王磊[1]2004年在《胰腺内分泌前体细胞的培养及促成熟作用实验研究》文中研究说明研究背景和目的： 作为威胁人类健康的主要疾病，以胰岛移植为代表的细胞替代治疗具有一定的优势，但供体来源不足的问题限制了其在糖尿病中治疗中的应用。胰腺干细胞由于具备一定的增殖能力而备受瞩目。利用简便易行的方法得到具有向内分泌方向分化能力的胰腺干细胞是临床应用的基础。另一方面，因为干细胞在功能上与成熟细胞有一定距离，如何促进胰腺干细胞的成熟使其在体内环境中更好的发挥作用，也是干细胞移植临床应用的关键。基于此，本实验以SD大鼠及人骨髓间充质干细胞为研究对象，探讨了胰腺干细胞的分离、培养及促成熟的方法，为干细胞移植在糖尿病治疗中的临床应用提供实验依据。 研究内容： 1．为探索胰腺干细胞培养比较简便的方法，本研究采用了组织块培养法及胶原酶消化法两种方法培养SD大鼠的幼鼠胰腺，并以免疫荧光、双硫腙染色、放免测定胰岛素、扫描电镜及透射电镜等方法对所培养细胞作出鉴定。 2．用携带VEGF基因的腺病毒质粒转染培养得到的细胞，以MTT法观察了该质粒转染对于培养细胞增殖能力的影响；然后，将四种不同培养条件的细胞：未分化组、分化组、GFP组、VEGF组移植入建立了糖尿病模型的BALB／c鼠(裸鼠)肾包膜下，观察移植细胞对于糖尿病BALB／c鼠血糖、体重、生存期、胰岛素水平的影响。将移植肾切除制备病理切片并行CD34免疫组化染色，观察VEGF基因转染后对于移植细胞周围环境微血管形成及成熟情况的影响。 3．利用大鼠胎胰组织的提取液，体外培养人骨髓间充质干细胞，探讨其转化为胰腺干细胞的可能性。
陈波[2]2008年在《胰腺干细胞移植治疗1型糖尿病的动物实验研究》文中研究表明研究背景糖尿病是影响人类健康的主要疾病之一。其治疗方法包括传统药物、胰岛素注射以及胰腺器官移植和胰岛移植等。胰腺器官移植技术复杂,围手术期并发症发生率较高,手术适应证仍局限于糖尿病合并肾功能衰竭需同时行胰肾联合移植者,目前仅在世界上比较大的移植中心开展。以胰岛移植为代表的细胞替代治疗具有手术易操作,创伤小的优点;而且与胰岛素注射治疗相比,胰岛移植物对机体血糖可实时监控,并及时释放胰岛素,维持机体的血糖稳定状态,防止糖尿病肾病、视网膜病变等并发症的发生。1999年埃德蒙顿(Edmonton)方案的实施使胰岛移植的疗效得到了显着提高,标志着糖尿病治疗进入了现代胰岛移植的全新阶段。但胰岛移植同样面临着供体来源受限的问题,加上移植围手术期技术和环境改变等因素造成的胰岛细胞大量死亡和功能损害,最终限制了胰岛移植在临床更大范围的应用。故扩大胰岛细胞来源成为近年胰岛移植研究领域的热点。有学者曾尝试采用异种胰岛移植(如猪)解决胰岛供体不足的矛盾,并且认为有可能避免1型糖尿病的自身免疫性攻击,但由于存在猪源性逆转录病毒感染的潜在危险,目前多数科学家认为只有在掌握人兽共患病机制之后,此项技术才能开展。为解决胰岛移植供体短缺的难题,近年来干细胞成为研究的热点之一。干细胞最显着的生物学特征是既具有自我更新、高度增殖的能力,又具有多向分化的潜能。按其来源可将它们分为胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)和成体干细胞(Adult somatic stem cells,ASSCs)。胰腺干细胞(Pancreatic stem cell,PSCs)属于ASSCs,目前还没有明确的定义。一般是指未达终末分化状态,能产生胰岛组织或起源于胰岛,具有自我更新复制能力的未定型细胞。PSCs由于与胰腺内分泌细胞属于同一细胞谱系,分化成目标细胞的生物学步骤最短,被认为是最有希望作为临床胰岛移植的干细胞来源之一。其它优点包括:(1)具有高度增殖和多向分化潜能,能极大解决胰岛细胞来源不足的难题;(2)可通过胰腺活检获得自身的PSCs、干细胞建库、基因工程改造或修饰同种异体PSCs的方法避免或降低免疫排斥反应的发生;(3)避免了ESCs引起的无限增值而导致的肿瘤生长;(4)避免了应用ESCs带来的社会伦理问题。目前已有较多的研究对PSCs的细胞来源、培养、体外诱导分化、鉴定等进行了探讨。由于PSCs的研究尚处于起步阶段,各种方法差别较大,还没有一套公认的的培养、诱导分化及鉴定方案。另外,由于体外条件下无法模拟促使干细胞发育成熟的体内环境,致使大多数研究不能获得真正成熟的胰岛细胞,不能够完全逆转动物的高血糖状态。因此,我们设计本实验,确立一种简单有效的培养、鉴定PSCs的方案;鉴于体内微环境有促进PSCs发育成熟的刺激信号、营养物质和因子,我们也试图寻找促使PSCs发育成熟的最佳体内环境,也就是使PSCs发挥最佳的治疗糖尿病的效果。目的(1)探索从新生Wistar大鼠胰腺组织中分离、培养胰腺干细胞并进行鉴定以及体外诱导分化的方法。(2)探讨并比较不同分化状态的胰腺干细胞(未分化细胞和经体外诱导方案诱导分化的细胞)经两种移植途径(分别经门静脉和肾包膜下移植)对糖尿病大鼠的治疗效果。方法(1)取新生Wistar大鼠的胰腺组织,经胶原酶消化成组织碎片,转入含有RPMI1640高糖培养基(含33.3mM的Glu,并添加了10%FBS、20ng/ml EGF,20ng/ml bFGF)的培养瓶(预先用鼠尾胶原处理)中进行原代和传代培养:使用无血清RPMI1640低糖培养基(含11.1mM的Glu,撤去EGF、bFGF和FBS,另添加10mM尼克酰胺,71.5uMβ—疏基乙醇)对培养细胞诱导分化。以扫描与透射电镜观察细胞的超微结构形态;免疫荧光法检测胰岛素、胰高血糖素、PDX-1、CK-19以及Ngn3等抗原的表达;双硫腙染色检测干细胞分化前后β细胞比率;放免法测定细胞胰岛素分泌水平;PCR技术检测PDX-1 mRNA、CK-19mRNA、Ngn-3 mRNA和胰岛素mRNA的表达情况。(2)取Wistar大鼠50只,经尾静脉一次性注射链脲佐菌素(60 mg/kg bodyweight),随机血糖＞16.7mM并持续稳定1周为造模成功。然后将成模大鼠随机分为5组:A组(n=5,对照组,经门静脉注射生理盐水)、B组(n=10,经门静脉移植未分化PSCs)、C组(n=10,经门静脉移植已分化细胞)、D组(n=10,肾包膜下移植未分化PSCs)和E组(肾包膜下移植已分化细胞)。移植术后监测大鼠的随机血糖、体重和胰岛素的变化;移植后13天和28天行经腹腔注射的葡萄糖耐量试验;术后14天和30天分两批处死全部大鼠,取A、B、C叁组大鼠的肝脏和D、E两组大鼠的肾脏做病理切片和免疫组织荧光染色,测量体内“类胰岛结构”的直径、观察其形态以及胰岛素表达的情况。结果(1)胶原酶消化法联合使用高糖培养基可有效分离得到纯化的胰腺导管上皮细胞。培养细胞具有高度增值能力,电镜下呈未分化细胞特征,同时表达PDX-1和CK-19,随着传代次数增加,部分细胞表达Ngn3;但该种细胞不表达胰岛素和胰高血糖素,双硫腙染色和胰岛素分泌实验未证实有胰岛素阳性细胞。分化培养后,部分细胞可表达胰岛素和胰高血糖素,双硫腙染色阳性细胞比率为25±6%,胰岛素反应能力提高,对10～30mM浓度的糖浓度刺激具有反应。(2)50只Wistar大鼠48只造模成功,成模率为96%。细胞移植术后第6天至第18天,B组糖尿病大鼠血糖与对照组相比差异有显着性意义,术后14天时血糖曾降至正常范围;C、E两组血糖变化趋势基本相同,与对照组两两相比,第4天时血糖浓度差异有显着性意义,但持续时间较短,且整个过程中未见血糖恢复至正常范围。D组与对照组相比,直到实验结束时两组血糖差异无显着性意义。经腹膜腔注射的葡萄糖耐量试验显示B组细胞移植物移植后13天具有较强的抗高血糖效应。形态学观察发现未分化胰腺干细胞可以在大鼠肝脏内(B组)诱导分化为较大的“类胰岛样结构”,直径多在150～200μm左右,胰岛素染色阳性细胞较密集,而C、E两组以直径50μm左右较小的“类胰岛样结构”居多,胰岛素染色阳性细胞较稀疏。免疫组织荧光染色显示B组类胰岛样结构中有较多的BrdU阳性细胞。结论(1)本研究利用胶原酶消化法得到的细胞具有高度增值能力和分化成胰岛细胞的潜能,经多种实验技术方法证实是来源于导管上皮的胰腺干细胞。低糖培养基的条件下,有助于胰腺干细胞的分化成熟。(2)经过体外条件诱导分化的胰腺细胞移植入肝脏内和肾包膜下能进一步分化成熟,以较小的“类胰岛样结构”为主;而未分化的胰腺干细胞在肝内微环境和高血糖刺激下能够诱导分化为更为成熟的较大的“类胰岛样结构”,并且能短暂的完全逆转糖尿病大鼠的高血糖。胰腺干细胞定向分化为内、外分泌细胞的潜能有助于内分泌细胞的进一步成熟。
刘晓芳[3]2013年在《诱导人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞分化及其机制研究》文中提出糖尿病是由于分泌胰岛素的β细胞缺失或功能异常而引起的糖代谢异常疾病。目前，尽管多种药物尤其是胰岛素的应用对糖尿病的治疗效果有了很大改善，但还没有一种治疗手段可以完全治愈糖尿病，阻止其并发症的发生。除了Ⅰ型糖尿病的中β细胞总数的缺乏外，新近研究发现在Ⅱ型糖尿病患者胰腺中同样存在β细胞团减少的现象，因此通过胰腺或胰岛移植是根治糖尿病的唯一手段，但是供体胰岛的严重缺乏限制了其广泛开展。干细胞因其多向分化潜能和自我更新的特性，已被越来越广泛地应用于细胞替代治疗的研究中。然而，将干细胞真正用于糖尿病的临床治疗还面临许多问题。细胞数量和功能不足是干细胞治疗糖尿病所面临的主要挑战。尽管近年来，已经建立了使用生长因子和小分子化合物，将多能干细胞分化为胰腺内分泌细胞的方法，但是多能干细胞分化成为内分泌细胞需经过定型内胚层，胰腺祖细胞，内分泌祖细胞以及特定类型内分泌细胞五个阶段，诱导时间长，不可控制的因素多，所以，目前还没有一种方法可以获得足够数量、终末分化的功能性胰岛细胞。研究认为，胰岛的结构和胰岛细胞间的相互作用决定胰岛细胞的功能，叁维(threedimentional,3D)细胞培养技术可通过恢复细胞与细胞间的相互关系弥补2D培养技术的不足，本课题拟利用3D培养技术从组织结构、细胞间相互作用的角度进行研究，尝试解决替代细胞分化效率和功能成熟的问题。3D培养技术因其在体外构建与体内相近的细胞发育结构系统，成为研究细胞-细胞，细胞-基质间相互作用最直观的体外细胞培养模型，大量研究已证明，3D环境下的诱导分化效率高于2D环境，并且3D细胞培养可以恢复细胞的结构并提高细胞的功能。但是3D培养是否可以促进胚胎干细胞向胰岛细胞的分化，3D结构的细胞生长模式与胰岛细胞功能成熟之间的关系还不清楚。基于以上考虑，本课题分为两部分，第一部分的工作旨在探索3D细胞培养与胰岛细胞功能之间的关系；第二部分在第一部分工作的基础上，利用3D细胞培养技术，模仿体内胰岛生长微环境，探讨3D细胞培养对人胚胎干细胞（human embryonic stemcells, hESC）向胰岛细胞分化过程中的影响，并初步分析其作用机制，为体外获得有功能的种子细胞提供技术支持和理论基础。一、叁维细胞培养对胰岛细胞功能的影响及其机制研究：通过悬浮培养小鼠β细胞系MIN6细胞，形成类组织样结构的MIN6细胞团(3D-MIN6)，葡萄糖刺激胰岛素释放(GSIS)实验证实，3D-MIN6较2D-MIN6在葡萄糖刺激下可以释放更多的胰岛素，q-PCR显示3D-MIN6中胰腺内分泌细胞相关基因表达上调，提示3D细胞培养可以增强β细胞的基因表达和GSIS功能。RhoA和ROCK功能阻断实验表明，3D-MIN6细胞通过抑制RhoA/ROCK通路，使F-actin重构，易化胰岛素释的释放过程，另外，3D细胞培养和RhoA/ROCK功能阻断可使细胞缝隙连接蛋白36（Connexin36, Cx36）的表达增高，而通过siRNA技术阻断Cx36功能后，MIN6细胞的GSIS明显降低，即使抑制RhoA/ROCK活性也不能恢复MIN6的胰岛素释放功能，提示Rho/ROCK信号通路通过Cx36发挥调节胰岛素释放的作用。第一部分的研究表明3D细胞培养通过抑制RhoA/ROCK的活性，可以促进Cx36的表达，进而加强MIN6细胞的GSIS功能。二、诱导人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞分化及其机制研究：本研究首先利用细胞因子和小分子化合物组合建立了诱导hESC向胰腺内分泌细胞(pancreaseendocrine cell, PEC)的分化体系，通过27天的诱导，hESC来源的PEC可以合成内分泌激素胰岛素、胰高血糖素和生长抑素，并且能在Fosklin、KCL的刺激下分泌胰岛素，但是对与葡萄糖的刺激反应微弱。在此基础上，我们分别对诱导细胞进行了简单的悬浮3D培养和基质材料Matrigel包埋的3D细胞培养，与常规2D培养相比，3D培养加强了hESC来源的PEC的内分泌特异性，使胰岛素阳性细胞的分化效率提高到23.7%，细胞内胰岛素的含量明显增多，并且具备了GSIS的能力。通过对影响细胞间相互作用的粘着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)研究发现，3D组诱导细胞中FAK活性明显低于2D组，抑制FAK或其下游ROCK的表达，可以促进内分泌细胞定向分化的相关基因NGN3、NKX6.1、ISL1的上调表达，说明FAK和ROCK通路参与了3D培养促进内分泌细胞定向分化的过程。另外TGFβ信号通路已被证实具有调节内分泌细胞定向分化的作用，我们Western blot结果显示，下调FAK活性亦可抑制TGFβ下游Smad2的活性。在3D组诱导细胞中还发现Cx36表达明显上调，抑制FAK和ROCK通路同样可以提高Cx36基因合成和蛋白表达，说明3D培养通过FAK、ROCK信号通路调控Cx36的合成与表达，进而增强细胞GSIS的功能。小鼠体内试验证实移植入体内的PEC可以合成胰岛素并根据体内血糖水平调节其释放。综上所述，本课题的研究表明，3D细胞培养条件有利于小鼠β细胞系MIN6胰腺发育相关基因的表达和GSIS功能的发挥。在hESC向PEC的分化过程中，3D细胞培养通过抑制FAK及其下游信号通路ERK、ROCK、Smad2，可以提高PEC的分化效率和增强GSIS功能。该研究不仅为3D环境可以增强β细胞功能和促进hESC向PEC分化提供了新的理论和技术基础，也给糖尿病患者应用细胞替代治疗带来了新的希望。
辛颖[4]2007年在《人骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的实验研究》文中研究表明为解决目前胰岛移植根治糖尿病所面临的胰岛来源匿乏和免疫排斥两大难题,本实验以人骨髓间充质干细胞(hMSCs)作为胰岛移植种子细胞,以适宜条件诱导hMSCs分化为胰岛素分泌细胞并初步探讨其分化机制。以密度梯度离心法和贴壁筛选法大量培养扩增hMSCs,利用高糖、尼克酰胺和Exendix-4体外诱导hMSCs向胰岛素分泌细胞分化,通过形态学、酶学、分子生物学和电生理学等方法对诱导后的细胞进行分泌功能和活性鉴定,并以PDX-1和离子通道变化为切入点探讨其分化条件和机制。并利用BrdU标记诱导后细胞移植入糖尿病裸鼠体内,进一步观察其是否具有分泌胰岛素和降低血糖的功能。结果发现:成功地分离培养并扩增hMSCs;体外诱导hMSCs分化为为胰岛素分泌细胞,并且分化后细胞保持良好的增殖活性,其胰岛素的分泌受外环境糖浓度的调节;hMSCs分化机制可能为高糖刺激了hMSCs细胞PDX-1的表达和活化以及Ca2+通道开放,从而激活下游一系列胰岛分化相关基因;BrdU标记诱导后细胞移植入糖尿病裸鼠体内能够存活增殖并具有较好的降低血糖功能,具备了一定的胰岛细胞功能。综上所述,本实验系统全面的探讨了适宜条件下hMSCs分化为胰岛素分泌细胞的可能和机制,为今后更好地利用hMSCs作为胰岛移植的种子细胞治疗胰岛素依赖型糖尿病提供了理论基础和实验依据。
程志强[5]2010年在《胰岛对胰腺干细胞促成熟作用及机制的实验研究》文中研究说明研究目的：1.以成年大鼠作为实验对象,采取自胆总管逆行灌注胶原酶-V消化胰腺并用Ficoll进行梯度离心的方法获取纯化的胰岛,检测胰岛的产量、纯度、存活率及生物学活性,以确定胰岛分离及纯化方法是否适宜可靠。2.以胎鼠作为实验对象,获取其胰芽并通过胶原酶消化法取得原代细胞并进行纯化后培养,检测干细胞相关标志物,确定胰腺干细胞的性质及分离和培养方法是否可靠。3.在胰腺干细胞传统诱导培养基内加入胰岛进行共培养,观察诱导分化效果并检测相关指标,探讨其机制。总之,通过以上研究,为胰腺干细胞移植治疗糖尿病应用于临床提供实验支持和理论基础。研究方法：第一部分：胰岛的分离与纯化。以成年Wistar大鼠为实验对象,采取胆总管内逆行灌注胶原酶-Ⅴ的方法消化胰腺,并将获得的胰岛悬液使用Ficoll溶液梯度离心进行纯化。而后检测所得胰岛的产量、纯度、存活率及培养液中基础胰岛素水平,并进行胰岛素释放试验,计算胰岛刺激指数。以判断胰岛分离提纯方法是否可靠。第二部分：胰腺干细胞的分离、培养与鉴定。以胎鼠为实验对象,取得其胰芽后以胶原酶消化法获得原代细胞进行培养,并采用差速贴壁的方法进行纯化,取传代后细胞行细胞角蛋白-19(CK-19)、巢蛋白(Nestin)、.胰高血糖素(Glucogon)和胰岛素(Insulin)等指标的免疫组织化学及RT-PCR检测。以证实所得细胞的干细胞性质,并确定干细胞分离培养方法的可行性与可靠性。第叁部分：胰腺干细胞的诱导分化。选取在第二部分中经检测证实的胰腺干细胞进行诱导分化,实验共分为叁组：胰腺导管干细胞单独培养组(Ⅰ组),干细胞-胰岛混合培养组(Ⅱ组)及胰岛单独培养组(Ⅲ组)。各培养组均采用相同的诱导培养基。共培养组在使用诱导培养基的同时加入50个／孔的胰岛(直径>100μm)。在诱导培养过程中测定基础胰岛素水平,进行胰岛素释放试验并计算胰岛素刺激指数；诱导分化后再次检测CK-19、Nestin、Glucogon和Insulin等指标,观察胰腺干细胞诱导分化后的成熟情况,评价混合培养组中胰岛对于胰腺干细胞的促成熟作用,并研究其机制。以上叁部分数据以x±s表示,以SPSS13.0软件进行统计学分析。均数间采用t检验,重复测量数据以重复测量数据的方差分析检验,以P<0.05为检验水准。结果：第一部分：大鼠胰岛的分离与纯化。每只大鼠胰腺可获得胰岛细胞(345±38)个。经梯度离心纯化后获得(254±42)个胰岛细胞,平均纯度为(87±13)%,平均回收率为74.3%。AO／PI染色后显示胰岛制备物存活率大于95%。所得胰岛培养24小时后基础胰岛素为4.21mIU／L,胰岛素刺激指数为2.31。第二部分：胰腺干细胞的分离、培养与鉴定。由胎鼠胰芽消化得到原代细胞,通过差速贴壁的方法纯化后,可见细胞呈上皮样贴壁生长良好,多边形。通过免疫组织化学染色及RT-PCR检测,结果示CK-19、Nestin和Glucogon在细胞内均有表达,诱导前细胞不表达Ⅰnsulin。第叁部分：胰腺干细胞的诱导分化。诱导分化后,干细胞单独培养组和干细胞-胰岛共培养组中除CK-19、Nestin和Glucogon继续表达外,Insulin也开始表达。而且结果显示,共培养组表达CK-19及Insulin蛋白的细胞阳性率高于干细胞单独培养组,差别有统计学意义(P<0.05)。结论：(1)经胆总管逆行灌注胶原酶-V并用Ficoll进行梯度离心纯化的方法获取胰岛的产率、纯度高,存活率满意,生物活性良好。(2)采用胶原酶消化法消化胎鼠胰芽组织,而后由差速贴壁法进行纯化,是获得胰腺干细胞的可靠方法。(3)自胎鼠胰芽获得的细胞表达胰腺干细胞的相关标志物,在蛋白质及基因水平验证了其干细胞性质。(4)传统诱导培养基可诱导小部分胰腺干细胞分化为表达Insulin的相对成熟的β前体细胞。(5)诱导培养基中加入胰岛后,可模拟胰腺内环境,通过多种因子作用促进胰腺干细胞成熟。(6)相关检测提示,共培养后CK-19在胰腺干细胞内表达增加,是胰岛对胰腺干细胞的促成熟作用的重要机制。
闫志风[6]2008年在《人胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究》文中提出胰岛移植或β细胞替代足糖尿病最理想的治疗手段,但细胞来源严重匮乏及免疫排斥反应限制了临床的广泛应用。将人胚胎干细胞(human embryonicstem cell,hESCs)诱导为胰岛素分泌细胞,成为β细胞替代物的新资源,为解决细胞来源匮乏带来了希望。已有多种方案由ESCs获得胰岛素分泌细胞,但均存在各种限制,目前仍缺乏将ESCs诱导分化为有功能的胰岛素分泌细胞的最佳方案。探索诱导人hSCs分化为成熟且有功能的胰岛素分泌细胞,并制定出有效而高效的分化方案,成为本课题的主要研究目的。第一,本研究摸索了在体外培养、扩增、冻存、复苏hESCs细胞株(PKU1)的条件,并对其特异性标志物进行了检测。结果显示,hESCs经多次传代后仍然表达OCT-4和Nanog基因,免疫荧光法显示呈OCT-4、SSEA-4阳性,流式细胞术分析显示,OCT-4、SSEA-4阳性细胞比例分别达89.38%、83.44%;染色体核型分析表明为正常女性染色体核型(46,XX)。第二,采用酶消化法分离出胎龄14-18W的胎儿胰岛,经悬浮培养、双硫腙(DTZ)染色后种植到组织培养皿中,再以免疫荧光法检测一些细胞标志物的表达。结果显示,悬浮培养条件下,胎龄14-18W的胎儿胰岛细胞聚集成球形细胞簇,呈DTZ阳性,培养液中能检测到一定量的胰岛素和C-肽,贴壁培养后还能检测到胰岛细胞标志物insulin和glucagons及前体细胞标志物PDX-1、CK-19和Nestin的表达,证实14-17W胎儿胰岛已具备一定的胰岛特性和前体细胞的特征。第叁,模拟胰腺发育分化的生理过程,研究设计出五阶段诱导方案,具体如下:(1).撤除分化抑制因素使hESCs形成拟胚体(EBs),悬浮培养48h;(2).将EBs转移至明胶包被的组织培养皿后,加入含Activin A和bFGF及LY294002的诱导培养基Ⅰ诱导5天,向定形内胚层诱导分化。RT-PCR法鉴定SOX17和FOXA2的基因表达,与同期自发分化的EBs进行比较,免疫荧光法检测SOX17的表达。(3).将细胞转移至laminin包被的培养皿,加入含bFGF、KGF、EGF、GLP-1、尼克酰胺的低血清诱导培养基Ⅱ作用14d,向胰腺前体细胞诱导。RT-PCR法和免疫荧光化学法分别检测前体细胞标志物PDX-1及Ngn3表达。(4).添加含IGF-1、betacellulin、尼克酰胺、GLP-1、laminin的低血清诱导培养基Ⅲ作用14d,促进胰岛细胞分化,RT-PCR法检测细胞胰岛素基因的表达,免疫荧光化学法检测分化细胞胰岛素和C-肽的表达。(5).将细胞转移至低黏附性培养皿中,撤除IGF-I继续培养3天,促进细胞成熟。应用双硫腙(DTZ)染色液对获得的细胞团进行染色,应用RT-PCR法检测了胰岛素和胰高血糖素基因表达,应用RIA法分别测定了获得的细胞团培养液上清和胞浆中的胰岛素、C-肽含量,并与胎儿胰岛培液上清进行比较,静态培养胰岛素释放试验测定胰岛素与C-肽分泌是否呈葡萄糖反应性。结果(1).hESCs悬浮培养2d后,形成类球形EBs;(2).经第二阶段诱导后,细胞表达SOX17和FOXA2基因,且表达量高于同期自发分化的EBs,基本不表达外胚层标志物SOX1,随诱导时间延长,FOXA2表达逐渐增强;免疫荧光化学法显示,诱导5天的细胞胞核呈SOX17。(3).经第叁阶段的诱导,细胞呈上皮样集落,RT-PCR法检测到细胞表达PDX-1、Ngn3及微弱的Pax4基因,免疫荧光法显示细胞呈PDX-1阳性。(4)经第四阶段的诱导,集落中一部分细胞聚集成多层,RT-PCR显示,不同诱导时期均有胰岛素基因的表达,且随诱导时间延长表达水平逐渐升高;免疫荧光显示,部分细胞呈胰岛素和C-肽阳性。(5).经第五阶段诱导后,hESCs来源的细胞呈类似胎儿胰岛的胰岛样细胞簇(ICCs),呈DTZ阳性,RT-PCR检测到Insulin和Glucagon基因表达,RIA法检测到ICCs培液上清中含胰岛素与C-肽,水平与15-17W胎儿胰岛培液上清相近(P＞0.05),胞浆内的胰岛素和C-肽水平分别为1089.2±217.06μIU/ml和181.33±30.12ng/ml,静态培养胰岛素释放试验验证了ICCs分泌的胰岛素呈糖反应性。应用五阶段分化方案,hESCs能够有效的分化为具有部分β细胞特性和糖反应性胰岛素分泌功能的细胞,为DM细胞替代治疗提供了有潜力的细胞来源和良好的临床应用前景。
闫志风, 李亚里, 彭红梅[7]2007年在《胚胎干细胞移植治疗糖尿病的实验研究》文中研究说明目的:回顾近年来利用胚胎干细胞治疗糖尿病的实验研究现状,认识诱导分化的胚胎干细胞移植治疗糖尿病的实验研究新进展及应用于临床前尚需解决的难题。资料来源:应用计算机检索Pubmed2000-01/2007-05胚胎干细胞治疗糖尿病的相关文章,检索词为“embryonic Stem cells,insulin-producing cells,diabetes”,并限定文献语言种类为English;以“胚胎干细胞,胰岛素分泌细胞,糖尿病”为检索词,检索中国全文期刊数据库2001-01/2007-01相关文章。资料选择:对资料进行初审,选取包括胚胎干细胞诱导分化与糖尿病的相关文献,开始查找全文。纳入标准:①胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞。②胚胎干细胞诱导分化与糖尿病治疗。排除标准:综述文献、重复研究、Meta分析类文章。资料提炼:共收集到44篇关于胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞治疗糖尿病的英文文献,纳入30篇符合标准的文献;8篇中文文献,纳入3篇进行探讨。资料综合:胚胎干细胞因具有独特的生物学特性有望成为糖尿病细胞移植最有前途的来源,体外可诱导胚胎干细胞分化为具备β细胞特征的功能性胰岛素分泌细胞,能使模型小鼠的高血糖恢复正常。但人类胚胎干细胞真正应用于临床前仍存在许多难题,如分化效率低、细胞不够成熟、免疫排斥、远期疗效等。随着基础研究的深入和临床应用难题的解决,胚胎干细胞将成为细胞移植治疗糖尿病最有希望的来源。结论:胚胎干细胞的应用将为细胞移植治疗糖尿病带来新的希望。
苏纪权[8]2007年在《RNAi干扰树突状细胞CD40基因对移植排斥反应影响的体外研究》文中提出目的:探讨RNAi (RNA interference)技术沉默树突状细胞CD40基因,建立DC(Dentritic cells)细胞培养及转染方法,对体外脾淋巴细胞的影响,对IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10分泌的影响,为寻求治疗急性移植排斥反应提供基础研究。方法:1.DC细胞培养:培养参照Giannoukakis等报道的方法[Molecular Therapy 2000;1(5):430-437]。从Dark Agouti (DA)供体大鼠股骨中获取的骨髓细胞在含2ml RPMI-1640的24孔培养板(2×106/孔)中培养,其中含抗生素10%(v/v)小牛血清FCS。加入基因重组大鼠GM-CSF(20ng/mL)以扩增未成熟DC。除GM-CSF外,加入基因重组大鼠IL-4 (20 ng/mL)以获得成熟DC。在选定的培养孔,于培养开始时分别加入pSilencer1:U6-CD40 siRNA和pSilencer空白质粒转染细胞,以鉴定siRNA-CD40抑制由IL-4诱导的DC成熟的能力和其抑制DC中CD40基因表达的能力。每2天更换富含细胞因子的培养液;轻微旋动培养板后,吸除一半旧培养液,再加入等量且含细胞因子的新鲜培养液。因此,非贴壁的粒细胞将被清除又可确保那些已生长出的松散地附在弹性帖壁巨嗜细胞单层上的DC细胞簇不被同时移除。10天后收集那些自动从DC细胞簇离开的未帖壁DC。2.大鼠Silencer2.1-U6- siRNA-CD40重组质粒的构建与鉴定(1)siRNA靶位点的选择及编码siRNA DNA模板的体外合成根据GeneBank(AF241231)大鼠CD40基因mRNA的已知序列,寻找符合特征的靶序列,合成分别针对其叁个编码区合成两条DNA寡核苷酸链(分别命名为CD40 -1,-2,-3)并用RNA structure 4.11软件对其二级结构预测,每条模板链的组成包括19个碱基正义链和与其互补的19个碱基的反义链,正反链之间有9个碱基(TTCAAGAGA)间隔,反义链之后有5个T作为转录终止信号,在模板链的两端加入Hind III及BamH I酶切位点。合成两条链在退火缓冲液(100mM K-acetate, 30mM HEPES-KOH pH 7.4, 2 mMMg-acetate)作用下退火(90℃,3min,37℃,1hr),形成双链结构。待连接。(2)pSilencer2.1-U6载体线性化及回收pSilencer?2.1-U6 neo质粒:全长4521bp,含有U6启动子,氨苄抗性,含NEO基因,可由新霉素筛选稳定转染。pEGFP质粒:带有增强绿色荧光蛋白的原核克隆和表达载体,全长3.4kb,含有LacZ启动子,氨苄抗性;同时与Silencer2.1-U6-siRNA重组共转染,估计细胞体系的转染效率。将pSilencer2.1-U6用BamH I及Hind III分别消化,对消化后产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,将含有线性化质粒的凝胶在紫外灯下切下,放入1.5ml离心管中,加入3倍体积的融胶液,45℃-55℃水浴5-10min,使胶完全融化,加入10μl玻璃奶(通常1μgDNA用1μl玻璃奶),混匀,45℃-55℃冰水浴5-10min,其间每隔2-3min混匀一次,5,000转/min离心30-60s,弃上清,加入400μl洗液,轻弹管底,5,000转/min离心30s,弃上清,重复上述步骤一次,吸净洗液,室温干燥,加入10-30μl无菌双蒸水,将玻璃奶悬起,45℃-55℃水浴5-10min,10,000转/min离心1-2min,回收上清用λDNA mark做标准品定量,待连接。(3)载体与siRNA模板链连接连接体系中模板与载体的摩尔数比约为3-5:1,充分混匀,加入T4连接酶16℃反应过夜。连接产物可立即转化感受态细胞或于-20℃保存。同时进行空载体自身环化作为阴性对照。(4)感受态细胞的制备与连接产物的转化取-70℃保存的GM109大肠杆菌接种于平板,次日挑取单菌落接种于LB固体培养基中,370C培养过夜。用无菌签挑取单菌落,转到3mlLB液体培养基中,37℃300rpm振荡2h,取1ml菌液接种到100ml LB培养基中,37℃继续培养待OD600大约为0.4时取出,冰浴10min。将菌液转到灭菌的预冷50ml离心管中,4℃4000g离心10min回收细菌,重悬于10mlCaCl2(0.1mol/L)中,冰浴30min , 4℃4000离心10min ,弃上清,加4 ml预冷的CaCl2(0.1mol/L),置于4℃,16h后用于转化试验,或加入甘油至终浓度10%,-70℃保存备用。取100μl的感受态细菌,加入5μl pSilencer2.1-U6与siRNA连接产物,用空载体作对照,轻轻旋转混匀,冰浴30min,42℃热休克90s,快速放置冰浴中2min,加入800μl LB培养基(不含Amp),37℃振荡培养60min,吸100μl培养液滴于含Amp的LB平板涂匀,待表面液体吸收后,倒置平皿37℃培养16-20h。(5)阳性重组克隆的筛选(碱裂解法)15,000rpm离心10min,弃上清,加入冰冷的75%乙醇洗一次,离心室温干燥,用含RNase(50μg/ml)的双蒸水10μl充分溶解沉淀。用M13F(-40): 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3' Rev: 5'-GAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3' primer测序。(6)重组质粒的转染DC细胞用RPMI1640培养基加10%小牛血清37℃,5% CO2培养。用100 ml培养瓶,当贴壁细胞达到80%-90%融合,用无血清培养基洗叁遍,将脂质体15μl加无菌水85μl室温放置10分钟,重组质粒18μg用无菌水加至总体积100μl室温放置10分钟,两者混合室温放置10分钟后加入细胞无血清培养液中,用pEGFP质粒与psilencer1.0-U6-CD40-siRNA按1:20的比例以慢病毒为载体共转染,以标记阳性转染的细胞;空质粒对照用psilencer1.0-U6质粒,另外一组只用脂质体加入培养细胞内;于转染后24-72小时,加G418(新霉素)进行稳定转染阳性克隆筛选,筛选21天后收集细胞,做Western blot分析。3.Western blot测定RNAi干涉后CD40基因在DC中的表达情况裂解RNAi干涉后的DC,用常规Western blot方法检测CD40表达情况。4.单向混合淋巴细胞反应(MLR)采用3HTdR掺入法。刺激物为RNAi干涉后的DC;反应物为Lewis大鼠的脾细胞。最后用自动液闪计数仪测定每分钟脉冲数值。5.通过ELISA的方法检测大鼠淋巴细胞分泌细胞因子的情况。6.统计学分析所得数据以均数±标准差表示,用SPSS软件包(10.0版)进行统计学处理,多组资料均数比较采用F检验,若差异有显着性,则进一步进行q检验。结果:1.成功从大鼠骨髓细胞中体外诱导培养出树突状细胞。2.通过感染含有RNAi序列的慢病毒可以抑制树突状细胞中CD40的表达。3.RNAi沉默后树突状细胞体外活化脾细胞的能力减弱。4.RNAi干涉后的DC活化的淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ的量显著减少结论:应用RNAi技术沉默DC上的CD40,切断第二信号传递使T细胞沉默,不被激活,达到抑制急性免疫排斥反应。
蔺晨[9]2010年在《生物支架在干细胞分化及胰岛培养中的应用》文中研究指明背景与目的成体干细胞(ASC)的相关研究是1型糖尿病研究领域的热点之一。目前国际上仍未有研究将成体干细胞直接向胰岛方向进行叁维诱导。本研究拟探索一种新诱导方案及体系的可行性,即采用叁维支架-ECM培养法进行成胰岛组织诱导分化,以期构建出胰岛组织块,为组织工程寻找新的工程化材料。材料与方法分离小鼠骨髓来源干细胞作为诱导对象,实验分为平面培养、ECM培养及聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架-ECM培养3组,诱导周期为10日,随后收集标本进行形态学、免疫学和功能实验的检测。结果通过倒置显微镜、扫描和透射电镜、免疫细胞化学法和放射免疫法测定刺激实验的胰岛素含量等方法观察到：小鼠骨髓来源干细胞内出现大量小泡,成团簇趋势,DTZ染色可呈阳性,也有类似B细胞的超微结构出现,扫描电镜体现了细胞与支架的相容性；免疫细胞化学检测发现部分细胞呈胰岛素、C肽双染阳性、胰高血糖素阳性和生长抑素阳性；经不同浓度糖刺激时,平面组的胰岛素分泌量有差异(p<0.05), ECM组和支架-ECM组的分泌量均有显着性差异(p<0.01),高糖刺激后胰岛素分泌显着性增加,并且高糖刺激下,支架-ECM组的胰岛素分泌量较平面组以及ECM组也有显着提高(p<0.01)。结论体外将小鼠骨髓来源干细胞向分泌多种胰岛特异性激素的细胞团分化是可行的,从形态学、功能学及免疫学方面进行了初步验证,并揭示了PLGA支架叁维诱导分化的优越性。最后,本实验还验证了细胞与PLGA支架的良好相容性。背景与目的如何利用干细胞共培养技术保护体外胰岛的活性一直是胰岛移植治疗1型糖尿病领域的热点之一,而近年来脂肪来源干细胞(ATDSC)因其来源充足、易于获取而逐渐受到重视。目前国际上尚未有与ATDSC共培养延长体外胰岛生存时间的研究报道。聚乳酸-羟基乙酸(Poly-Lactic-Co-Glycolic Acid, PLGA)作为医用的生物可吸收高分子材料是目前生物降解高分子材料中最活跃的研究领域,已经获得美国食品与药品管理局(FDA)的许可。本研究将小鼠胰岛在PLGA-ECM (细胞外基质)支架的表面粘附生长,与成人脂肪来源干细胞(ATDSCs)共培养,探索更好的胰岛体外培养体系,以期用于移植的研究中。材料与方法将小鼠胰岛平面培养作为第1组；将小鼠胰岛种植在经表面处理的PLGA-ECM支架上进行体外培养,作为第2组；将PLGA-ECM-胰岛复合物与ATDSCs共培养作为第3组,探索ATDSCs以及支架对胰岛的影响。结果与平面培养组胰岛相比,倒置显微镜下可见两组PLGA-ECM支架上的胰岛形态完整,生长状态良好,胰岛能与支架紧密粘附,胰岛死亡少。双硫腙(DTz)染色后见两组PLGA-ECM支架上的胰岛纯度较好。吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)荧光双染色法检测结果显示,与ATDSCs共培养的PLGA-ECM支架上的胰岛的生存率最高。噻唑蓝比色法(MTT)结果显示,与ATDSCs共培养的PLGA-ECM支架与胰岛的生物相容性较好。扫描电镜下可见胰岛在两组的PLGA-ECM支架上能粘附生长,胰岛之间的间隙较大,支架上胰岛形态良好。激光共聚焦显微镜下可清楚的看到两组PLGA支架上绿色的胰岛β细胞和红色的胰岛a细胞。结论ATDSCs可作为胰岛的体外共培养的种子细胞,PLGA-ECM支架可作为胰岛的细胞外基质,为胰岛体外生存提供良好的生长环境。
王思涵[10]2013年在《Ⅰ.NRSF基因沉默促进干细胞向胰岛β样细胞分化的研究Ⅱ.小分子化合物Me6对辐射损伤组织的修复作用及其机制的研究》文中研究指明糖尿病是严重危害人类健康与生活质量的疾病之一，Ⅰ型糖尿病及Ⅱ型糖尿病晚期均以皮下注射外源性胰岛素治疗为主，但外源性胰岛素疗效并不十分理想。近些年来，胰腺的移植在临床上得到了广泛的应用，胰腺的移植可以在一定程度上改善糖尿病的并发症，并且可以在一定程度上恢复血糖的动态平衡，然而其手术复杂，并且具有一定的风险性[1]。胰岛细胞移植也是近几年来发展起来的一种新方法，它以分子生物学、免疫生物学及生物工程学为基础，相比胰腺移植而言，胰岛移植更加简单、安全，并且创伤小，恢复快，同时也可以在体外进行修饰，所以胰岛细胞移植成为了糖尿病治疗的热点[2,3]。然而胰岛细胞的供体较少，数量有限,不能满足临床应用的需要，于是人们开始寻找胰岛细胞的可替代资源。干细胞是一类具有无限增殖能力及多向分化潜能的细胞，可以分化为叁个胚层来源的多种组织细胞，在一定的诱导条件下可以被诱导成为包括胰岛细胞在内的多种细胞。然而近年来，国内外的研究及我们的实验结果表明来源不同的干细胞分化为胰岛β细胞使用的诱导方案虽然有所不同，但却面临相似的问题，即诱导的细胞很难体外分化成熟，多为胰岛前体细胞，同时表达几种标志，这些细胞移植体内需要较长时间分化成熟。因此，深入研究胰岛细胞发育成熟的分子机制，进一步寻找高效稳定的促进胰岛细胞分化成熟的新方案仍是目前的研究热点。在胰岛细胞的发育过程中，很多转录因子时空表达决定了胰岛细胞的分化成熟，如PDX-1、Neurogenin3、NeuroD、Pax4等[4]。近年来的研究表明，NRSF参与调控成熟胰岛细胞的胰岛素分泌功能。Abderrahmani等人的研究表明NRSF过表达的胰岛素瘤细胞系，其葡萄糖－胰岛素分泌耦联机制受到破坏[5]。深入研究发现神经特异蛋白complexin I调控了胰岛细胞葡萄糖诱导的胰岛素释放功能，而complexin I的表达则受到NRSF的转录负调控[6]。Martin等制作了胰岛细胞特异性过表达NRSF的转基因（胰岛素启动子-NRSF）小鼠，检测结果表明这些转基因小鼠的胰岛β细胞数量减少，胰腺总胰岛素含量减少两倍；由于其胰岛素分泌能力受损，所以这些小鼠也不能耐受高浓度的葡萄糖。深入研究发现参与调控胞吐作用的基因表达明显受到抑制，如SNAP25、SYTIV、SYTVII、SYTIX、complexin II等。这些研究结果提示NRSF参与调控了胰岛细胞的功能[7]。我们近期发表的研究结果表明，可卡因-安非他明调节的转录本（Cocaine-and amphetamine-regulated transcript，CART）基因也受到NRSF的调控[8]。该基因主要表达于神经内分泌细胞中，如神经元、垂体细胞、胰岛细胞等。有研究表明CART基因参与调控了葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能[9]。此外，我们还发现NRSF直接调控了人胰岛素基因的表达，人胰岛素启动子内存在NRSE序列，NRSF蛋白能与该序列结合并抑制人胰岛素启动子的转录活性[10]。NRSF的下调表达会明显上调胰岛素启动子的转录活性[11]。以上的研究结果提示我们：NRSF在胰岛β细胞中的消失可能是建立完全分化成熟、具有完好分泌反应的胰岛细胞所必需的。羊水往往是被人们作为医疗垃圾而丢弃的，然而羊水中也存在着大量的干细胞，在本文中，我们从羊水中分离出了羊水干细胞（AFSCs），并且对其进行了相关鉴定，表面其可以表达干细胞的表面标志SSEA-4、Nanog、Oct4等，同时我们也对其分化能力进行了鉴定，发现其可以向骨、神经及肝样细胞分化。然后，我们将NRSF干涉载体用慢病毒的方式转入羊水干细胞中，发现NRSF沉默表达后，胰岛相关基因Pax4及Insulin的表达明显升高，分别升高了约4.5倍、19.2倍。我们进一步对NRSF沉默表达的羊水干细胞进行两步法的诱导，发现在诱导的第7天时，细胞呈上皮样生长，在14天时已有部分细胞呈球状生长，与胰岛细胞的特性相似。通过对诱导的细胞进行干细胞表面标志的检测发现，该细胞已经失去了干细胞的特性，反而表达胰岛细胞的表面标志Pdx1、Insulin、C-peptide。用qRT-PCR的方法证实，NRSF沉默表达后，胰岛相关基因的表达明显的升高。NRSF促进干细胞向胰岛细胞分化，可能与其负性调控胰岛相关的靶基因有关。文献调研发现CART基因在胰岛细胞的糖反应性调节方面发挥重要作用。因此，我们推测NRSF可能调控了该基因。通过siRNA的实验我们发现，NRSF与CoREST、HDAC1、mSin3A共抑制蛋白共同参与了CART基因的转录调控。我们在细胞中过表达NRSF、CoREST、HDAC1、mSin3A基因，同样证实了CART基因转录调控过程中NRSF及共抑制因子CoREST、HDAC1、mSin3A扮演着重要的角色。随后我们又通过荧光素酶报告系统实验证实，NRSF是通过与CART基因启动子、内含子区NRSE结合后，招募形成相似但不相同的转录抑制复合体，发挥对CART基因的精密调控。通过这部分实验，我们对NRSF沉默表达能够促进干细胞向胰岛样细胞分化的机制有了很好的认识。近年来，随着科学技术的进步及迅速发展，核电的应用、核武器的研究、食品药品的灭菌以及多种肿瘤的放射治疗等，核能已经在国防、医疗、工业、农业等众多领域得到了广泛的应用。然而，在核能给人类带来巨大福祉的同时，也给当今世界带来了严重的核辐射的危害。现在，拥有核武器的国家在逐渐增多，这种核武器的加速扩散增加了爆发战争的危险，给社会带来了极大的不稳定因素。我们国家也是核大国，拥有核武器及核潜艇等核力量，同时，我们还建有大量的核电站，因而，防护核辐射，保障这些从业人员的身体健康拥有着至关重要的意义。随着医疗技术的发展，放射治疗技术在治疗恶性肿瘤以及其他一些疾病上得到了巨大的发展及应用。虽然现在的技术已经可以对特定部位或者肿瘤进行选择性的放射治疗，然而，放射治疗技术在对肿瘤细胞进行杀伤的同时，不可避免的对人体正常的组织及细胞也造成了一定的杀伤作用，极大的限制了放射治疗技术的发展。除了这些大剂量的辐射以外，我们周围环境中也存在着很多中低剂量的辐射。随着人们对电子产品越来越大的依赖，电脑、手机、微波炉等成为我们生活的必需品，然而，在这些产品给我们带来巨大方便的同时，我们经常处于这种具有辐射的环境里，身体无疑也会遭受一定的损害。2011年，日本福岛核电站核泄露事故不仅对部分人群造成了损伤，同时对周围大气及海洋环境带来了巨大的危害。这次核事故在苏联切诺贝利核电站核事故之后，再次引起了全世界人们对核事故核辐射的极大恐慌。因此，研究高效、低毒的辐射损伤防护剂及辐射损伤修复剂成为了国内外研究的一大热点。造血组织是辐射损伤最敏感的组织之一，其中骨髓造血功能在受到辐射损伤后的修复功能是非常缓慢的，可能贯穿于辐射损伤的始终，甚至可能导致急性放射病患者的死亡。外周血造血干细胞移植是挽救伤员生命的重要手段之一。为获得足够数量的外周血造血干细胞，造血动员剂的使用是必不可少的。目前，临床上使用的唯一一个造血干细胞动员剂是G-CSF，但其存在用药时间长、有毒副作用等缺陷。我们利用小鼠模型对一系列小分子化合物进行动员造血干细胞能力的筛选时发现了一种新型的小分子化合物Me6，它是一个生物碱类似物，具有复杂的氢键结合受体位点，经常被用作将过渡金属引入到疏水性的环境中的配体。然而，到目前为止，尚未报道Me6的生物学功能。通过研究，我们发现这种小分子化合物经单次皮下给药后可以快速、有效地动员白细胞及造血干/祖细胞。对外周血血常规分析后发现，在给药后的12小时就可以使小鼠骨髓中白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞的数量明显增多，分别达0小时的2.6、2.3、3.5倍。Me6还可以增加外周血及脾脏中造血干细胞的比例分别达2.0倍及3.6倍，而且并不会引起造血干细胞的凋亡。我们进一步检测了Me6对小鼠骨髓细胞的影响。我们的检测结果表明Me6可以增加小鼠骨髓细胞总数，可以增加骨髓中造血干/祖细胞的比例及数量。在Me6对人脐带血CD34+造血干/祖细胞作用的研究中我们发现，Me6可以有效的扩增人造血干细胞，并且促进其向巨核细胞的分化。Me6促进造血干/祖细胞增殖的研究结果提示其可能具有促进辐射损伤小鼠造血系统恢复的功能。我们通过对辐射损伤小鼠模型的研究中发现，小分子化合物Me6可以显着的提高致死剂量照射小鼠的生存率，其中对照组小鼠全部死亡，而Me6组小鼠仍有40%存活，同时与G-CSF组生存率为20%相比也有一定的升高。辐射损伤后小鼠外周血中白细胞、红细胞、血小板的数量会出现急剧的下降，而Me6组小鼠外周血中上述细胞的数量在辐射后的第4天就出现了显着的升高，并且在辐射后的第14天开始逐渐恢复，28天时已经接近正常的水平。通过对骨髓切片的HE染色我们可以发现，Me6可以促进辐射损伤骨髓组织的修复；对骨髓总有核细胞数进行分析的结果也很好的验证了这个观点，与对照组相比，Me6组小鼠骨髓细胞数增加了约3倍。同时，Me6也可以增加辐射损伤小鼠骨髓及外周血中造血干细胞比例及数量；结合BrdU掺入实验的结果表明，Me6能够促进骨髓及脾脏中造血干细胞的增殖。通过以上的研究，我们可以发现，小分子化合物Me6可以促进辐射损伤小鼠造血系统的再生修复。辐射不仅能够造成造血系统的损伤，肠道系统对辐射也极为敏感，极易受到电离辐射及核辐射的损伤。放射性肠病变具有剂量与时间依赖性，包括炎症，上皮再生，组织重塑和胶原沉积等复杂的病理生理的过程，并与此同时激活了凝血系统，其中值得关注的是内皮功能障碍。在包括小肠在内的许多正常组织中，内皮细胞参与了早期辐射和晚期辐射反应[1,2,3]。在小分子化合物Me6对辐射损伤小鼠小肠组织修复的研究中我们发现，Me6可以很好的促进辐射受损的小肠组织的修复，很好的保存了小鼠小肠绒毛及隐窝的完整性，使小肠绒毛细胞数明显增多，约为对照组的6倍；同时小肠绒毛及隐窝的长度也明显增长，分别约为对照组的2.9倍、1.7倍。为了更好的研究参与小肠损伤修复的细胞类型，我们构建了骨髓GFP阳性细胞嵌合的小鼠模型，对其进行辐射并用Me6进行皮下注射治疗。经Me6治疗的小鼠小肠切片中可以观察到更多的GFP阳性细胞，通过对这些细胞的进行进一步分析后可以看到，这群细胞大部分为表达CD105的内皮细胞。这些研究结果提示Me6可以促使辐射损伤的肠组织募集更多的骨髓来源的内皮或内皮祖细胞。我们分析了这些小鼠骨髓中的内皮祖细胞的情况，检测结果表明Me6组内皮祖细胞的比例明显增多，约为对照组的2.5倍；结合BrdU掺入实验，我们发现Me6可以有效的促进骨髓内皮祖细胞的增殖。随后我们又观察了其外周血中内皮祖细胞的比例，同样的发现了Me6组小鼠外周血中含有较多的内皮祖细胞（约为对照组的3.5倍）。同时，对MMP9基因敲除小鼠的研究发现，在进行辐射后，Me6并不会有效的促进其小肠组织的修复。通过以上实验我们可以初步认为小分子化合物Me6促进辐射损伤小鼠小肠组织修复的机制为：Me6促进小鼠骨髓内皮祖细胞的增殖，并通过上调MMP-9表达，促进内皮祖细胞动员至外周血，这些内皮祖细胞可以被募集到辐射受损的小肠组织，然后在其小肠绒毛间质中分化为内皮细胞，内皮细胞可以改善辐射受损小肠组织的微环境从而促进了其修复。
参考文献：
[1]. 胰腺内分泌前体细胞的培养及促成熟作用实验研究[D]. 王磊. 中国协和医科大学. 2004
[2]. 胰腺干细胞移植治疗1型糖尿病的动物实验研究[D]. 陈波. 山东大学. 2008
[3]. 诱导人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞分化及其机制研究[D]. 刘晓芳. 中国人民解放军医学院. 2013
[4]. 人骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的实验研究[D]. 辛颖. 吉林大学. 2007
[5]. 胰岛对胰腺干细胞促成熟作用及机制的实验研究[D]. 程志强. 山东大学. 2010
[6]. 人胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究[D]. 闫志风. 中国人民解放军军医进修学院. 2008
[7]. 胚胎干细胞移植治疗糖尿病的实验研究[J]. 闫志风, 李亚里, 彭红梅. 中国组织工程研究与临床康复. 2007
[8]. RNAi干扰树突状细胞CD40基因对移植排斥反应影响的体外研究[D]. 苏纪权. 吉林大学. 2007
[9]. 生物支架在干细胞分化及胰岛培养中的应用[D]. 蔺晨. 北京协和医学院. 2010
[10]. Ⅰ.NRSF基因沉默促进干细胞向胰岛β样细胞分化的研究Ⅱ.小分子化合物Me6对辐射损伤组织的修复作用及其机制的研究[D]. 王思涵. 中国人民解放军军事医学科学院. 2013
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