肝再生因子-1mRNA、神经生长因子诱导的抗增殖相关分泌蛋白mRNA、非受体型酪氨酸激酶mRNA和转化生长因子β1mRNA的表达。
韦嘉, 姚集鲁[9]1999年在《细胞因子网络与病毒性肝炎》文中研究表明T_H 细胞在细胞免疫和体液免疫过程中起重要的辅助作用 ,根据其分泌的细胞因子谱的不同 ,可将其进一步分为几个功能亚群 ,后者的发展受其细胞因子网络的调节。新近的研究表明IFN对细胞因子网络有着复杂的效应 ,IL 1 2可能通过诱导IFN而在抗病毒过程中起重要作用 ,以细胞因子类型调控TH 亚群 ,可能为治疗病毒性肝炎提供一条新途径。
参考文献：
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[4]. 肠源性内毒素血症对慢性肝炎患者免疫功能的影响及其机制的探讨[D]. 李红. 山西医科大学. 2006
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[6]. TIPE2和FOXP3 mRNA在原发性肝癌患者PBMCs及肝组织中的表达及临床意义的初步探讨[D]. 张玉卓. 河北医科大学. 2012
[7]. 腺病毒介导的基因修饰树突状细胞肝癌瘤苗的制备及其抗HBV相关肝癌的免疫实验的研究[D]. 杨静悦. 第四军医大学. 2007
[8]. 丹黄方对急性肝衰竭及肝再生大鼠作用的实验研究[D]. 朱清静. 湖北中医学院. 2006
[9]. 细胞因子网络与病毒性肝炎[J]. 韦嘉, 姚集鲁. 国外医学(内科学分册). 1999
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