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报告型重组寨卡病毒的构建及在抗病毒药物筛选中的应用

2020-12-08阅读(924)

报告型重组寨卡病毒的构建及在抗病毒药物筛选中的应用

论文摘要

寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）是一种重要蚊媒传播的人兽共患病病原,人、灵长类以及兔和猪对其易感,其感染宿主后能引起寨卡热,大多数感染者并没有明显症状或者症状较为轻微,但若在妊娠期间发生ZIKV感染,则可能导致新生儿出生缺陷,同时还可能造成妊娠者发生流产和早产等严重症状。目前,ZIKV在全球范围内呈蔓延趋势,我国虽无相关重大疫情的报道,但有相关研究显示,新生仔猪对于ZIKV易感,这使我国生猪养殖业面临着重大经济损失的风险。ZIKV在全球范围内尚无特异性治疗药物,亦无人用ZIKV疫苗,因此,开展ZIKV相关防控研究迫在眉睫。本研究根据GenBank公布的ZIKV（FSS13025株）基因编码序列以及密码子优化技术,将ZIKV C、prM和E蛋白基因分别克隆到pMAL-c5x载体中,构建pMAL-c5x-ZIKV-C、pMAL-c5x-ZIKV-prM和pMAL-c5x-ZIKV-E原核表达质粒。将上述三种质粒分别转化至E.coli ER2523感受态细胞,经扩大培养至OD600为0.60.8时,加入终浓度为1.0 mM IPTG后继续震荡培养4 h后。经SDS-PAGE电泳及western blot鉴定,发现ZIKV C、prM和E蛋白均已正确表达。重组表达蛋白经MBP亲和层析柱纯化并鉴定正确后,将重组蛋白与MONTANIDETM ISA 61VG佐剂按重量比为6:4比例充分乳化,以免疫剂量为300μg/只进行背部皮下多点注射免疫新西兰大白兔,IFA和western blot结果显示,成功制备了C、prM和E蛋白多克隆抗体。为了拯救重组ZIKV与报告型ZIKV-GFP病毒,本研究根据ZIKV基因序列,构建了复制子重组质粒pZIKVrepdCME-GFP以及pCIneo-ZIKV-CME质粒,将pCIneo-ZIKV-CME质粒PCR扩增产物和经Xhol I线性化的pZIKVrepdCME-GFP复制子质粒共转染293T细胞,拯救ZIKV重组病毒。经电镜观察、病毒噬斑实验、western blot和IFA鉴定,结果显示成功拯救出了重组ZIKV。重组ZIKV病毒生长曲线测定实验显示,在24 h-72 h之间,重组ZIKV病毒滴度总体呈上升趋势,到72 h时病毒滴度达最大,到96 h-144 h总体呈下降趋势。同时,本研究在已知黄病毒C蛋白完整性会对病毒的复制产生一定影响的基础上,我们探究了ZIKV C蛋白的N端氨基酸序列长度对病毒的复制产生的影响:ZIKV C蛋白N端38个氨基酸序列的保留对于报告型报告型ZIKV-GFP病毒的拯救具有积极意义,因此,我们构建了pCIneo-ZIKV-C38-GFP-CME质粒,将pCIneo-ZIKV-C38-GFP-CME质粒PCR扩增产物和经Xhol I线性化的pZIKVrepdCME-GFP复制子质粒也共转染于293T细胞,电镜和噬斑试验结果显示报告型ZIKV-GFP病毒拯救成功,且报告型ZIKV-GFP病毒生长曲线测定实验显示,在24 h-72 h之间,报告型ZIKV-GFP病毒病毒滴度总体呈上升趋势,到72 h时病毒滴度达最大,到96 h-144 h总体呈下降趋势。进一步分析了报告型ZIKV-GFP病毒感染BHK-21、Vero、huh-7、A549细胞后绿色荧光强度情况:报告型ZIKV-GFP病毒在BHK-21细胞中荧光强度较为均一且相对于Vero细胞更强,但荧光数量少,然而,报告型ZIKV-GFP病毒接种A549和Huh-7细胞不仅需要大剂量而且荧光强度很不均一,因此本研究利用BHK-21细胞将pCAG-DC-SIGNR质粒用以构建稳定表达DC-SIGNR（一种可以提高囊膜病毒感染性的细胞表面的附着因子）的细胞系（BHK-DR）。报告型ZIKV-GFP病毒在BHK-DR细胞中荧光强度较强且分布均一,这为通过利用高内涵筛选系统在BHK-DR细胞中筛选抗ZIKV药物提供了有利条件。将已报道的具有抗ZIKV的药物ribavirin、chloroquine和6-Azauridine利用报告型ZIKV-GFP病毒进行验证,实验结果与其报道一致,表明所拯救的报告型ZIKV-GFP病毒系统可以用于抗病毒药物筛选。本研究进一步利用报告型报告型ZIKV-GFP病毒系统对一种包含974种来源于植物的药物库进行筛选,经过初步筛选,进一步验证筛选,结果发现编号为:2X7、2X11、6X6、12X3、11X9的五种药物对ZIKV具有很好的抑制效果。综上所述,本研究成功制备了ZIKV C、prM和E蛋白多克隆抗体,为进一步开展ZIKV研究工作提供了基础。成功构建了ZIKV反向遗传操作平台,拯救了巴西流行株ZIKV以及表达GFP的报告型病毒,为进一步开展病毒的致病机制研究,开发疫苗研究等提供基础。建立了抗病毒药物筛选平台,初步筛选出了在细胞水平具有抗ZIKV活性的天然植物来源的5种药物。本研究为进一步开展ZIKV防控研究工作提供了重要基础。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 英文缩略表
  • 第一章 引言
  •   1.1 ZIKV分子生物学特征
  •     1.1.1 ZIKV的物理特征及基因组结构
  •     1.1.2 ZIKV蛋白的功能与特点
  •   1.2 ZIKV致病机理研究
  •   1.3 ZIKV流行病学及防控
  •     1.3.1 ZIKV流行病学
  •     1.3.2 ZIKV的诊断
  •     1.3.3 ZIKV的疫苗研究
  •     1.3.4 ZIKV反向遗传学研究
  •     1.3.5 抗ZIKV的药物研究
  •   1.4 研究目的和意义
  • 第二章 寨卡病毒结构蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制备
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 主要材料、试剂
  •     2.1.2 实验仪器
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 ZIKV结构蛋白C、prM和 E全长c DNA原核表达质粒的构建
  •     2.2.2 ZIKV C、prM和 E结构蛋白的原核表达
  •     2.2.3 ZIKV C、prM和 E结构蛋白western blot鉴定
  •     2.2.4 ZIKV C、prM和 E结构蛋白的表达与纯化
  •     2.2.5 ZIKV结构蛋白C、prM和 E多克隆抗体的制备
  •     2.2.6 多克隆抗体免疫反应性及效价检测
  •   2.3 结果
  •     2.3.1 表达ZIKV结构蛋白C、prM和 E全长c DNA的鉴定
  •     2.3.2 ZIKV C、prM和 E结构蛋白的表达
  •     2.3.3 ZIKV C、prM和 E结构蛋白的鉴定
  •     2.3.4 ZIKV C、prM和 E结构蛋白的纯化
  •     2.3.5 多克隆抗体免疫反应性检测
  •     2.3.6 多克隆抗体IFA检测ZIKV
  •   2.4 讨论
  • 第三章 稳定表达DC-SIGNR的 BHK-21 细胞系的构建
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 主要材料与试剂
  •     3.1.2 实验仪器
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 表达DC-SIGNR质粒的构建
  •     3.2.2 pCAG-DC-SIGNR质粒的提取
  •     3.2.3 质粒的转染
  •     3.2.4 转染细胞的筛选与克隆纯化
  •   3.3 实验结果
  •     3.3.1 DC-SIGNR表达质粒的构建
  •     3.3.2 转染细胞的IFA鉴定
  •   3.4 讨论
  • 第四章 寨卡病毒及报告型寨卡病毒的反向遗传操作拯救与应用
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 主要材料、试剂
  •     4.1.2 实验仪器
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 ZIKV复制子、pCIneo-ZIKV-CME和 pCIneo-ZIKV-C38-GFP-CME质粒的构建
  •     4.2.2 重组ZIKV的拯救
  •     4.2.3 重组ZIKV的鉴定
  •       4.2.3.1 重组ZIKV E结构蛋白的IFA与 western blot检测
  •       4.2.3.2 重组ZIKV电镜鉴定
  •       4.2.3.3 重组ZIKV感染BHK-21、Vero和 BHK-DR细胞的噬斑形成
  •       4.2.3.4 重组ZIKV生长动力学曲线测定
  •     4.2.4 报告型ZIKV-GFP病毒的拯救
  •       4.2.4.1 报告型ZIKV-GFP病毒C蛋白N端38 个氨基酸基因序列的确定
  •       4.2.4.2 报告型ZIKV-GFP病毒的拯救
  •       4.2.4.3 报告型ZIKV-GFP病毒在不同细胞中的感染特性
  •       4.2.4.4 报告型ZIKV-GFP病毒电镜鉴定
  •       4.2.4.5 报告型ZIKV-GFP病毒感染BHK-DR细胞的噬斑形成
  •       4.2.4.6 报告型ZIKV-GFP病毒生长动力学曲线测定
  •     4.2.5 抗病毒药物抑制实验
  •     4.2.6 植物源抗病毒小分子化合物筛选实验
  •   4.3 结果
  •     4.3.1 ZIKV复制子、pCIneo-ZIKV-CME和 pCIneo-ZIKV-C38-GFP-CME质粒的构建
  •     4.3.2 重组ZIKV结构蛋白的IFA与 western blot检测
  •     4.3.3 重组ZIKV电镜鉴定
  •     4.3.4 重组ZIKV感染细胞的形成噬斑
  •     4.3.5 重组ZIKV生长动力学曲线测定
  •     4.3.6 报告型ZIKV-GFP病毒拯救
  •       4.3.6.1 报告型ZIKV-GFP病毒C蛋白N端38 个氨基酸基因序列的确定
  •       4.3.6.2 报告型ZIKV-GFP病毒在不同细胞中的感染特性
  •       4.3.6.3 报告型ZIKV-GFP病毒电镜鉴定
  •     4.3.7 报告型ZIKV-GFP病毒感染细胞的形成噬斑
  •     4.3.8 报告型ZIKV-GFP病毒生长动力学曲线测定
  •     4.3.9 抗病毒药物实验
  •     4.3.10 植物源抗病毒小分子化合物筛选实验
  •   4.4 讨论
  • 第五章 全文结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 张经伟

    导师: 华荣虹

    关键词: 寨卡病毒,多克隆抗体,细胞系,反向遗传学,抗病毒药物筛选

    来源: 中国农业科学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 中国农业科学院

    分类号: S852.65

    总页数: 68

    文件大小: 6384K

    下载量: 128

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