羊传染性脓疱病毒及羊痘病毒双重荧光PCR方法的建立与应用

论文摘要

羊传染性脓疱和羊痘在世界范围内普遍存在,尤其是在我国已成常见病、多发病。羊传染性脓疱病毒和羊痘病毒都属于痘病毒科,都是双链DNA病毒,急性和高度接触性传染病,病毒传播迅速,具有很强的破坏性。对羊产业的发展和畜牧经济都造成惨重的损失。由于羊传染性脓疱和羊痘在临床上发病特征相似,在血清学试验上可能发生交叉反应,很难鉴别分辨,因此,本研究建立了一种方便快捷的双重荧光PCR检测方法,对羊传染性脓疱病毒和羊痘病毒进行高效、准确的鉴别诊断,为我国养羊业发展贡献力量。共分为以下五部分:1.参照GenBank中ORFV全基因序列（NC005336）,使用DNAStar中的MegAlign软件,对序列进行排列、分析和对比,选取羊传染性脓疱病毒高度保守片段ORFV059,利用Primer Express 3.0.1软件设计荧光PCR引物和探针的设计,扩增片段为63bp。另根据GenBank中Goatpox virus Iraq61分离株（登录号GU119941）OPR30蛋白的基因序列构建反应模板,根据《OIE陆生动物诊断实验和疫苗手册》设计引物和探针,并通过Blast评估和比较,从而保证其特异性,扩增片段为102bp。在检测ORFV的探针5’端标记了FAM荧光素,3’端标记为TAMRA荧光素,在检测GTPV的探针5’端标记HEX荧光素,3’端标记TAMRA荧光素。2.提取病毒核酸作为双重荧光定量PCR的反应模板。3.优化双重荧光定量PCR的引物和探针的反应浓度及用量,从而筛选出最佳浓度比。4.扩增目的片段,连接到PMD18-T载体,用DH5-α进行转化,提取质粒以建立标准品。5.对双重荧光定量PCR检测方法的特异性、灵敏性和重复性进行测定。结果表明:只有具有特异性片段的设计出的引物和模板才可扩增出目的片段。用此方法检测小反刍兽疫、小反刍兽疫、口蹄疫、布鲁氏菌病、羊巴氏杆菌病、羊大肠杆菌病等均为阴性,说明特异性良好;对梯度稀释的病毒阳性质粒检测可知ORFV和GTPV最低可检测出10个拷贝。从吉林省各养殖场收集疑似病料256份,利用双重荧光定量PCR检测出ORFV阳性20份,GTPV阳性39份,阳性检出率与国家行业标准比对结果相近,证明该方法可行。

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 岳帅

导师: 王龙涛

关键词: 羊传染性脓疱病毒,羊痘病毒,双重荧光定量

来源: 吉林农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27163/d.cnki.gjlnu.2019.000129

总页数: 47

文件大小: 1474K

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