Weili, Jiang, Jinxin, Chu, Jie, Yang, Pengyu, Zang, Lijie, Gao[1]2018年在《The influence of different monodentate P-ligand mixtures on Rh-catalyzed 1-butene hydroformylation》文中进行了进一步梳理人Fas配体cDNA的克隆，表达对HepC2细胞系细胞凋亡影响
王萍[2]2007年在《人参总皂苷和小檗碱对肿瘤主动性免疫逃逸机制的影响》文中指出免疫逃逸(immune escape)在肿瘤的发生、发展过程中有着重要的作用,其机制复杂,涉及肿瘤和宿主两方面。从肿瘤角度来说,一方面,肿瘤抗原的缺失、MHC分子的改变、共刺激分子的缺乏等可以使肿瘤免受宿主免疫细胞的识别,从而逃脱抗肿瘤免疫反应;另一方面,肿瘤也可以通过“Fas反击机制”、免疫抑制性分子的分泌等机制主动影响抗肿瘤免疫细胞的增殖活化或功能。人参总皂苷(Gs)、小檗碱(Ber)分别是补益药人参和清热解毒药黄连等的组分,抗肿瘤作用明显。Gs和Ber的抗肿瘤作用机制主要是抑制增殖、诱导凋亡,抑制侵袭和转移,诱导分化等方面,在肿瘤免疫逃逸机制方面的研究尚未见报道。本研究观察了Gs和Ber对人肺癌PG细胞抑制Jurkat T淋巴细胞增殖和促进其凋亡的影响,以及对PG细胞FasL、Fas分子的表达及其TGF-β1、PGE2分泌的作用,以探讨Gs和Ber对肿瘤细胞主动性免疫逃逸机制的影响,为Gs和Ber的抗肿瘤作用机制扩展新的研究内容,并为药物的合理运用提供实验依据。本研究运用人参总皂苷和小檗碱处理肺癌PG细胞24h后进行实验,分组如下:Control组(PG细胞未经药物处理),Gs组(PG细胞经100μg/ml人参总皂苷处理)和Ber组(PG细胞经10μg/ml小檗碱处理)。1.首先建立PG细胞与Jurkat T细胞的共培养体系,观察Jurkat T细胞的生长状况和增殖情况。(1)倒置显微镜下直接观察到,Jurkat T细胞在单独培养情况下成团生长,而Jurkat T细胞与PG细胞共培养24h后呈散在生长;Jurkat T细胞与Gs组和Ber组PG细胞共培养后数目均较Control组明显减少。(2)台盼兰拒染实验结果显示,共培养6h、24h后,Jurkat T细胞活细胞数目明显减少,与单独培养组(Jurkat T组)有统计学差异(P<0.05);而Jurkat T细胞与Gs组PG细胞共培养6h、24h后其生长抑制均较Control组明显,Jurkat T细胞与Ber组PG细胞共培养24h后其生长抑制也与Control组有统计学差异(P<0.01);(3)PG细胞培养上清液与Jurkat T细胞孵育实验结果表明,各组PG细胞培养上清液与T细胞悬液(细胞数不变)的体积比为2:1、1:1、0.5:1时,Jurkat T细胞的生长均受到抑制,大部分组与阴性对照组(Jurkat T组)比较有统计学差异,且呈体积依赖性;各不同体积比组中,Gs组、Ber组与Control组比较均无差异。结果提示,PG细胞对Jurkat T细胞的生长有抑制作用,此作用在人参总皂苷和小檗碱处理PG细胞后更为显着。2.分别用形态学方法和流式细胞术观察和检测了共培养体系中Jurkat T细胞的凋亡。(1)Giemsa染色结果显示,单独培养的Jurkat T细胞形态均一,呈球形,核大,几乎占据整个胞浆,呈均匀的紫黑色;共培养组Jurkat T细胞形态不均一,不规则细胞增多,核可见裂纹及固缩现象;(2)在荧光显微镜下,吖啶橙染色显示:单独培养组Jurkat T细胞的细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光,圆形,形态均一,胞浆呈橘红色或荧光不明显;共培养组Jurkat T细胞形态不均一,可见细胞核绿色荧光呈半月型等固缩形态,并可见呈现弱荧光的细胞。(3)流式细胞术检测结果表明,Jurkat T细胞在单独培养条件下的自然凋亡率较低(早期凋亡率为:5.57%,中晚凋亡率为:4.67%),而各共培养组均表现出较高的凋亡率(早期凋亡率>10%,而中晚期凋亡率为50%左右),两者不管在早期或中晚期差异均有极显着性;而共培养Gs组的Jurkat T细胞早期凋亡率为15.79%,与Control组比较(11.40%)有统计学差异(P<0.05),Ber组凋亡率与对照组无差异;而Gs组、Ber组Jurkat T细胞的中晚期凋亡率与Control组比较差异不明显,但Gs组与Ber组的总凋亡率,即各期凋亡率总和,与Control组比较均有差异(P<0.01,P<0.05)。结果提示,PG细胞可以诱导Jurkat T细胞的凋亡,Gs和Ber均可以促进PG细胞诱导Jurkat T细胞的凋亡。3.免疫细胞化学法检测PG细胞FasL、Fas分子的表达。结果如下(1)肺癌PG细胞有FasL分子的表达,主要分布在胞浆;Gs和Ber均可使PG细胞FasL分子的阳性表达增强。(2)Fas分子在PG细胞也有表达,主要分布在胞浆,胞膜亦有表达;Gs和Ber对Fas分子表达无明显影响。(3)FasL、Fas分子表达的图像分析结果表明,Gs和Ber对FasL分子的表达有上调作用,与对照组比较差异有显着性(P<0.05, P<0.01);Gs对Fas的表达亦有上调作用,而Ber无影响。结果提示,PG细胞有FasL、Fas分子的表达;Gs和Ber能促进FasL和/或Fas的表达。4.运用ELISA法和放射性免疫法分别检测PG细胞培养上清液中转化生长因子β1(TGF-β1)和前列腺素E2(PGE2)的含量。结果显示,PG细胞可分泌TGF-β1和PGE2,100μg/mlGs和5μg/ml、2.5μg/ml Ber均可以促进TGF-β1的分泌;但Gs和Ber各浓度组均对PGE2的分泌无影响。结果提示,PG细胞能分泌TGF-β1和PGE2,Gs和Ber可以促进TGF-β1的分泌,而对PGE2无影响。上述结果表明,肺癌PG细胞能抑制共培养的Jurkat T细胞的增殖并诱导其凋亡,而Gs和Ber能增强肿瘤PG细胞的这种作用,其机制可能与Gs和Ber上调PG细胞凋亡相关分子FasL、Fas的表达以及增加免疫抑制性细胞因子TGF-β1的分泌有关。因此推断,人参总皂苷和小檗碱在抗肿瘤的同时也有可能促进肿瘤的免疫逃逸。
陈凤琴, 王宏伟, 李海龙, 麦平, 卢启明[3]2015年在《黄芩苷通过死亡受体通路诱导胃癌MGC-803和BGC-823细胞凋亡》文中研究表明目的:探讨黄芩苷对胃癌MGC-803和BGC-823细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:10、20、40、80、160和320μmol/L的黄芩苷分别作用MGC-803和BGC-823细胞24、48、72和96 h后,应用MTT法检测细胞的增殖情况。80、120和160μmol/L的黄芩苷处理MGC-803和BGC-823细胞48 h后,应用FCM法检测细胞的凋亡率,实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法分别检测细胞中自杀相关因子(factor associated suicide,FAS)、自杀相关因子配体(factor associated suicide ligand,FASL)、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)、caspase 3和caspase 8 m RNA及蛋白的表达水平。结果:10~160μmol/L的黄芩苷可抑制MGC-803和BGC-823细胞的增殖,且呈现浓度和时间依赖性(P值均<0.01)。80、120和160μmol/L的黄芩苷均可诱导MGC-803和BGC-823细胞的凋亡,且有浓度依赖性(P值均<0.01)。80、120和160μmol/L的黄芩苷处理后,MGC-803和BGC-823细胞中FAS、FASL、TRAIL、caspase 3和caspase 8 m RNA及蛋白的表达水平均上调(P值均<0.01)。结论:黄芩苷可抑制胃癌细胞的增殖并诱导其凋亡,这一作用可能与死亡受体通路有关。
郑品劲[4]2016年在《胆固醇—半乳糖苷配体修饰紫杉醇脂质体的制备及其抑制HepG2肿瘤细胞的研究》文中进行了进一步梳理目的：半乳糖受体是一种广泛分布在哺乳动物肝实质细胞的受体,又被称为去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein receptor, ASGPR),能够应用于构建肝细胞特异性靶向脂质体。紫杉醇(Paclitaxel, PTX)是红豆杉中提取的四环二萜类化合物,是一种广谱抗癌药物；临床研究表明对肝癌细胞的杀伤能力可与氟尿嘧啶相当而副作用较小。探究紫杉醇纳米制剂对肝癌的治疗是目前紫杉醇研究开发的新目标。本课题首先酶促合成胆固醇-半乳糖苷,将其作为配体制备胆固醇-半乳糖苷修饰紫杉醇配体脂质体,利用半乳糖配体的肝靶向性,使修饰物在肝脏富集,更有效地发挥紫杉醇抗肝癌的作用；同时,考察该配体脂质体的处方、制备工艺、基本理化性质和稳定性,并且以紫杉醇注射液和普通紫杉醇脂质体为参比制剂,对该配体脂质体的体内药物动力学、组织分布、体外的抑制肿瘤细胞活性进行深入探讨,为紫杉醇开发成抗肝癌新型靶向制剂提供理论支撑。方法：1.胆固醇-半乳糖苷的酶促合成、分离纯化、结构表征及稳定性考察以吡啶：丙酮(2：1,v/v)混合溶剂作为溶媒,利用Novozym 435固定化脂肪酶的催化,在一定温度下,乳糖醇与胆固醇癸二酸二乙烯单酯酯化生成胆固醇-半乳糖苷配体。采用单因素考察分析各因素对该酶促酯化反应的影响规律,Box-Behnken效应面法设计进一步优化工艺参数。通过层析柱分离纯化产物；建立胆固醇-半乳糖苷含量的HPLC分析方法；利用TLC、MS、IR、NMR等技术分析鉴定产物结构特征。通过影响因素、加速试验考察该配体的稳定性。2.胆固醇-半乳糖苷修饰的紫杉醇配体脂质体的制备及理化性质研究在脂质材料中加入适当比例(w%)的胆固醇-半乳糖苷,采用薄膜分散法,水化孵育、超声、微孔滤膜过滤后,制备了紫杉醇配体脂质体；通过单因素考察和正交设计法,优选最佳处方,获得质优、稳定的脂质体;考察紫杉醇配体脂质体的外观、粒径、zeta电位、包封率。3.紫杉醇配体脂质体在SD大鼠体内的药物动力学及KM小鼠组织分布学研究以紫杉醇(Paclitaxel, PTX)为目标药物,制备PTX-i普通注射液、PTX-L普通脂质体和Gal-PTX-L配体脂质体叁种制剂；SD大鼠、KM小鼠作为动物模型,通过尾静脉注射方式给药,分别考察这叁种紫杉醇制剂在机体内的药物动力学参数,以及在心、肝、脾、肺、肾等组织的分布；利用甲基叔丁基醚(MTBE)萃取法分离出血浆中的PTX,以多烯紫杉醇(Docetaxel, DOC)为内标物计算PTX血药浓度；DAS 2.1软件分析药物动力学数据。4.紫杉醇配体脂质体的体外抗HepG2细胞活性研究在体外抗肿瘤试验中,大量培养人肝癌细胞HepG2细胞株,接种适量HepG2细胞于96孔培养板,实验分四组：阴性对照组、PTX注射液组、PTX-1组、Gal-PTX-L组,以给药24-48-72 h后,通过CCK(四唑单钠盐类)法和LDH(乳酸脱氢酶)法分别测定细胞存活率、叁种含紫杉醇的药物的IC50和细胞释放的LDH活性(IU/L),进而综合评价该Gal-PTX-L制剂的抗肿瘤疗效优势。结果：1.胆固醇-半乳糖苷的酶促合成、分离纯化、结构表征及稳定性利用酶法成功制备了胆固醇-半乳糖苷配体,考察了酶的种类、加酶量、反应介质、反应温度、底物摩尔比、反应时间等单因素对酶催化的影响,建立了Box-Behnken效应面模型,获得最优反应条件：乳糖醇(Lactitol, LA)与胆固醇癸二酸单烯酯(Cholesteryl hemi-vinyl sebacate, CHS-DD)摩尔比1：3.7,Novozym 435 22.8 mg,吡啶：丙酮(2:1,V/V) 2.1 mL,温度55℃,反应时间31.2 h,该条件下产率可达94%以上。通过简单的柱层析流程,分离纯化胆固醇-半乳糖苷配体分子。经过TLC、MS、IR、NMR等技术,确证了产物的结构特征。根据影响因素试验的结果,该配体的包装应密封,放置在干燥、阴凉、避光处。2.胆固醇-半乳糖苷修饰的紫杉醇配体脂质体的制备及理化性质研究以紫杉醇(PTX)为目标药物,制得PTX普通脂质体、PTX半乳糖基化脂质体。建立了脂质体中包合的PTX的HPLC含量测定法,通过线性、专属性、精密度、回收率、重复性和稳定性考察,证明该方法适用、可靠。选取药脂比、磷脂与胆固醇比和胆固醇-半乳糖苷用量(w%)为考察对象,包封率(%)为评价指标,设计正交试验优化脂质体制备工艺参数,获得最佳工艺条件为：磷脂与药物的质量之比为4：1,磷脂与胆固醇的质量之比为5：1,胆固醇-半乳糖苷用量(w%)为8%。在最优工艺下,制备叁份样品,显示包封率86%以上,粒径保持在160nm左右。3.紫杉醇配体脂质体在SD大鼠体内的药物动力学及KM小鼠组织分布学研究首先建立了血浆中PTX浓度的LC-MS/MS测定方法,通过方法学考察证明了该方法适用、可行；考察了血液样品的萃取药物方法,证实甲基叔丁基醚萃取效果更佳,符合分析的要求；叁种制剂经大鼠尾静脉给药(5mg/kg)后,半衰期T1/2z(h)分别是4.26±0.72 (PTX-i),2.83±1.28 (PTX-L),3.32±2.05 (Gal-PTX-L);表观分布容积Vz(L/kg)分别是9.44±2.28 (PTX-i),3.89±1.03 (PTX-L),16.11±6.23 (Gal-PTX-L);清除率CLz(L/h/kg)分别为1.46±0.17 (PTX-i),1.12±0.35 (PTX-L),4.06±1.55(Gal-PTX-L)。另外,经小鼠尾静脉给药后,紫杉醇普通脂质体、紫杉醇配体脂质体肝靶向参数Re分别是0.105和4.103；Te(%)为3.083和56.112；RTe为0.117和2.105；Ce为0.109和3.298。4.紫杉醇配体脂质体的体外抗HepG2细胞活性研究在0.1μg/mL剂量下,PTX-i组、PTX-L组、Gal-PTX-L组的24h细胞存活率分别为：50.08%,26.25%和11.38%；48h细胞存活率各是：45.84%,32.25%和19.17%；72h细胞存活率为：43.03%,28.45%和24.85%。另外,叁组药物的IC50分别是0.438μg/mL,0.121μg/mL和0.037μg/mL。药物干预后叁组药物的培养液中24 h LDH的活性分别是20.14 IU/L,27.67 IU/L和39.37 IU/L;48h LDH的活性分别是34.60 IU/L,51.74 IU/L和65.11 IU/L; 72h LDH的活性分别为48.98 IU/L,65.20 IU/L和80.91 IU/L。结论：综上所述,胆固醇-半乳糖苷的合成及其紫杉醇配体脂质体的研究,提供了一种新颖、高效和稳定的将半乳糖基化脂质体药物运送至HepG2靶细胞并发挥抗肿瘤活性的途径。通过药物动力学和组织分布研究,确认了紫杉醇配体脂质体比普通制剂具有更好的肝靶向性,更容易在肝脏蓄积;在体外抗肝肿瘤细胞研究中,表明紫杉醇配体脂质体能够发挥良好抑制肝肿瘤细胞生长的疗效,差异具有统计学意义(P<0.01)。因此,我们有理由相信紫杉醇配体脂质体在肝病治疗中拥有广阔的应用前景。
刘韬[5]2017年在《聚合物接枝型疏水性电荷诱导层析介质设计及蛋白质吸附机理研究》文中研究说明疏水性电荷诱导层析(Hydrophobic charge-induction chromatography,HCIC)是一种新型抗体分离技术,其配基兼有疏水、静电、氢键等多种相互作用,具有选择性好、耐盐性高、洗脱条件温和以及价格相对低廉等特点,已有一些成功应用实例。由于配基与抗体结合力较弱,使得HCIC介质在高流速下对抗体的动态结合载量较低,而聚合物接枝的离子交换层析介质可以显着提高蛋白的吸附容量、传质速率和动态结合载量。因此本文以高效抗体分离为目标,设计并制备了两种聚合物接枝型HCIC介质,比较蛋白吸附和传质性能,分析层析过程的固相条件(聚合物接枝、配基密度、接枝密度)和液相条件(pH和添加盐)的影响,并借助逆体积排阻层析(Inverse size exclusion chromatography,ISEC)、等温滴定量热仪(Isothermal titration calorimetry,ITC)和共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)进行了微观分析,以指导新型介质设计。主要结果如下:首先以葡聚糖接枝的琼脂糖凝胶为基质,以2-巯甲基咪唑(MMI)为配基,优化了配基偶联条件,制备了不同配基密度的葡聚糖接枝MMI介质。相比非接枝MMI介质,配基密度提高了 50%左右,达到2000μmol/g。以hIgG为模型蛋白,考察了系列葡聚糖接枝MMI介质的静态吸附、吸附动力学和层析柱动态吸附性能。结果表明,在近中性pH下,葡聚糖接枝介质对蛋白的吸附容量、结合力、传质速率和动态结合载量随着配基密度增加而持续增加,葡聚糖接枝MMI介质相比非接枝MMI介质具有更高的蛋白吸附容量、传质速率和动态结合载量。在pH 7.0～8.9时,饱和吸附容量保持在107.5～110.0 mg/g,受pH影响较小;在100 cm/h线性流速下hIgG动态结合载量达到38.3mg/g;在弱酸性条件下,葡聚糖接枝MMI介质的蛋白吸附容量和传质速率下降更显着,有利于蛋白解吸。此外,葡聚糖接枝MMI介质吸附能力受盐浓度的影响较小,但传质速率受盐浓度的影响较大。其次,针对葡聚糖接枝介质中HCIC配基同时存在于接枝层和基质孔道表面上的局限,利用表面引发的电子转移再生活化剂的原子转移自由基聚合反应,制备了不同接枝密度和配基密度的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)接枝MMI介质。结果表明,高接枝密度和中等配基密度的聚GMA接枝MMI介质对hIgG具有更高的饱和吸附容量和传质速率。相比葡聚糖接枝MMI介质以及商业化HCIC介质MEP HyperCel,聚GMA接枝介质对hIgG具有更高动态结合载量。hIgG动态结合载量受流速影响较小,线性流速300 cm/h下可达34.6 mg/g,且具有明显的pH依赖吸附和耐盐吸附特性。此外,考察了从混合蛋白体系(hIgG/HSA=1:4)中分离hIgG和从CHO细胞培养液中分离单克隆抗体,聚GMA接枝HCIC介质均表现出良好的抗体分离和重复使用性能,50个周期循环使用的抗体纯度和收率分别稳定在98.5～99.8%和 90.2～96.9%。最后,为了从微观尺度揭示聚合物接枝MMI介质的吸附及传质机制,利用ISEC考察了介质孔结构的影响,利用ITC研究了不同蛋白(hIgG和BSA)的吸附热,利用CLSM实时观测了单个介质颗粒内蛋白的吸附、传质及洗脱过程。ISEC结果表明,不加盐时葡聚糖接枝链和聚GMA接枝链在基质表面形成叁维空间分布,有助于提高蛋白吸附容量;高盐浓度下,接枝链出现塌缩,且葡聚糖链的塌缩程度更明显,削弱了链传递效应,降低了蛋白传质速率。ITC结果表明,对于hIgG,在pH 8时,配基密度和盐浓度的增加会显着增加葡聚糖接枝MMI介质吸附hIgG的焓变和熵变,说明疏水相互作用增强;弱酸条件下,焓变和熵变急剧下降为负值,说明静电排斥作用主导了蛋白的解吸;对于BSA,吸附容量随着盐浓度的增加而显着下降,且焓变和熵变值为负,表明主要通过静电吸引力吸附BSA。CLSM结果表明,hIgG和BSA在葡聚糖接枝、聚GMA接枝和非接枝MMI介质内,均体现出均质扩散控制的传质机理;hIgG在高配基密度葡聚糖接枝和中等配基密度聚GMA接枝MMI介质内体现了更高的荧光强度;相比hIgG,BSA达到MMI介质内核所需时间更短;pH4.0时,中等配基密度聚GMA接枝MMI介质内的荧光强度下降最为明显;以上结果与宏观吸附、传质及分离性能相匹配。本文从提高HCIC介质的蛋白载量出发,制备了两种新型聚合物接枝HCIC介质,探讨了聚合物接枝、配基密度、接枝密度、pH、添加盐和蛋白性质对聚合物接枝HCIC介质吸附和传质性能的影响,并利用ISEC、ITC、CLSM等手段从微观角度揭示了蛋白吸附和传质机理,结果显示孔内接枝可以明显提高HCIC介质对抗体的吸附容量、传质速率及动态载量,显示出良好的抗体分离应用前景。
陈义军, 章翔, 步星耀, 王占祥, 张旭[6]2000年在《人脑胶质瘤Fas和Fas Ligand的表达》文中研究说明目的 探讨 Fas受体配体系统在胶质瘤凋亡调变中的作用和意义 .方法 应用免疫组织化学技术对 34例胶质瘤中 Fas和 Fas L igand的表达及其意义进行了研究 .其中低恶性胶质瘤 1 8例 ,高恶性 1 6例 .结果 Fas在部分胶质瘤中有表达 ,其在高分化的 ～ 级胶质瘤的免疫反应阳性率明显低于 ～ 级胶质瘤 (P<0 .0 1 ) .Fas L 在各型胶质瘤中均有表达 ,其表达强度与胶质瘤的良、恶性程度无明显相关 (P>0 .0 5 ) .结论 Fas- Fas L 系统在胶质瘤凋亡调变的过程中可能起较重要的作用 ,Fas可辅助临床判断胶质瘤的良、恶性程度 .
丁尔迅, 王强, 陈学云, 付志仁[7]2001年在《Fas配体在大肠癌细胞中的表达》文中研究表明目的 研究 Fas配体在大肠癌细胞中的表达。方法 分别采用反转录 -聚合酶链反应和流式细胞仪技术检测了大肠癌细胞株中 Fas配体 m RNA和细胞表面蛋白的表达。结果 在检测的六株大肠癌细胞中 ,全部表达 Fas配体m RNA;部分表达 Fas配体细胞表面蛋白。结论 至少部分大肠癌细胞表达 Fas配体 ,并可能以此反击机体免疫系统 ,逃避免疫监督
季韶洋[8]2008年在《TNFRSF11B（OPG）蛋白功能结构域的研究》文中指出Tnfrsf11b蛋白是1997年新发现的肿瘤坏死因子受体超家族的一个新成员,被称为破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor, OCIF或称osteoprotrgerin, OPG),是一种可以抑制骨的破坏和吸收的分泌型糖蛋白,它可以抑制破骨细胞的分化成熟,参与骨密度的调节。现有研究表明Tnfrsf11b蛋白是RANK–RANKL–OPG系统的核心一员,在骨质疏松症、类风湿性关节炎、骨癌等骨失调类疾病的发病机理方面起着中心作用。具体为:成骨细胞及骨髓基质细胞表达的RANKL,与破骨细胞或破骨细胞前体细胞表面上的RANK结合后,可促进破骨细胞的分化及骨吸收活性。成骨细胞系的多种细胞分泌表达OPG,与RANKL竞争性结合,阻止RANKL与RANK的结合,从而阻止破骨细胞活化及抑制骨吸收。OPG/RANK/RANKL系统参与了骨破坏的基本过程。但是在结构生物学方面,对它的研究仅限于基于同源结构进行的预测和理论分析。特别是OPG蛋白在发挥作用的时候首先存在受体同源二聚体与配体同源叁聚体的相互作用,以及可能存在的受体同源二聚体的前聚合作用,这些相互作用就需要大量的氢键和疏水作用来发起和维持,因此从二级结构水平对这个课题进行研究,是从实验结构生物学角度对OPG蛋白结构和功能加深理解的必要途径。本文首先利用生物信息学分析,对Tnfrsf11b基因所编码的全蛋白进行序列分析、比对,选择N末端CRD1,2(24-106aa)片段进行研究,同时对它的各种理化性质:蛋白分子量,等电点,半衰期,消光系数等进行了分析。利用分子克隆技术,PCR获得相关基因片段,对基因片段和载体pET28a/pGEX6p-1利用BamHⅠ、EcoRⅠ进行双酶切消化,体外连接,构建表达工程质粒,并进行鉴定。对鉴定准确的质粒转染感受态细胞进行试表达以及可溶性分析。对于以包涵体表达的pET28a-Tnfrsf11b菌株,尝试进行包涵体变复性,获得一定量的高纯度的可溶性目标蛋白,但是鉴于包涵体变复性容易引起二硫键的错配,对于CRD这种富含半胱氨酸的结构域不合适。所以接下来的工作利用构建的pGEX-6p-1-Tnfrsf11b菌株进行可溶性的表达和纯化。试验发现16℃,0.1 mmol/L IPTG ,25-30小时,目标蛋白实现可溶性表达。超声破碎细菌,离心,取上清后利用GST介质进行亲和层析纯化以及在AKTA仪器上利用superdex75分子筛进行纯化。将纯化所得的高纯度可溶性的目标蛋白利用圆二色谱仪进行圆二色谱分析,并利用随机软件进行分析。同样作为对照,对Fas蛋白的CRD1,CRD2进行了分析。结果发现作为这两个负责受体自聚合以及受体与配体相互作用的肽段都存在高含量的Beta折迭二级结构,分别为71.1%和57.3%。可能在高含量的Beta折迭二级结构基础上它也形成某种超二级结构,这样蛋白之间稳定的非共价相互作用就可以依靠β-折迭分子间或者分子内的疏水作用、氢键等进行维持,这对于受体二聚化作用以及配体叁聚体和受体二聚体的结合方面可能有重要作用。这也为进一步理解其N端结构域的结构和功能奠定了基础。
程文[9]2016年在《饱餐与饥饿对小鼠动脉粥样硬化形成及心肌能量代谢的影响及机制研究》文中研究说明研究背景TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体),现已证实该细胞因子参与调控心血管疾病,代谢性疾病及自身免疫性疾病等的病理生理过程。人体内的TRAIL是一种含有281个氨基酸(小鼠的有291个氨基酸)的Ⅱ型跨膜蛋白。作为一种跨膜蛋白,TRAIL在细胞表面被半胱氨酸蛋白酶进一步裂解,形成了可溶性的TRAIL(又被称为sTRAIL)。可溶性的TRAIL保留了整个分子结构域的生物学效应。在脂肪细胞中,TRAIL阻断了胰岛素刺激的血糖摄取和脂质的新生,由凋亡依赖的PPARy降解产生作用,但与胰岛素信号的改变和NF-κB的激活无关。众多研究表明,人体中TRAIL的含量与代谢紊乱有一定的相关性。高血脂是动脉粥样硬化的首要危险因素,并且升高的血脂和血管炎症之间的密切关系突出了动脉粥样硬化成因中脂质代谢受损的重要性。在动脉粥样硬化斑块形成的过程中,巨噬细胞迁移到皮下间隙,吞噬低密度脂蛋白胆固醇,导致承载胆固醇的泡沫细胞的形成和集聚。这一过程标志着一个主要的动脉粥样硬化病变形成的最初始的病理生理反应。作为一种能够引发心脑血管疾病的危险因素之一,高脂血症的存在越来越引起人们的重视。所谓的高脂血症,主要是由于脂质代谢异常而导致血清中一种或者多种脂质指标高于正常生化参数的现象。主要表现为血清总胆固醇(total cholesterol, TC),甘油叁酯(Triglycerides, TG),低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)高于正常水平和(或)高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoproteincholesterol, HDL-C)低于正常水平。该疾病多在中老年人群中出现。但是,伴随着生活压力的增加、饮食营养状况的改善以及吸烟饮酒的增多,高脂血症的患病率呈现一种逐渐增高的趋势,并出现了该疾病越来越年轻化的现象。在祖国传统中医学中,我们往往将高脂血症归类于古籍文献中的“痰浊”、“痰湿”、“眩晕”、“痰饮”等病。在其成因方面,传统中医学理论认为其与饮食不节关系紧密。饮食不节,中医上主要是指过食肥甘厚味等。《内外伤辨·饮食劳倦论》中已经明确有记载：“饮食失节,寒湿不适,则脾胃乃伤”。《本草经疏》中也有记载：“饮啖过度,好食油面猪脂,浓厚胶固,以致脾气不利,壅滞为患,皆痰所为”。经典名着《素问·痹论》中对饮食不节的描述是“饮食自倍,脾胃乃伤”。强调了脾胃乃后天之本,主运化饮食水谷,将水谷精微化为营血津液,输行一身。而过食膏脂,损伤脾胃,助湿生痰,血流不畅,不随气行,脾气不利,壅滞为患。在脉中,则为痰浊淤血,搏结脉道。上述病因病机的出现导致了高脂血症这一疾病的产生。许多研究证实TRAIL可能在肥胖,糖尿病和高脂血症等代谢性疾病的发病机制中发挥着重要的作用。在由33名家族性高胆固醇血症患者和10名健康人组成的小范围的调查中,Holven等人发现家族性高胆固醇血症患者外周血单个核细胞中TRAIL的表达高于正常健康人群,并且这种改变与TNF-α受体、CD40等其他炎症指标表达的升高是同步的,暗示了其具有一种促炎症的作用。并且,该研究还发现在高胆固醇血症患者中TNF-α的基础含量和应激含量也都有相应的提高。Brombo等人也有相似的研究,他们发现人体血清中TRAIL浓度与总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和甘油叁酯呈现一种正相关性,而与高密度脂蛋白胆固醇表现出一种负相关性,同时他们还发现,在排除其他因素后,TRAIL和低密度脂蛋白胆固醇之间的相关性依然是有意义的有研究发现,身体肥胖指数越高的人,其体内的sTRAIL的含量也越高。另外,Choi等人在一项健康的绝经后妇女的调查研究中发现,在较高区域的血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)中,血清sTRAIL浓度显着升高。但是,有的研究中在另外一项关于代谢综合征患者的研究中,作者发现在较低或者较高sTRAIL浓度下TC或者LDL-C并不存在明显的个体差异。既往对人体内TRAIL水平的研究多数以白种人或者非亚洲人为主,且在我国人群中尚未有sTRAIL水平和高胆固醇血症之间的关系的相关研究。基于此,我们认为十分有必要对sTRAIL和高脂血症之间的关系进行进一步的研究和阐明,以期逐步了解TRAIL水平在我国人群中的分布情况。以确定sTRAIL是否随着血脂的不同而有所改变,以期为我国人群中sTRAIL水平和高胆固醇血症之间的关系提供更多的证据,对进一步探讨TRAIL在人类动脉粥样硬化的发病机制中的作用,具有十分重要的临床意义。研究目的对352例纳入者体内生化参数及sTRAIL水平的测量及分析,观察我国汉族人群中血清sTRAIL浓度与总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇等血脂水平之间的相关性,并将相关血脂参数的高低进行分区,观察各区域之间是否存在差异性,以便进一步了解高脂血症人群中sTRAIL的水平。研究方法1.病例选择本临床研究病例均来自医院健康体检中心。纳入者在健康体检中心在完成常规的个人注册并剔除特定的疾病的检查。排除了糖尿病、自身免疫性疾病、炎症性疾病、冠心病以及年龄和性别等其他条件的限制。2.血清样本生化测量和数据收集血生化样本的测量主要为总胆固醇、甘油叁酯、LDL-C和HDL-C。其他生理学数据主要来自健康体检纳入者本人的健康体检报告。3. sTRAIL水平的测定使用静脉采血针抽取健康体检纳入者隔夜空腹静脉血0.5ml。室温离心后取上层血清。血清样本存于-80℃冰箱以备使用。sTRAIL血清浓度测量主要采用了不同供应商供应的ELISA试剂盒。严格按照试剂盒的相关说明书进行sTRAIL浓度的检测。4.统计学分析定量数据均以均数±标准差表示,数据分析使用GraphPad Prism软件。两组之间比较采用曼-惠特尼检验或者是未配对的t检验；斯皮尔曼相关性分析主要用于检测两组参数之间的相关性。设P<0.05为具有统计学意义。分类数据进行卡方检验。所有数据检验均为双向的。研究结果1.健康体检纳入者的基本情况392例健康体检者符合纳入标准,最终入选352例健康体检者的基本情况。纳入者年龄范围在30-68之间。大约有15%的参与者血压超过正常血压值。大约一半的纳入者,其血液中总胆固醇水平要高于正常值(总胆固醇正常值为<5.2mmol/L)。大于45%的为超重的人群(身高体重指数BMI>24)或者是肥胖的人群。2.不同的ELISA试剂盒影响了检测结果的多样性首先测试不同的ELISA试剂盒是否会影响结果的多样性。我们随机选取了16个人的血清样品为一个实验组,用叁种不同的商业试剂盒来测量其sTRAIL的含量。其中有两个试剂盒所测得的结果具有大致上的可比性的数据,而另外一个试剂盒则测出来的数据结果差别比较大。故而在接下来的所有实验中,我们均选用R&D Systems的试剂盒来测量sTRAIL的浓度,并且这一试剂盒在现阶段的研究中,使用的频率对比其他厂家的产品而言较高。从我们的实验中可以看出,不论采用何种ELISA试剂盒,各个试剂盒之间总会存在或多或少的误差。3.在以性别,BMI,年龄为分界值分组的情况下,TC升高者中的sTRAIL水平显着升高以5.2mmol/L的TC水平为分界值,分析后发现sTRAIL的水平在血清TC水平升高组(TC-high group)中是显着升高的,且P<0.001。以TC水平在5.7 mmol/L为一个分界值,分析了sTRAIL水平的差异性。结果发现,血清TC水平升高组(TC-high group)的sTRAIL浓度为126.8±6.7pg/ml,依然要高于血清TC水平正常组(TC-Norm group)的113.6±4.1 pg/ml (P<0.005)。男性体内血清TC水平升高组(TC-high group)的sTRAIL的平均水平要显着高于血清TC水平正常组(TC-Norm group)。而女性体内sTRAIL的平均水平与男性相差无几。我们将纳入者根据其身高体重指数分为BMI<24的正常体重组(normal bodyweight)和BMI≥24的超重或者肥胖组(overweight/obese) o在这两个子组中,血清TC水平正常组(TC-Norm group)和血清TC水平升高组(TC-high group)中sTRAIL水平也具有显着地差异性。此外,在不同的年龄段中,血清TC水平升高组(TC-high group)中sTRAIL水平也显着升高。4.较高的LDL-C水平为分界值的情况下,LDL-C水平较高组血清sTRAIL水平显着高于较低组以LDL-C=3.1 mmol/L为分界值来分析,发现在血清LDL-C较低组和较高组之间并没有显着的差异,P=0.073。而在以LDL-C=3.1 mmol/L为分界值来分析时,我们发现LDL-C较高组sTRAIL水平显着高于LDL-C较低组,P<0.0005。在男性体内,LDL-C较高组sTRAIL水平的平均值显着高于LDL-C较低组。而女性体内并未出现相似的差异性。相对于身体肥胖而言,正常体重组和超重或者肥胖组中,sTRAIL水平的平均值在LDL-C较高组中显着升高。在年龄较小的纳入者一组中分析,LDL-C较高组中sTRAIL浓度为123.3±7.8 pg/ml,显着高于LDL-C较低组,二者之间存在显着地差异,P=0.0013。在年龄较大的纳入者一组中,LDL-C较高组中sTRAIL浓度高于LDL-C较低组,但二者之间并不存在差异性,P=0.1851。5.TC和LDL-C在sTRAIL水平的较高区域和较低区域之间存在差异按照血清sTRAIL水平的高低,将其分为四个区域,分别比较了sTRAIL水平较高的区域和较低的区域中,各个血生化指标之间的相关性和差异性。首先,在这两个区域中,年龄并不存在差异。其次,TC在sTRAIL较高区域中的检测值为4.89±0.08 mmol/L,要显着低于较低区域的检测值5.28±0.10 mmol/L, P=0.0056。血清LDL-C也有同样的现象。在TG, HDL-C, SBP或者DBP, BMI等中,sTRAIL水平较高的区域和较低的区域并未发现显着地相关性。结论1.在性别,BMI,年龄不同的情况下,血清总胆固醇水平与sTRAIL浓度之间具有显着的正相关关系2.在较高的LDL-C水平为分界值的情况下,LDL-C水平与sTRAIL浓度之间具有显着地正相关关系研究背景在祖国传统医学中,动脉粥样硬化在传统的中医学中并没有具体的病名。但在古籍文献中,则多以“痰浊”、“痰湿”、“血瘀”、“心痛”、“胸痹”、“真心痛”、“痰饮”、“中风”等病名概括。在其成因主要是饮食不节。饮食不节,中医上主要是过食肥甘厚味。《医学入门》中也有记载“善食厚味者生痰”。《本草经疏》中也谈到“饮啖过度,好食油面猪脂,浓厚胶固,以致脾气不利,壅滞为患,皆痰所为”。经典名着《素问·痹论》中也有对饮食不节的的记载“饮食自倍,脾胃乃伤”。另外《素问·生气通天论》中也指出要适量饮食,并提出了饱食的弊端：“因饱而食,筋脉横解,肠澼为痔。”脾胃乃后天之本,主运化饮食水谷,将水谷精微化为营血津液。过食膏脂,损伤脾胃,助湿生痰,血运不畅,不随气行,壅滞为患。在脉中,则为痰浊淤血。但是对于饱餐对脉管及血运的影响,目前尚无具体的研究。基于既往文献中对饱餐的记载,我们采用了高热量饮食,以观察饱食膏脂之品对动脉粥样硬化形成的影响。在现代医学中,动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的形成是由多种致病因素导致的始发于动脉血管壁内膜层的复杂的细胞水平和分子水平改变的结果。其中高血压、高血糖、高血脂及肥胖等代谢紊乱是导致动脉粥样硬化形成的主要因素。随着生活节奏的加快,越来越多的人在选择饮食方面,多采取简便易食用的高热量饮食,并且长期高热量饮食,导致体内脂肪的集聚,血清中脂质水平的升高,进而出现动脉粥样硬化的几率要远远高于正常饮食的人群,进一步增加了罹患心脑血管疾病的危险性。心血管疾病产生的重要病理因素,是动脉粥样硬化的出现。既往研究表明,TRAIL有潜在的保护心血管疾病的作用。TRAIL基因敲除增加了高血脂小鼠的斑块面积,说明内源性的TRAIL具有保护血管抑制斑块形成的作用。我们总结了大量的体外实验发现,TRAIL的过表达,可能刺激了内皮细胞的凋亡,平滑肌细胞的增殖和迁移,泡沫细胞的形成和免疫应答。这些结果说明了,TRAIL水平的增加对血管炎症和动脉粥样硬化可能会有潜在的危害作用。因此我们认为,外源性TRAIL对血管炎症和动脉粥样硬化上的药理学作用具有一定的临床重要性。动脉粥样硬化的发生发展过程十分复杂,通常认为是遗传因素和环境因素共同作用的结果。目前,TRAIL基因缺失小鼠已经提供了可靠的证据来支持内源性的TRAIL在维持血管内稳态和抑制斑块进展方面必不可少。体内研究表明TRAIL在动脉粥样硬化的发展过程中具有一定的抑制作用。我们实验室研究发现,给予高脂饮食16周的apoE小鼠高于生理浓度的TRAIL刺激,发现其斑块面积较生理浓度组显着增大,提示我们生理浓度的TRAIL具有保护血管抑制斑块形成的作用。Death Receptor 5是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL的受体之一。20世纪末,研究者们发现了一种TNF家族细胞因子的同系物,该同系物也被认为是一种Apo-2的配体,即TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体),研究者们将其归类于TNF超家族10 (TNFSFlO)。现已发现五种TRAIL的受体。其中TRADL-R1 (DR4)和TRAIL-R2 (DR5)作为功能性的跨膜受体,可调节以TRAIL介导的细胞反应。而TRAIL-R3 (DcRl)和TRAIL-R4 (DcR2)则是不含有功能性的胞内域的膜锚定蛋白,通过竞争性结合TRAIL来拮抗DR4和DR5。另外,可溶性蛋白OPG被认为是另一个诱骗受体。但OPG与TRAIL的结合力相对较弱,并且二者之间的生理相关性仍未完全确定。在小鼠体内,仅表达DR5受体,而没有DR4。既往的研究多从TRAIL基因缺失小鼠来研究其对动脉粥样硬化斑块的作用。在小鼠体内,TRAIL的受体只存在DR5,而没有DR4,因此,我们构建了的四种双敲小鼠来研究DR5敲除后对动脉粥样硬化斑块的作用。在分别给予正常饮食和高热量饮食的条件下,观察在小鼠体内,TRAIL受体DR5敲除后,血管动脉粥样硬化斑块的面积是否有所改变。综上所述,传统医学和现代医学对饱餐和动脉粥样硬化的已经有众多论述,而DR5在饱餐诱导的动脉粥样硬化的影响目前尚未有具体的研究。因此我们根据既往文献的记载,采用了高热量饮食长期喂养双敲小鼠模拟饱餐对脉管及血运的影响,以期探讨DR5在饱食膏脂之品导致的动脉粥样硬化形成中所产生的影响。研究目的1.观察长期饱食高热量饮食条件下,双敲小鼠体重,附睾、肠系膜和肾周围脂肪垫的重量及体内血清胆固醇、血糖、高低密度胆固醇和甘油叁酯等生化参数的改变。2.观察长期饱食高热量饮食条件下,DR5敲除后,双敲小鼠血管动脉粥样硬化斑块面积的改变。研究方法1.实验动物来源：8周龄雄性apoE-/-小鼠和C57BL/6为背景的野生型小鼠购自北京维通利华公司,8周龄雄性LDLR-/-小鼠购自南京大学模式动物研究所,DR5-/-小鼠购自美国Mutant Mouse Regional Resource Centers (MMRRC)。所有动物实验均符合山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。2.双敲小鼠模型构建：将8周龄的apoE-/-小鼠和LDLR-/-小鼠分别与DR5-/-小鼠按照一雄两雌进行交配繁殖,杂一代基因型均为DR5+/- apoE+/-和LDLR+/- apoE+/-小鼠。杂一代在8周龄时继续进行模型构建,后代经鼠尾组织DNA提取后分析后分出DR5-/- apoE-/-和DR5+/+ apoE-/-小鼠及DR5-/- LDLR-/-和DR5+/+ LDLR-/-小鼠四个基因型。3.实验分组：将上述四个基因型小鼠进行分组,每个基因型分为正常饮食组和高热量饮食组,喂养16周。4.组织样本采集：16周相应饮食后对双敲小鼠进行取材。小鼠禁食过夜,0.8%戊巴比妥钠麻醉,心尖抽取血液。分别收集心脏、血管、脂肪,肝脏、肾脏等组织于组织冻存管中,迅速放于液氮中防止其裂解,保存于-80℃冰箱备用。用于制备冰冻或石蜡切片并常规染色、组化等研究的组织则置于4%多聚甲醛,4℃固定过夜,后置于1×PBS溶液中保存。5.血脂水平检测：从小鼠心尖取血并分离血浆,并检测血浆中总胆固醇(TC)、总甘油叁酯(TG)、LDL-C、HDL-C和血糖水平。6.组织学染色：进行大体组织油红O染色,分析双敲小鼠自主动脉弓、胸主动脉、腹主动脉至髂总动脉斑块面积。7.统计学分析：定量数据均以均数±标准差表示,数据分析及作图使用GraphPad Prism软件和SPSS 17.0软件。两组之间比较采用曼-惠特尼检验或者是未配对的t检验。设P<0.05为具有统计学意义。分类数据进行卡方检验。所有数据检验均为双向的。研究结果1.成功构建双敲基因型小鼠本实验以C57BL/6背景的apoE-/-和DR5-/-小鼠及LDLR-/-与DR5-/-小鼠为基础,构建双敲小鼠模型。经过一年半的时间对双敲小鼠进行基因筛选,从12547只杂合子小鼠中经过基因鉴定确定四种基因型的纯合子,分别为DR5-/- apoE-/-和DR5+/+ apoE-/-小鼠及DR5-/- LDLR-/-和DR5+/+ LDLR-/-小鼠四个基因型。2.各基因型小鼠体重结果经过16周相应饮食的喂养,其体重较最初入组时明显增加。其中各个基因型以高热量饮食喂养的小鼠体重增加相对值要远远高于正常饮食喂养的小鼠。其中DR5-/- apoE-/-高热量饮食组小鼠体重增加比例最高,DR5+/+apoE-/-高热量饮食组小鼠体重增加比例最低,但远远高于正常饮食组小鼠,并且其增加的比例与小鼠基因型无关。3.各基因型小鼠附睾、肠系膜及肾周围脂肪垫重量的结果对各基因型小鼠取材后脂肪垫的重量进行了比较。不论是以apoE-/-小鼠为基础构建的双敲小鼠,还是以LDLR-/-为基础构建的双敲小鼠,高热量饮食组的肠系膜脂肪垫、附睾脂肪垫及肾周脂肪垫的重量均高于正常饮食组。4.各基因型小鼠血清结果4.1不同基因型双敲小鼠体内血清胆固醇结果以apoE-/-为基础构建的两组基因型小鼠中,DR5+/+ apoE-/-与DR5-/- apoE-/-基因型小鼠HF组胆固醇高于CF组。并且在高热量饮食及正常饮食条件下,DR5敲除前后各组间均没有显着差异。而以LDLR-/-为基础构建的两组基因型小鼠体内,DR5+/+ LDLR-/-与DR5-/- LDLR-/-基因型小鼠HF组胆固醇均显着高于CF组,且P<0.0001。另外,DR5+/+ LDLR-/-基因型小鼠HF组胆固醇显着低于DR5-/- LDLR-/-基因型小鼠,且P<0.0001。4.2不同基因型双敲小鼠体内血糖结果在以apoE-/-为基础构建的敲基因小鼠体内,DR5-/- apoE-/-高热量饮食组血糖水平要低于正常饮食组,P=0.027；而以LDLR-/--为基础的敲基因小鼠体内,在DR5-/- LDLR-/-高热量饮食组血糖水平要高于正常饮食组组内且差异显着。另外,除了正常饮食组DR5+/+ LDLR-/-基因型小鼠体内血糖显着高于DR5-/-LDLR-/-组外,其余各组之间比较均没有统计学差异。4.3不同基因型双敲小鼠体内血清高密度脂蛋白胆固醇结果在以apoE-/-为基础构建的双敲小鼠体内,DR5-/-apoE-/-基因型小鼠HF组HDL-C水平低于CF组,而在正常饮食情况下,DR5+/+apoE-/-基因型小鼠CF组明显低于DR5-/-apoE-/-基因型小鼠。在LDLR-/-;为基础构建的双敲小鼠中,DR5+/+LDLR-/-基因型小鼠高热量饮食组血清高密度脂蛋白胆固醇水平明显高于正常饮食组。同样的DR5-/- LDLR-/-基因型双敲小鼠高热量饮食组也高于正常饮食组。但是在相同饮食条件下,仅有高热量饮食的DR5+/+ LDLR-/-基因型小鼠组HDL显着低于DR5-/- LDLR-/-基因型小鼠组,而正常饮食组之间无差异。4.4不同基因型双敲小鼠体内血清低密度脂蛋白胆固醇结果在以apoE-/--基因型小鼠在高热量饮食16周后,DR5+/+ apoE-/-基因型小鼠HF组明显高于DR5-/- apoE-/-基因型小鼠,而正常饮食组两种基因型之间差异性没有统计学意义。以LDLR-/-为基础构建的双敲小鼠中,DR5+/+ LDLR-/-与DR5-/-LDLR-/-;基因型小鼠HF组LDL-C水平明显高于CF组。在同一种饮食情况下,只有16周高热量饮食后,DR5+/+ LDLR-/-基因型小鼠较DR5-/- LDLR-/-基因型小鼠血清LDL-C有显着性降低。4.5不同基因型双敲小鼠体内血清甘油叁酯结果从不同基因型双敲小鼠体内血清甘油叁酯比较结果来看,在以apoE-/-为基础构建的双敲小鼠体内,DR5-/- apoE-/-基因型小鼠HF组低于CF组。而以LDLR-/-为基础构建的双敲小鼠体内HF组TG均高于CF组。在正常饮食条件下,DR5敲除前后血清胆固醇水平并没有显着性差异。而高热量饮食条件下,DR5+／+LDLR-/-基因型小鼠HF组TG水平显着低于DR5-/-LDLR-/-基因型小鼠。5.不同基因型双敲小鼠主动脉弓斑块面积为了研究不同基因型双敲小鼠在高热量饮食情况下主动脉弓斑块面积的差异性,我们对构建的四种双敲小鼠进行16周的高热量饮食和正常饮食的喂养,安乐死后取材,进行油红O染色。我们首先分析apoE-/-为基础构建双敲小鼠血管主动脉弓斑块面积。高热量饮食16周后,DR5+/+ apoE-/-组主动脉弓斑块面积明显高于正常饮食组,且具有显着统计学意义。并且,在同为高热量饮食的条件下,DR5敲除后主动脉弓斑块面积明显减小,即DR5+/+ apoE-/-组主动脉弓斑块面积大于Dr5/-/ apoE-/-组,且有统计学意义。以LDLR-/-基因型为基础构建的双敲小鼠中,我们对不同饮食的各组双敲小鼠主动脉弓斑块面积进行分析,发现高热量饮食组主动脉弓斑块面积均高于正常饮食组,不论是DR5+/+ LDLR-/-基因型双敲小鼠还是DR5-/- LDLR-/-基因型双敲小鼠均有相同的结果。而相同饮食双敲小鼠中,只有高热量饮食条件下,DR5+/+ LDLR-/-组主动脉弓斑块面积大于DR5-/-LDLR-/-组,而正常饮食情况下,DR5敲除前后,以LDLR-/-基因型为基础构建的双敲小鼠血管主动脉弓斑块面积并没有差异性。结论1.双敲小鼠高热量饮食后,体重,附睾周围脂肪垫、肠系膜周围脂肪垫及肾周脂肪垫、部分血清生化参数水平等显着高于正常饮食组。2.高热量饮食条件下,双敲小鼠体内DR5敲除后主动脉弓血管斑块面积显着减小。且斑块面积的减少与体重,附睾周围脂肪垫、肠系膜周围脂肪垫及肾周脂肪垫、血清生化参数水平等的改变没有相关性。且DR5敲除后能够减小长期饱食膏脂之品诱导的动脉粥样硬化斑块面积,对动脉粥样硬化斑块的形成起到抑制作用。研究背景我们在前两章中已经论述了高热量饮食对于机体的不良影响。现代人由于生活节奏的加快,越来越多的人长期选择以高热量饮食为主,逐渐导致高脂血症、糖尿病等代谢综合征以及高血压、冠心病等心血管疾病,严重影响了人们的健康。正如《养生论》中提到的“饮食不节,以生百病”。随着生活水平的提高,现代人对饮食的要求不仅仅是为了满足机体能量代谢,更多地是注重饮食上的养生保健。《素问·上古天真论》中就提出饮食有节,起居有常,“尽终其天年,度百岁乃去”。提示了饮食与长寿密切相关。但是,维持生命活动的饮食并不意味着可以无节制的暴饮暴食。传统中医认为,饮食有节主要是适度饮食。古代养生学家葛洪也提倡饮食要有节制,并在《抱朴子·极言》中说道“食不过饱……饮不过多”。我国古代的养生学家也提出了辟谷这一概念,指的是一种修身养性的方式。主要是少吃或不吃五谷。本文的饥饿主要是指长期热量限制饮食为主。现代研究也多以热量限制饮食为主。现代研究也发现饮食有节对机体产生有益的作用。Colman等人通过对灵长类动物进行热量限制饮食研究后也发现,恒河猴老龄化死亡率显着降低,并且提示热量限制饮食能够延灵长类动物的寿命。很多流行病学发现,热量的摄入与包括心血管疾病、肿瘤、糖尿病及神经退行性疾病相关。Suzuki等人发现,人类低热量饮食可以更加健康和长寿。Fontana等人在2004年做的一项研究中发现,志愿者在热量限制饮食下显着降低了心血管疾病危险因素的发生。另外,在潘宁顿医学生物研究中心做的调查,也证实了上述观点。对于热量限制饮食与寿命之间的关系,研究者们主要集中在长寿家族基因上。因此我们选取长寿家族之一的Sirtl作为研究对象,探讨在热量限制饮食的条件下,Sirtl的改变对心肌糖脂代谢和心功能的影响及机制。研究目的1.热量限制饮食对心肌糖脂代谢的影响2.热量限制饮食对心功能的影响研究方法1.实验对象及分组C57BL/6小鼠20只,雄性,8周龄,北京维通利华实验动物技术有限公司提供。将其随机分为2组：正常饮食组(CF)和热量限制饮食组(CR),每组10只,相应饮食16周。正常饮食(20.11%蛋白质,4.84%脂质,7.34%粗纤维,总能量为17.3282MJ/kg),热量限制饮食为正常饮食的30%。2.超声心动图检测在相应饮食后16周进行心脏超声心动图检测。选取频率为35MHz的超声探头进行心脏大小和功能参数的采集,采用高分辨率超声Vevo770系统进行数据分析。左室长轴和短轴切面记录超声图像。M型超声检测左室舒张末内径、左室收缩末内径、舒张末室间隔厚度、舒张末左室后壁厚度。左室短轴缩短率、射血分数和校正的左室质量由超声系统自动计算。3.实时定量-多聚酶链反应(RT-RCR):检测心肌组织的糖脂代谢相关基因PDK4、CD36、MCAD、CTPlb的mRNA表达水平。采用2-△△CT的相对定量方法分析基因的表达量。4.蛋白质免疫印迹经裂解液分别裂解组织后,提取组织总蛋白,SDS-PAGE电泳分离蛋白样品,以电转移法将分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜上,经5%脱脂奶粉封闭后以特异性一抗孵育过夜,随后室温孵育二抗。用ECL化学发光液使目的蛋白条带显影,并用LAS-4000化学发光仪检测。5.统计学分析：定量数据均以均数±标准差表示,数据分析及作图使用GraphPad Prism软件和SPSS17.0软件。两组之间比较采用曼-惠特尼检验或者是未配对的t检验。设P<0.05为具有统计学意义。研究结果1.热量限制饮食通过PI3K/AKT通路提高了心肌Sirtl的蛋白表达水平给予小鼠16周相关饮食后,安乐死取材。我们对部分心脏组织进行蛋白提取。用western blot的方法检测发现,Sirtl在热量限制饮食条件下,蛋白表达水平显着升高。检测了其上游蛋白PI3K/AKT的相关蛋白水平发现,在热量限制饮食条件下P13K蛋白水平升高,且与Sirtl升高具有相关性。P13K蛋白的下游靶点蛋白AKT的水平较正常饮食也是显着升高的。2.热量限制饮食情况下,心肌糖脂代谢相关基因表达升高利用RT-PCR的方法对心肌糖脂代谢相关基因进行检测。结果发现,糖代谢相关基因PDK4的mRNA水平热量限制饮食组较正常饮食组显着升高。CD36、MCAD、CTPlb叁种脂代谢相关基因mRNA表达水平在热量限制饮食条件下显着升高。3.热量限制饮食后,小鼠心功能水平较正常饮食组无显着差异心脏超声检测发现,热量限制饮食组舒张末左室后壁厚度较正常饮食组显着变薄,P<0.05。而在两种饮食条件下,左室舒张末内径、舒张末室间隔厚度、射血分数和短轴缩短率却无显着差异,P>0.05,无统计学意义。结论热量限制饮食通过PI3K/AKT通路促进Sirtl的蛋白表达,导致心肌糖脂代谢相关基因表达水平的提高。但长期热量限制饮食对心功能的影响与正常饮食相比并无
李小川, 西中海, 吕刚, 金明熙, 谢林[10]2003年在《退变腰椎间盘组织中细胞凋亡及相关基因Fas和Fas-L表达的研究》文中认为目的:探讨细胞凋亡和凋亡相关基因Fas,Fas—L在腰椎间盘退变中的作用。方法:采用原位DNA片段末端标记和免疫组织化学方法,检测40例退变腰椎间盘组织及10例正常腰椎间盘组织细胞凋亡状态及凋亡相关基因Fas和Fas—L蛋白的表达。结果:40例退变腰椎间盘组织凋亡指数(AI)均值为70.51,Fas蛋白阳性细胞百分比为60.69％,Fas-L蛋白阳性细胞百分比为56.13％;10例正常腰椎间盘组织AI均值为20.02％,Fas蛋白阳性细胞百分比为10.02％,Fas-L蛋白阳性细胞百分比为10.45％。两组间AI均值、Fas蛋白表达及Fas—L蛋白表达差异均有显着性意义(P<0.05)。Fas和Fas—L表达越强,凋亡细胞数越多。结论:Fas,Fas-L蛋白均参与了腰椎间盘组织中细胞凋亡的调节,可能在腰椎间盘退行性变发生和发展中发挥重要作用。
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