论文摘要
基因编辑技术已经成为生物学领域中最受欢迎的技术之一,针对基因编辑个体的筛选和鉴定的检测方法已经成为当今重要的研究内容。本研究基于实时荧光定量PCR（qPCR）平台开发了新的检测方法,以合成的9个质粒为样品材料,对qPCR方法进行灵敏度与特异性的检测,同时综合比较了已经报道的T7核酸内切酶I（T7E1）检测法、临界退火温度PCR（ACT-PCR）检测法和高分辨率熔解曲线（HRM）分析法。研究发现其它方法在时间、灵敏度、劳动力、成本以及序列的局限性,凸现了qPCR方法在这几个方面的优势。进一步的以南粳46、编辑TGW6基因的水稻为实验材料,利用qPCR与数字PCR的方法对基因编辑水稻样品进行检测与鉴定。主要研究结果如下:1.检测qPCR方法的灵敏度与特异性,利用双探针进行实验,研究显示该方法即使对于单碱基的缺失、插入和替换的DNA样品,依旧可以准确的检测出来。对于编辑TGW6基因的水稻样品的检测筛选,qPCR方法可以准确鉴定区分样品类型,通过2-△△CT方法计算分析大量样本数据得到结果显示野生型、杂合型突变和纯合型突变相对应的值为1（1.16至0.80）,0.5（范围从0.64到0.41）和0。2.利用T7E1检测法、ACT-PCR检测法与HRM分析法检测鉴定9个合成质粒的DNA样品,T7E1检测法进行酶切5个小时后,实验结果良好,单碱基突变体均被剪切出两条带且条带明显。在ACT-PCR检测法中将退火温度设定为73℃,凝胶电泳显示只有WT野生型出现条带的,而突变体均没有条带。HRM分析法同样适用于基因编辑的突变体的筛选,但是该筛选方法不能区分A-T型的单碱基替换。3.T7E1检测法与ACT-PCR检测法,在时间消耗上大于4小时,而HRM分析法在时间上的消耗小于2个小时。在灵敏度上与其他两种方法相比,T7E1检测法的灵敏度呈中等水平。ACT-PCR检测法与T7E1检测法因操作繁琐,所以人力成本很高,而HRM分析法在中等水平。相比较T7E1检测法与ACT-PCR检测法,HRM分析法在成本花费上比较高。ACT-PCR检测法有一定的序列局限性,而其他两种方法没有序列的局限性。4.利用数字PCR检测编辑TGW6基因的水稻,进一步的将qPCR方法延伸到ddPCR平台,扩展该方法的灵敏度,同时优化试验环节,该方法可以成功的区分野生型、杂合型突变、纯合型突变,结果目的基因/内参基因比值分别为0.999≈1、0.512≈0.5、0.0039≈0,实现方法升级。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 丁霖
导师: 李玥莹,徐俊锋
关键词: 基因编辑技术,高分辨率溶解曲线,实时荧光定量,数字方法
来源: 沈阳师范大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学,生物学
单位: 沈阳师范大学
分类号: Q943.2
总页数: 59
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- [1].水稻千粒重基因TGW6功能标记的开发与利用[J]. 中国水稻科学 2014(05)
- [2].基于CRISPR/Cas9技术的水稻千粒重基因tgw6突变体的创建[J]. 作物学报 2016(08)
标签：基因编辑技术论文; 高分辨率溶解曲线论文; 实时荧光定量论文; 数字方法论文;