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环果寡糖糖基转移酶基因异源表达和改造

2020-12-02阅读(527)

环果寡糖糖基转移酶基因异源表达和改造

论文摘要

环果寡糖糖基转移酶（Cycloinulooligosaccharide fructanotransferase,CFTase）是糖苷水解酶家族的一员（Glycoside Hydrolase Family32,GH32）,可以通过催化菊粉分子内的转糖基反应产生一系列的环果寡糖,其中以6个D-呋喃果糖单元通过β-（2,1）-糖苷键连接而成的环状低聚果糖（Cycloinulohexaose,CF6）为主。目前,关于CFTase的研究停留在对酶进行分离纯化和酶学性质表征,而对其催化菊粉产生不同产物的作用机制研究相对较少。本实验室有源于类芽孢杆菌Paenibacillus sp.Lfos16表达的CFTase106,采用P.pastoris X-33表达宿主对其进行异源表达,并与实验室前期构建的E.coli BL21（DE3）重组表达CFTase106比较。结果表明不同表达宿主来源的重组CFTase106的酶学性质没有显著差异。考虑到大肠杆菌易于培养,且生产周期短,可以用于快速评估实验结果。因此,后续实验将以大肠杆菌作为表达系统进行CFTase106的定向进化和固定化研究。为了研究CFTase106催化菊粉产生不同产物的作用机制从而更好地对其进行改造,采用定向进化技术通过易错PCR向cft106基因引入随机突变,构建突变体文库,经筛选获得酶活提高的2株突变菌株。同时,结合突变位点和对CFTase106的三个功能区域（ERH、CR、R4）研究发现ERH区和CR区具有催化环化和水解的催化功能,单独的CR区不表现任何催化活性,而R4区对酶催化环化和水解反应的能力有极为重要的影响。CFTase106催化菊粉的主产物环状低聚果糖在工业生产上具有潜在的应用价值,为了使CFTase106更好的应用于工业生产,采用新型固定化技术酶-无机杂化纳米花对突变的CFTase106进行固定化。结果表明以突变的CFTase106为有机组分,Ca3（PO4）2·3H2O为无机组分合成的酶-无机杂化纳米花颗粒外形呈现出花瓣状的层次结构,单个纳米花的平均直径是5μm。重复应用6次后仍保持63%左右的活性,室温保存10 d后,其残余活性仍保持在60%以上,并且其具有良好的稳定性。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 菊粉
  •     1.1.1 菊粉的结构及来源
  •     1.1.2 菊粉的功能及应用
  •   1.2 环果寡糖糖基转移酶概述
  •     1.2.1 环果寡糖糖基转移酶的来源
  •     1.2.2 环果寡糖糖基转移酶的酶学性质
  •     1.2.3 环果寡糖糖基转移酶序列分析
  •   1.3 环果寡糖
  •     1.3.1 环果寡糖的结构
  •     1.3.2 环果寡糖的应用
  •   1.4 重组酶表达系统
  •     1.4.1 细菌表达系统
  •     1.4.2 酵母表达系统
  •   1.5 定向进化
  •     1.5.1 定向进化方法
  •   1.6 固定化
  •     1.6.1 传统固定化
  •     1.6.2 酶-无机杂化纳米化
  •   1.7 本课题研究意义及内容
  • 第二章 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌株与质粒
  •     2.1.2 培养基
  •     2.1.3 试剂
  •     2.1.4 引物
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 CFTase106 基因在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达比较
  •       2.2.1.1 pPICZαA-cft106 表达载体的构建
  •       2.2.1.2 重组CFTase106 的诱导表达
  •       2.2.1.3 重组CFTase106 的纯化
  •       2.2.1.4 蛋白浓度测定
  •       2.2.1.5 重组CFTase106 活力测定
  •       2.2.1.6 重组CFTase106 酶学性质的测定与比较
  •     2.2.2 CFTase106 的定向进化
  •       2.2.2.1 应用易错PCR技术高CFTase106 活性
  •       2.2.2.2 CFTas106 部分基因功能的比较
  •     2.2.3 酶-无机杂化纳米花固定化CFTase106
  • 第三章 结果与讨论
  •   3.1 CFTase106 基因在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达比较
  •     3.1.1 pPICZαA-cft106 表达载体的构建
  •       3.1.1.1 目的基因的扩增
  •       3.1.1.2 阳性克隆的筛选
  •     3.1.2 重组CFTase106 的诱导表达及纯化
  •       3.1.2.1 重组CFTase106 在毕赤酵母中的诱导表达及分离纯化
  •       3.1.2.2 重组CFTase在大肠杆菌中的诱导表达及分离纯化
  •     3.1.3 重组CFTase106 转化菊粉产物分析
  •     3.1.4 重组CFTase106 的酶学性质测定与比较
  •       3.1.4.1 温度对重组CFTase106 酶活的影响
  •       3.1.4.2 重组CFTase106 的温度稳定性
  •       3.1.4.3 p H对重组CFTase106 酶活的影响
  •       3.1.4.4 重组CFTase106的pH稳定性
  •       3.1.4.5 金属离子对重组CFTase106 酶学性质的影响
  •   3.2 CFTase的定向进化
  •     3.2.1 Ep-PCR技术提高CFTase活性
  •       3.2.1.1 Ep-PCR条件优化
  •       3.2.1.2 突变株及其突变位点
  •       3.1.2.3 SDS-PAGE分析
  •       3.1.2.4 突变株酶活测定
  •     3.2.2 CFTase106 部分功能的比较
  •       3.2.2.1 CFTase106 部分片段
  •       3.2.2.2 SDS-PAGE分析
  •       3.2.2.3 CFTase106 部分区域功能测定
  •   3.3 酶-无机杂化纳米花固定化CFTase106
  •     3.3.1 蛋白浓度和PBS浓度对固定化效率的影响
  •     3.3.2 扫描电子显微镜分析（SEM）
  •     3.3.3 固定化CFTase106 酶活测定
  •     3.3.4 固定化CFTase106 的重复利用
  •     3.3.5 固定化CFTase106 的储存
  • 第四章 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 马俊

    导师: 唐文竹

    关键词: 环果寡糖,异源表达,酶学性质,易错,杂化纳米花

    来源: 大连工业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 大连工业大学

    分类号: Q55;Q78

    DOI: 10.26992/d.cnki.gdlqc.2019.000127

    总页数: 61

    文件大小: 6798K

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