屠洁[1]2004年在《LPS引起的心血管功能障碍及相关机制研究》文中研究指明背景 败血症及败血症休克都是临床上常见的急危重症，死亡率高，至今临床上仍缺乏疗效高、副作用小的方法。细菌感染是败血症休克最常见的病因，细菌的产物，如内毒素，外毒素和细菌外壁成分—脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可直接或间接地刺激单核细胞、多形核中性粒白细胞或内皮细胞等靶细胞启动炎症进程，产生促炎细胞因子(proinflammtory cytokine)。 败血症休克一般伴有严重的心血管功能障碍，并最终发展成为全身低血压及心肌收缩抑制的不可逆性。给实验动物注射纯化的LPS来模拟败血症休克是近年来国际上比较通用而有效的手段，LPS进入体内后能刺激多种促炎细胞因子及血管活性物质的过量表达，影响心血管功能。为了阐明LPS心血管效应的机理，过去有很多研究往往集中在一级介质——促炎细胞因子上，但是大量实验和临床试验表明，抑制促炎细胞因子的表达并不能改善LPS引发的心血管功能的抑制效应。因此，现在越来越多的研究者开始关注LPS及促炎细胞因子刺激产生的二级介质。 一氧化氮(nitric oxide，NO)和内皮素-1(endothelin-1，ET-1)是两个重要的血管活性物质，在生理条件下，两者相互拮抗共同调控心血管功能。很多证据表明，LPS刺激浙江大学硕士学位论文引起这两种物质的过量表达，从而使两者间的平衡打破，对心血管功能紊乱产生重要影响。对于NO和ET-1在其中发挥的具体作用至今没有得到统一认识。目的 腹腔注射LPs建立败血症休克模型，应用离体血管环、Langendorff离体灌流心脏及单个心室肌细胞模型来研究LPS对大鼠主动脉环反应性、冠状动脉阻力、心肌收缩力、细胞内钙瞬变及线粒体功能的影响，初步探讨LPS引发的心血管作用及相关机制，重点在于阐明NO、ET-1在其中发挥的具体作用。方法1.败血症休克动物模型的建立雄性sD大鼠腹腔注射LPs 10mg/kg，4小时后处死。2.血清亚硝酸盐/硝酸盐(NOZ祝03一)测定制备血清样本，采用氯化钒还原法检测血清中N仇一加仇一含量以反应NO含量的改变。3.血浆ET-1含量的放射免疫分析制备血浆样本，采用‘251一ET-1均相竞争法测定血浆中的ET-1含量。4.离体血管环灌流实验采用organ bath离体血管环灌流装置，主动脉环稳定于改良K-H液中，通过PowerLab信号采集处理系统(AD Ins仃uments，澳大利亚)来记录血管收缩反应曲线。浙江大学硕士学位论文5.离体心脏冠脉阻力、左室功能评价采用Langendorff恒流灌注技术，通过MedLab信号采集处理系统(南京美易)来记录心肌收缩功能指标及冠脉灌注压(c~arype而sion Pressure，CPP)的改变。根据cPP的改变来反应冠脉收缩力的改变6.心室肌细胞酶解分离I型胶原酶酶解分离大鼠心室肌细胞。7.咖啡因诱导的心肌细胞内钙瞬态分析用细胞内双波长钙荧光系统(T.LLL.，德国)检测细胞内游离钙离子浓度，以Fura一2/AM为钙指示剂。8.心室肌细胞肌浆网c扩气ATpase活性检测制备离体大鼠心室肌细胞肌浆网，采用无机磷比色法测定ca2+确Tpase活性。肌浆网蛋白含量的测定采用考马斯亮兰蛋白测定法。9.心肌细胞线粒体的提取和线粒体丙二醛(MDA)含量测定分离心肌线粒体，采用硫代巴比妥酸法，根据试剂盒说明书操作，测定样本中的MDA含量。结果第一部分LPS对大鼠主动脉和冠脉反应性的影响及相关机制1 .LPS处理组血清NOZ加03一水平与对照相比增加了近20倍。2.LPS处理的大鼠血浆ET-1含量显着增加(P<0.05)。浙江大学硕士学位论文3 .LPS对大鼠离体主动脉环对苯肾上腺素(phe咧ePhrine，PE)收缩反应的影响(1)LPS处理组主动脉环对PE的浓度一收缩反应曲线明显低于对照组;(2) iNOS特异性抑制剂AMG孵育LPs处理过的主动脉环1小时，对主动脉低反应的抑制作用呈浓度依赖性，roo林M和lmM的AMG能完全取消LPS引起的主动脉环的低反应性，10“M的AMG则没有这个效果。4.LPS对离体心脏冠脉收缩力的影响(1) LPs处理的大鼠心脏其cPP显着升高;(2)用AMG(l0omg/kg，i.P.)单独预处理并不能缓解LPs引起的CPP的升高;(3)用ET^特异性阻断剂BQ一123(lm叭g，i:P)预处理后，LPS诱导的CPP升高效应被减弱;(4) BQ一123和AMG联合预处理后的效果与单独应用BQ一123预处理后的结果相似。第二部分LPS对大鼠心肌收缩力的作用及相关机制1 .LPS对左室心肌收缩功能的影响(1) LPS显着降低了左室发展压和心率的乘积(LVDPxHR)、左心室内压上升和下降速度峰值(士dp/dtmax);(2) AMG单独预处理只能部分逆转LPS诱导的心脏收缩功能下降;(3) BQ一123单独预处理部分逆转LPS诱导的心脏收缩功能下降;(4) BQ一123联合AMG则可显着抑制LPS引起的心脏负性肌力作用。2.LPS对心肌细胞内钙稳态的影响(1) LPS处理后，与对照组相比，心肌细胞对咖啡因诱导的内钙瞬变幅度显着降低。(P<0.01)。(2) LPs处理后，与对照组相比，其心肌细胞肌浆网c扩气ATPase活性受到显着抑制(P 李平[2]2016年在《慢性迷走神经刺激减轻去势大鼠血管内皮损伤和炎症反应的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理背景:心血管疾病(CVDs)是心脏和血管疾患引起的一组循环系统疾病,是目前全球人类死亡的首要原因,其发病率和死亡率一直呈上升趋势,已超过肿瘤性疾病而跃居第一,且其中一半以上发生在亚洲国家。CVDs发病率存在性别差异,即绝经后妇女CVDs的发病风险较同龄男性和绝经前妇女显着增加,这种差异与卵巢性激素对心血管系统的保护作用息息相关。健康妇女在围绝经期早期,内皮功能就开始下降,且其障碍程度与CVDs的发生发展密切相关。当血管内皮细胞发生功能障碍后,可表达免疫球蛋白超家族黏附分子(VCAM-1、ICAM-1等)、选择素家族成员(E-selectin、P-selectin等)以及分泌TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MIP、MCP-1等炎症介质,共同参与动脉粥样硬化发生、发展过程中的每个重要环节。研究表明,不论是自然绝经还是人为去势都可导致机体出现慢性炎症反应,并伴随血清IL-8、MCP-1、MIP-1α、RANTES升高。又有研究表明,绝经后妇女自主神经系统功能发生紊乱,表现为迷走神经活动降低、交感神经活动升高。而作为自主神经系统主要组成部分的迷走神经,可参与调控机体的炎症反应,并有学者将迷走神经及其递质乙酰胆碱(ACh)与免疫系统相互作用参与抗炎的神经-免疫调节通路命名为“胆碱能抗炎通路(CAP)”。我室前期研究也发现,迷走神经活动增加后可显着减轻结肠黏膜的炎症反应。故我们推测:绝经后妇女出现的血管内皮细胞激活和炎症反应可能与自主神经系统功能紊乱导致的免疫异常调节有关。研究表明,迷走神经传出纤维末梢释放的ACh可通过激活免疫细胞表面α7n ACh R,调控NF-κB/p65的核转位过程,抑制编码促炎细胞因子和趋化因子基因的转录。此外,MAPKs信号通路可直接或间接影响编码促炎细胞因子的基因转录过程,而IκB的磷酸化和NF-κB/p65的磷酸化、核转位被认为是其下游最重要的信号转导途径之一。我室前期研究结果发现,生物反馈可有效改善交感-迷走平衡,增强迷走神经活动、减弱交感神经活动。故我们提出假设:生物反馈可通过增强迷走神经活动调节自主神经内在平衡(迷走-交感平衡),在一定程度上激活CAP,进而减轻绝经后妇女血管内皮细胞的损伤、抑制炎性细胞因子的合成和释放并最终降低绝经后妇女CVDs的患病率和死亡率;而其内在机制则可能与n ACh R的激活和MAPKs、NF-κB信号通路的调控有关为验证上述科学假说,我们进行了动物实验和体外细胞实验。然而,由于生物反馈等认知行为疗法的顺利开展往往需要高级神经中枢的主动参与,其机制也相当复杂,依据目前的研究现状,我们尚不能在实验动物模型中完全模拟人体生物反馈训练的全过程。故我室王庭槐教授在前期研究的基础上,首次提出:增强迷走神经活动可部分模拟生物反馈过程中迷走神经活动增加的外周反应,并以此为切入点,开始在多种动物疾病模型中研究生物反馈增强迷走神经活动的外周机制。在本课题的研究中,我们通过切除雌性育龄期大鼠双侧卵巢来模拟女性绝经后状态,同时采用慢性迷走神经刺激来增加迷走神经活动,研究迷走神经活动增强对大鼠绝经去势模型的外周血管保护作用和抗炎效应,并结合体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)探讨其可能机制。目的:研究慢性迷走神经刺激对大鼠绝经去势模型外周血管内皮细胞损伤的保护作用和抗炎效应,并探讨n ACh R和MAPKs、NF-κB信号通路在其中的作用。第1章:慢性迷走神经刺激对去势大鼠血管内皮细胞损伤的影响及机制初探1.本部分实验对象为:7~8月育龄期SD雌性大鼠;具体分组如下:假手术组(sham-OVX)(n=9)、去势组(OVX)(n=10)、去势+假刺激组(OVX+sham-VNS)(n=10)和去势+刺激组(OVX+VNS)(n=9)。2.结合我室前期工作基础,在OVX和OVX+sham VNS组建立大鼠绝经去势模型;sham-OVX组也要接受去势手术,但不摘除卵巢;同时在OVX+sham-VNS和OVX+VNS组大鼠左侧颈部迷走神经干植入刺激电极,建立慢性迷走神经刺激(VNS)动物模型。OVX+VNS组每两天接受VNS干预一次,刺激参数为:连续单刺激,刺激频率20.0Hz,电流1.0m A,波宽10.0 ms,每次干预3h。OVX+sham-VNS组除不接受刺激外,其他处理同OVX+VNS组。3.于实验前后分别测量所有大鼠体重和血压水平;建立模型成功后正常饲养13周,每天记录体重变化情况;实验结束后,取大鼠血清、胸主动脉、心脏和子宫,观察大鼠一般情况的变化。4.HE染色后镜下观察大鼠胸主动脉内皮细胞的病理形态改变;透射电镜和扫描电镜观察大鼠胸主动脉内皮细胞超微结构的改变。5.离体血管环实验观察大鼠内皮细胞完整的胸主动脉舒张功能。6.采用可见分光光度法和酶联免疫吸附实验,检测大鼠胸主动脉血管内皮e-NOS表达、NO含量、血清ET-1和NO的水平以及主动脉管壁ACh的含量。第2章:慢性迷走神经刺激对去势大鼠炎症反应的调控作用1.本部分实验对象为:7~8月育龄期SD雌性大鼠和体外培养的HUVECs;动物实验分组如下:sham-OVX、OVX、OVX+sham-VNS和OVX+VNS;体外细胞实验采用100 ng/ml LPS与HUVECs共孵育8h,建立血管内皮细胞炎症模型。方法:2.采用免疫组织化学染色法检测大鼠胸主动脉内皮细胞黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)的表达。3.采用免疫印迹方法观察ACh(10-9~10-5M)预孵育24h后,对LPS诱导的HUVECs黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)表达的影响。4.采用酶联免疫吸附实验检测大鼠血清和HUVECs上清炎性细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、CINC/KC、MCP-1)的水平。第3章:MAPKs、NF-κB信号通路在慢性迷走神经刺激减轻去势大鼠炎症反应中的作用及机制研究1.体外培养HUVECs,利用100 ng/ml LPS与HUVECs共孵育8h,建立血管内皮细胞炎症模型。2.采用免疫印迹方法分析α7n ACh R特异性阻断剂甲基牛扁碱(MLA)和n ACh R非特异性阻断剂美加明(mec)对ACh降低LPS诱导的黏附分子表达的影响。3.采用免疫组织化学染色法和免疫印迹方法,观察血管壁NF-κB/p65的表达和核转位。4.采用免疫印迹方法检测HUVECs NF-κB/p65、p-NF-κB/p65、IκB、p-IκB、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白分子的表达。结果:第1章:慢性迷走神经刺激对去势大鼠血管内皮细胞损伤的影响及机制初探1.大鼠切除卵巢13周后:扫描电镜结果显示,血管内膜出现明显的损伤,表现为血管内皮细胞的萎缩、变形、脱落以及大量纤维蛋白黏附至内皮表面;透射电镜结果显示,血管内皮细胞和平滑肌细胞均出现不同程度的损伤,表现为内皮细胞肿胀、线粒体肿胀、胞质液化,以及内皮细胞坏死,内弹力膜厚薄不均、断裂等;而去势大鼠接受慢性VNS干预后可显着减轻血管内皮细胞的损伤。提示:慢性迷走神经刺激可显着改善去势大鼠血管内皮细胞超微结构的异常改变。2.与去势大鼠相比,OVX+VNS组大鼠胸主动脉环对ACh(10-9~10-5 M)诱导的血管内皮细胞最大舒张率显着增加,接近正常对照组。提示:慢性迷走神经刺激可显着改善去势大鼠血管内皮依赖性舒张功能障碍。3.与去势大鼠相比,OVX+VNS组大鼠血管壁内皮e-NOS表达、NO含量显着增加,血清ET-1的水平显着降低,接近正常对照组;且OVX+VNS组大鼠血管壁ACh含量较sham-OVX、OVX、OVX+sham-VNS组显着增加。提示:慢性迷走神经刺激减弱去势大鼠内皮细胞损伤、改善血管内皮细胞功能障碍的机制可能与血管壁内皮e-NOS表达升高、NO产生增多、血清ET-1的水平降低有关,且该效应可能与迷走神经活动增强后外周释放的ACh增多有关。第2章:慢性迷走神经刺激对去势大鼠炎症反应的调控作用1.与去势大鼠相比,OVX+VNS组大鼠血管内皮细胞黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)的表达降低,接近正常对照组。2.与去势大鼠相比,OVX+VNS组大鼠血清炎性细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、MCP-1)的水平显着降低,接近正常对照组。3.在体外培养的HUVECs中,ACh(10-9~10-5 M)可浓度依赖性降低LPS诱导的黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)的表达;其中以10-6和10-5 M ACh的效果最为明显。4.在体外培养的HUVECs中,ACh(10-9~10-5 M)可浓度依赖性降低LPS诱导的炎性细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、MCP-1)的释放;其中也以10-6和10-5 M ACh的效果最为明显。1.特异性阻断α7n ACh R受体,不能阻断ACh降低LPS诱导的内皮细胞黏附分子(VCAM-1)表达的效应;而非特异性阻断n ACh R可显着阻断ACh降低LPS诱导的内皮细胞黏附分子(VCAM-1)表达的效应。2.与正常对照组相比,去势大鼠血管壁NF-κB/p65的表达显着增多、NF-κB/p65亚基的核转位现象也较明显;而接受慢性VNS干预的大鼠,血管壁NF-κB/p65的表达量和核转位恢复正常,接近正常对照组。3.在体外培养的HUVECs中,ACh(10-6 M)可显着降低LPS诱导的NF-κB/p65、IκB、ERK、JNK、p38MAPK蛋白分子的磷酸化。第3章:MAPKs、NF-κB信号通路在慢性迷走神经刺激减轻去势大鼠炎症反应中的作用及机制研究结论:1.慢性迷走神经刺激可显着减轻去势大鼠血管内皮细胞的损伤、改善血管内皮细胞的功能障碍;其机制可能与迷走神经活动增强后,血管局部乙酰胆碱释放增加引起的血管内皮e-NOS表达和NO含量增多、血清ET-1水平下降有关。2.慢性迷走神经刺激可显着减轻去势大鼠血管内皮黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)的表达和血清炎性细胞因子(TNF-α、IL-6、CINC/KC、MCP-1)的水平。提示:慢性迷走神经刺激可减轻去势大鼠的血管内皮炎症反应,其机制可能与迷走神经活动增强后血管局部乙酰胆碱释放增加,进而抑制血管内皮细胞的激活有关。3.MAPKs(ERK、JNK、p38MAPK)、NF-κB信号通路共同参与慢性迷走神经刺激减轻去势大鼠血管内皮炎症反应的作用,且该过程可能由n ACh R所介导。 郭世杰[3]2013年在《血浆内毒素在牙周炎患者罹患冠心病中的作用及机制研究》文中研究表明目的：通过分析牙周炎患者血浆内毒素与冠心病及其危险因素的相关性及牙周炎主要致病菌牙龈卟啉单胞菌(P.g)脂多糖(LPS)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞间连接蛋白VE-cadherin表达及细胞增殖和调亡的影响,探讨血浆牙周炎致病菌内毒素在牙周炎患者罹患冠心病中的作用及相关机制。方法：1.临床研究采用病例对照研究设计,于2012年5月-7月在天津医科大学第二医院干部保健科进行体检的1089人中,选取牙周炎患者201人,并根据是否存在冠心病将其分为病例组(牙周炎合并冠心病)和对照组(牙周炎不合并冠心病),同时纳入43例健康查体对象设为空白组。通过鲎试剂动态浊度法与ELISA法分别测定血浆内毒素及同型半胱氨酸含量,并根据血浆内毒素四分位数将病例组人群进一步分成Q1组(>0%且≤25%)、Q2组(>25%且≤50%)、Q3组(>50%且≤75%)和Q4组(>75%且≤100%)。同时,对全部纳入对象中的男性和老年(年龄≥65岁)亚组人群分别进行了进一步相关研究。2.实验研究：在体外将P.g菌LPS与HUVEC共培养,根据P.g菌LPS浓度分为空白对照组、10pg/mL组、50pg/mL组、100pg/mL组及1ng/mL组。分别培养2h、6h、12h及24h后,采用Western blot和RT-PCR分别检测VE-cadherin蛋白及mRNA表达情况。培养28h后采用MTT法及流式细胞仪分别测定细胞增殖活力及凋亡情况,并通过Western blot检测caspase-3激活情况。结果：1.在全部入选研究对象中,3组人群的年龄、内毒素、收缩压(SBP)、总胆红素(STB)、同型半胱氨酸(Hcy)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)差别均有统计学意义(P<0.01)。在病例组人群中,舒张压(DBP)、LDL-C及STB在血浆内毒素水平四分位组间的差异均有统计学意义(P<0.05),其中LDL-C随内毒素水平升高呈逐渐增高的趋势；血浆内毒素与TC和LDL-C之间存在正相关(r分别为0.438、0.457,P均为0.000),校正年龄因素影响后,它们之间仍然存在正相关(r分别为0.349、0.423,P分别为0.003、0.000)。血浆HCY及内毒素水平增加、年龄增长和舒张压升高可能是牙周炎患者罹患冠心病的促进因素,而女性性别优势可能是其抑制因素。2.在男性亚组中,3组人群的年龄、内毒素、SBP、DBP、STB、Hey、TC、LDL-C、VLDL-C、HDL-C差别均有统计学意义(P<0.05)。在男性病例组人群中,不同血浆内毒索水平四分位组间STB的差异有统计学意义(P<0.01)；血浆内毒素与TC和LDL-C之间存在正相关(r分别为0.427、0.452,p均小于0.000),校正年龄因素影响后,它们之间J仍然存在正相关(r分别为0.361、0.454,P分别为0.006、0.000)。血浆Hcy及内毒素水平增加和年龄增长可能是促进男性牙周炎患者罹患冠心病的影响因素,而血浆Fbg水平增加可能是其抑制因素。3.在老年亚组中,3组人群的年龄、内毒素、SBP、STB、Hcy、TC、LDL-C、 HDL-C差别均有统计学意义(P<0.05)。在老年病例组人群中,STB和DBP在血浆毒素水平四分位组间的差异均有统计学意义(P<0.05)；血浆内毒素与TC和LDL-C之间存在正相关(r分别为0.418、0.443,P均小于0.000),校正年龄因素影响后它们之间仍然存在正相关(r分别为0.320、0.399,P分别为0.008、0.001)。老年牙周炎患者罹患冠心病的易患因素可能是血.浆Hcy及内毒素水平增加,而其抑制因素可能是女性性别优势。4.浓度为1ng/mL时,P.g菌LPS能以时间依赖方式下调HUVEC细胞VE-cadherin蛋白及mRNA表达；100pg/mL浓度的P.g菌LPS仅在处理24h后才表现出上述下调作用；而10pg/mL和50pg/mL浓度的P.g菌LPS对HUVEC细胞VE-cadherin蛋白及mRNA表达无明显影响。5. HUVEC细胞增殖活力在10pg/mL组与空白对照组之间的差异没有统计学意义(P>0.05),细胞凋亡和caspase-3激活程度在这两组间也没有明显差异；50pg/mL组、100pg/mL组和1ng/mL组HUVEC细胞增殖活力明显低于空白对照组及10pg/mL组(P<0.01),并且随着P.g菌LPS浓度增加,HUVEC细胞增殖活力逐渐减低,而HUVEC细胞发生凋亡及caspase-3激活程度却逐渐增加。结论：1.血浆中牙周炎致病菌内毒素水平增加可能是促使牙周炎患者罹患冠心病的影响因素,并且牙周炎致病菌内毒素可能是通过与血.浆TC、LDL-C和Hcy及年龄增长等因素协同作用共同促进冠心病的发生与发展。2.牙周炎主要致病菌P.g菌脂多糖可能是通过抑制HUVEC细胞增殖和诱导HUVEC细胞凋亡的机制,直接引起血管内皮损伤,从而促进动脉粥样硬化病变的发生发展。3.P.g菌LPS可能不是通过直接影响HUVEC细胞VE-cadherin表达的途径增加内皮细胞间通透性,以利于动脉粥样硬化病变的形成。4.P.g菌LPS可能是通过激活caspase-3途径诱导HUVEC细胞产生凋亡的。 马晓薇[4]2013年在《1、牛磺酸及血管紧张素转化酶抑制剂对大鼠急性肺损伤的保护作用研究 2、ALI/ARDS影响因素分析》文中进行了进一步梳理目的急性肺损伤（ALI）是由各种外源性因素打击，导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭。ALI发病机制复杂，有效治疗手段少，死亡率高。本研究通过提前腹腔注射微量细菌脂多糖预激后，再次静脉注射细菌脂多糖诱导，建立急性肺损伤大鼠动物模型，观察急性肺损伤大鼠的病理生理改变及肺血管内皮细胞损伤的变化；分别给予牛磺酸、血管紧张素转换酶抑制剂及二药联合干预急性肺损伤大鼠，观察其治疗效果，探讨牛磺酸及血管紧张素转化酶抑制剂对大鼠急性肺损伤的保护作用及其相关机制。方法1分组：将126只SD清洁级大鼠随机分成5组：（1）正常对照组（n=6）；（2）急性肺损伤组：于静脉注射脂多糖后，分为3h、6h、9h、12h、24h五个时间点，每个时间点（n=6）；（3）牛磺酸治疗组：于静脉注射脂多糖后分为上述五个时间点，每个时间点（n=6）；（4）卡托普利治疗组：于静脉注射脂多糖后分为上述五个时间点，每个时间点（n=6）；（5）牛磺酸和卡托普利联合治疗组：于静脉注射脂多糖后分为上述五个时间点，每个时间点（n=6）。2建立急性肺损伤模型：腹腔注射脂多糖（LPS）（0.5mg/kg体重）预激12小时后，静脉注射LPS（5mg/kg体重），建立急性肺损伤动物模型，分别于静脉注射LPS后3h、6h、9h、12h、24h时间点采集标本。3正常对照组与治疗组：（1）正常对照组：生理盐水腹腔注射12小时，静脉注射生理盐水；（2）牛磺酸治疗组：LPS预激12小时后，腹腔注射牛磺酸（50mg/kg体重），静脉注射LPS；（3）卡托普利治疗组：LPS预激12小时后，腹腔注射卡托普利（1.25mg/kg体重），静脉注射LPS；（4）牛磺酸联合卡托普利治疗组：脂多糖预激12小时后，腹腔注射牛磺酸（50mg/kg体重）及卡托普利（1.25mg/kg体重），静脉注射LPS；正常对照组静脉注射生理盐水后3h、各治疗组静脉注射LPS后3h、6h、9h、12h、24h时间点采集标本。4检测指标：（1）测定肺湿干比重（W/D ratio）；（2）动脉血氧分压(PaO2)；（3）肺组织病理学观察,计算肺损伤病理学评分；（4）采用ELISA法检测血浆中的血管性血友病因子（vWF）的水平、内皮素-1（ET-1）、可溶性细胞间黏附分子-1（sICAM-1）、血栓调节蛋白（TM）、血小板活化因子(PAF)；（5）采用ELISA法检测肺泡灌洗液中的血管性血友病因子（vWF）的水平、内皮素-1（ET-1）、可溶性细胞间黏附分子-1（sICAM-1）、血栓调节蛋白（TM）、血小板活化因子(PAF)的水平。5统计学分析：所产生数据均采用SPSS11.5统计软件进行，计量资料以x±s表示；成组设计的多样本均数的比较采用单因素方差分析进行检验；组间多重比较采用SNK检验，取a=0.05，以P<0.05有统计学意义。结果1肺湿干比重(W/D ratio)：与正常组比较，W/D ratio值在肺损伤组五个时间点均明显升高（P<0.05），12h、24h时间点升高比较突出；与肺损伤组相比较，牛磺酸治疗组、卡托普利治疗组及两者联合治疗组各时间点W/D ratio值均较肺损伤组有不同程度的降低（P<0.05），但略高于正常组水平，以两者联合治疗后W/D ratio值降低明显（P<0.05）。2动脉血氧分压(PaO2)：与正常组比较，肺损伤组动脉血氧分压（PaO2）在各个时间点较正常对照组明显降低（P<0.05）；各时间点PaO2值接近，无变化趋势；与肺损伤组比较，牛磺酸治疗组、卡托普利治疗组及两者联合干预后PaO2值在各时间点均较肺损伤组有提高（P<0.05），但仍低于正常组PaO2值；以牛磺酸和卡托普利联合干预后PaO2值升高显着，尤其在12h、24h时间点升高较为突出。3病理学组织切片观察：与正常对照组比较，肺损伤组肺泡正常结构部分破坏，局灶性出血，炎症细胞浸润，肺泡间隔明显增厚，肺泡腔变窄，部分肺泡萎陷。牛磺酸组、卡托普利组及两药联合干预后能使上述病理变化改善。肺损伤病理学评分：与正常对照组比较，肺损伤组的病理学评分较正常对照组明显升高（P<0.05）；牛磺酸组、卡托普利组及两药联合干预后，所有治疗组肺损伤组织病理学评分明显低于肺损伤组（P<0.05），在9h、12h、24h时间点降低较突出；但各治疗组肺损伤病理学评分仍略高于正常组；以两药联合干预后肺损伤病理学评分降低最显着（P<0.05）。4血浆中vWF、 ET-1、sICAM-1、TM、PAF因子水平检测：与正常对照组相比，血浆中各因子水平在肺损伤组几乎所有时间点均升高，多数分别在3h、6h、9h时间点升高明显（P<0.05）；在牛磺酸组、卡托普利组及两药联合治疗组干预后血浆各因子水平在多数时间点较肺损伤组降低（P<0.05），以两者联合治疗后血浆各因子水平较肺损伤组降低较明显（P<0.05）；但所有治疗组血浆各因子水平在多数时间点依然略高于正常对照组。5肺泡灌洗液中vWF、 ET-1、sICAM-1、TM、PAF水平检测：与正常对照组相比，肺泡灌洗液中各种因子水平在肺损伤组所有时间点均较正常组升高（P<0.05），多数在3h、6h、9h时间点升高明显（P<0.05）；在牛磺酸组、卡托普利组及两药联合治疗组干预后各组多数时间点较肺损伤组降低（P<0.05），以两者联合干预降低较明显（P<0.05）；但各治疗组BALF中各因子水平多数依然略高于正常对照组。结论：1本研究通过提前腹腔注射小剂量内毒素预激，联合静脉内注射内毒素，大鼠肺湿干比重增加，动脉血氧分压降低，肺病理变化明显，肺损伤病理学评分升高，证明成功地建立了内毒素诱导型大鼠急性肺损伤的动物模型，模型稳定，此种制模方法目前较少见。2急性肺损伤时存在肺血管内皮细胞的活化和损伤，反应内皮细胞活化和损伤的血浆及肺泡灌洗液中的细胞因子水平增高明显，无相对固定的变化规律。3牛磺酸对急性肺损伤及其肺血管内皮细胞有治疗和保护作用。4血管紧张素转换酶抑制剂对急性肺损伤及其肺血管内皮细胞有治疗和保护作用。5牛磺酸及血管紧张素转换酶抑制剂联合应用对急性肺损伤及其肺血管内皮细胞有治疗和保护作用，效果优于单药干预治疗，提示可以考虑联合应用。目前国内尚未见两药联合治疗ALI的研究报道。目的：通过收集宁夏医科大学总医院ICU科ALI/ARDS患者的临床资料，对可能导致ALI/ARDS的发生、影响病情发展及预后的相关临床影响因素进行分析，以提高对ALI/ARDS的致病因素早期识别，早期预防，减少ALI/ARDS的发生率，降低死亡率，提高救治率。方法：回顾性研究2010年3月到2012年12月宁夏医科大学总医院综合ICU科收治的病人，将其中符合ALI/ARDS诊断标准的患者列为研究观察对象，这些病例被分为叁组：①初次诊断为ALI组与ARDS组；②ALI好转组与ALI转化为ARDS组；③ARDS存活组与死亡组；对这叁组患者分别从病因学；基本状况，年龄、性别、是否合并慢性疾病；是否合并急性器官障碍及其种类及数目；血气分析指标、APACHEII评分等多个临床因素进行统计分析。统计学分析:用统计学软件SPSS11.5进行统计学分析，数值变量采用x±s表示：计量资料两组间比较采用独立样本的t检验，计数资料采用单因素方差分析（x2检验）；多因素分析采用条件Logistic回归方法。结果：14125例病人中诊断ALI154例、ALI的构成比3.73%；诊断ARDS221例, ARDS的构成比5.36%；ALI/ARDS总构成比9.09%。ALI中18例死亡，病死率11.69%；ARDS中118例死亡，病死率53.40%；ALI/ARDS总病死率36.27%。2ALI中女性41例（26.62%），男性113例（73.38%），平均年龄为51.05±18.03岁；病因中创伤58例（37.66%），感染45例（29.22%），合并慢性病36例（24.68%），合并≥3个急性器官功能障碍39例(25.32%)； APACHEII评分均数16.47±7.79；平均住院天数为13.86±13.54天。3ARDS中女性61例(27.6%)，男性160例(72.4%)，平均年龄为53.57±16.38岁；病因中创伤93例(42.08%)，感染109例(49.32%)，合并慢性病77例(34.8%)，合并≥3个急性器官功能障碍101例(45.70%)；APACHEII评分16.77±6.80。平均住院天数为14.28±12.57天。4初始诊断ALI组与ARDS组结果示：原发致病因素中，肺部感染(P=0.003)、感染性休克(P=0.008)、其他部位感染(P=0.015)、手术术后（P<0.001）、不明原因（P=0.001）有统计学差异；多因素分析示纳入研究的各影响因素无统计学差异。5ALI好转组与ALI转化为ARDS组结果示：原发致病因素中，肺部感染(P<0.001)、脓毒症（P=0.008）、感染性休克(P=0.011)、手术术后（P<0.001）有统计学差异；多因素分析示纳入研究的各影响因素中，急性心血管系统障碍（P=0.016）、急性肝脏系统障碍（P=0.004）、急性神经系统障碍（P=0.006）、pH值大小（P=0.038）有统计学意义；其他观察指标无统计学意义。6ARDS存活组与死亡组结果示：原发致病因素中，创伤（P=0.004）、肺部感染（P=0.006）、感染性休克（P=0.013）、不明原因（P=0.040）有统计学差异；多因素分析提示纳入研究的各影响因素中年龄（P<0.001）、急性心血管系统障碍（P=0.001）、PCO2（P=0.005）有统计学意义。其它观察指标无统计学意义。结论：1本院ALI的构成比3.73%，ARDS的构成比5.36%，ALI/ARDS总构成比9.09%。ALI的病死率11.69%%，ARDS病死率53.40%，ALI/ARDS总病死率36.27%。 ALI/ARDS发病以男性、中老年人多见；致病因素以创伤、感染多见；入院APACHEII评分均高，住院天数大于10天。2其他部位感染及手术术后和一些不明确原因较易诱发ALI；肺部感染、感染性休克较易诱发ARDS。肺部感染、手术术后所致的ALI好转率相对高，预后相对较好；感染性休克和脓毒症所致的ALI预后相对较差，较易发展为ARDS。创伤所致的ARDS预后相对较好，肺部感染和感染性休克所致的ARDS预后较差。3急性心血管系统、肝脏系统、神经系统的器官以及PH值大小可能为ALI病情恶化转化为ARDS的独立危险因素。合并≥3个器官功能障碍时，对ALI/ARDS的病情的发生发展及预后都有非常不良的影响。4年龄、心血管系统功能障碍、二氧化碳分压值可能成为影响ARDS预后的独立危险因素。 白涛[5]2017年在《白藜芦醇对小鼠败血症心脏损害保护作用的机制研究》文中认为研究背景:败血症心肌病(SIC)严重影响败血症预后。目前对SIC缺乏有效的治疗手段,寻找SIC的防治方法至关重要。研究证实,心肌肌浆网钙叁磷酸腺苷酶(SERCA2a)功能下调是SIC发生的重要原因,但其下调的机制没有阐明。受磷蛋白(PLB)是调控SERCA2a功能的重要蛋白,在机体内有两种存在形式,单聚体monomer和五聚体pentamer。单聚体能直接与SERCA2a结合,抑制SERCA2a的Ca2+摄取功能,而五聚体被认为是PLB在体内的储存形式,不具有生物功能和活性[6]。上述两种PLB存在形式在体内保持动态平衡。然而,目前还没有研究指出败血症是否能影响心肌PLB的存在形式进而下调SERCA2a功能。白藜芦醇(RSV)对多种心血管疾病中有治疗作用。我们的预实验发现RSV能预防SIC的发生。在这基础上,我们拟研究RSV是否对SIC有治疗作用,并探讨其机制是否与纠正SERCA2a-PLB异常有关。研究目的:1.RSV是否能治疗SIC。2.RSV治疗SIC的机制是否与纠正SERCA2a-PLB有关。3.RSV调控SERCA2a-PLB的机制。研究方法:采用腹腔注射(i.p.)大肠杆菌脂多糖(LPS,sigma corporation,055:B5 serotype,6 mg/kg)的方法建立小鼠SIC模型。雄性C57BL/6J小鼠(8周龄)分为4组,依次是对照组,RSV组,LPS组和LPS+RSV组。建模成功后,用动物心脏超声机测量小鼠心功能指标如:左室射血分数(EF%)、短轴缩短率(FS%)和左室舒张末期内径(LVEDD)等。并分离心肌细胞,测量不同条件下心肌细胞收缩力、钙瞬变曲线和活性氧水平。应用H-E染色观察心肌组织结构是否改变,使用免疫组织化学法检测心肌切片CD45+炎症细胞浸润数量。应用酶-抗体夹心法(ELISA)测量血浆Tn I和TNF-α、心肌ATP、MDA含量和心肌细胞/组织SERCA2a ATP酶活性。应用Western blot和或Real time PC R法检测心肌4-HNE、SERCA2a、NCX、Ry R2、IP3R、TNF-α、PLB、cleaved Caspase-3、Pgc-1α、Nrf-2及下游蛋白(CAT和NQO-1)表达情况。研究结果:1.LPS使EF%、FS%下降50%以上,伴有LVEDD显着增大,而在LPS注射后2小时用RSV治疗能显着纠正上述异常。离体细胞实验,LPS使细胞收缩幅度和钙瞬变峰值显着下降,收缩后恢复时间和钙瞬变衰减时间显着延长,而RSV能明显纠正心肌细胞机械功能和钙释放异常。2.血浆Tn I和心肌cleaved Caspase 3表达在LPS处理的小鼠中没有升高。血浆TNF-α在LPS处理的小鼠中显着升高,伴有心肌组织CD45+炎性细胞浸润明显增加,而心肌组织TNF-α表达水平在各组小鼠之间没有显著差异。RSV不降低血浆TNF-α水平,不减少心肌组织CD45+炎性细胞数量,心肌NCX、Ry R2和IP3R表达水平在各组之间无差异。心肌SERCA2a在LPS处理的小鼠中表达下降,活性降低,而RSV治疗可以上调SERCA2a表达,改善活性。3.LPS使心肌monomer-PLB增多,pentamer-PLB减少,这与LPS引起的氧化还原紊乱有关。LPS上调心肌4-HNE和MDA的含量,下调Nrf-2及下游蛋白(CAT和NQO-1)的表达,RSV治疗能明显减轻上述异常。离体细胞实验进一步发现:RSV能起到和一种ROS清除剂,N-乙酰半胱氨酸相似的作用,减少心肌细胞ROS水平,恢复受到抑制的SERCA2a功能,促进PLB从monomer转变为pentamer。结论:1.RSV能治疗SIC。2.RSV治疗SIC的机制与促进PLB从单聚体向五聚体转变,进而上调心肌SERCA2a功能有关。3.RSV调控PLB构象改变的机制与激活Nrf-2,调控细胞氧化还原有关。创新点:1.RSV通过激活Nrf-2,促进PLB从单聚体向五聚体转变,恢复受抑制的SERC A2a功能,对SIC起到治疗作用。2.本研究有望为白藜芦醇(或Nrf-2的直接激动剂)应用于临床防治SIC提供理论依据。综上所述,本研究首次阐明了RSV治疗SIC的一种新的机制:RSV通过激活Nrf-2及下游基因,调节细胞内氧化还原状态,促进心肌PLB从monomer向pentamer转变,恢复受抑制的SERCA2a功能。 杨方园[6]2017年在《人参二醇组皂苷对LPS导致的小鼠心肌损伤的保护作用》文中指出研究背景:脓毒症是一种由感染引起的全身性免疫应答综合征(SIRS),属于炎症反应失控导致全身多种器官发生功能障碍的一种疾病。脓毒症所引起的心肌功能障碍是严重的并发症之一,发生率达50%,这一并发症也是导致患者死亡或预后不良的起因。糖皮质激素治疗能扭转脓毒症心肌损伤的危急情况,然而,大剂量糖皮质激素突击疗法带来难以防治的并发症,如胃肠道应激出血,加重感染等。因此急需开发新型高效低毒的抗内毒素药物以替代糖皮质激素。人参是我国的传统中药,部分提取物具有优良的改善心功能作用,保护心肌细胞抵抗损伤和凋亡。人参二醇组皂苷(panaxadiols saponin,PDS)是一种脂溶性分子量小的二醇组提取物,其毒性较小,本课题组前期对PDS的系列研究发现,PDS可以改善失血性休克犬的心肺功能,还能改善脓毒症诱发的肾损伤,对脏器和细胞的功能及结构都有保护作用,深入研究其抗心肌损伤作用十分必要。研究目的:小鼠腹腔注射LPS模拟脓毒症时的心肌损伤模型,对比观察PDS和地塞米松对LPS诱导心肌损伤小鼠心功能的改善作用,探讨抗炎、抗凋亡、抗氧化应激等机制在PDS心脏保护机制中的作用,为其或可替代地塞米松类激素药物治疗LPS诱导的心肌损伤提供基础研究数据。方法与结果:1.建立LPS诱导的小鼠急性心肌损伤模型选择雄性纯系C57BL/6小鼠随机分为四组(n=8),分别为:对照组,LPS组,LPS+PDS组,LPS+DEX组。对照组小鼠腹腔注射0.5 ml PBS缓冲液,LPS+PDS组小鼠腹腔注射PDS(25 mg/kg),LPS+DEX组小鼠腹腔注射地塞米松(2.5 mg/kg);1小时后,LPS组、LPS+PDS组、LPS+DEX组小鼠腹腔注射LPS(10 mg/kg)。在LPS注射后7小时,麻醉小鼠进行超声心动图检测。在LPS注射后9小时处死小鼠,收集血液和心脏组织进行检测。超声心动图结果显示,与对照组小鼠相比,LPS组小鼠心脏的射血分数(ejection fraction,EF)、缩短分数(fractional shortening,FS)显着下降(P<0.01),左室后壁变薄,左室腔增大,室间隔变薄(P<0.01),同时LPS组小鼠的HE染色结果显示,心肌细胞周围出现大量炎性细胞浸润,肌细胞纤维变形,表明急性心肌损伤模型建立成功。2.PDS具有保护LPS诱导的急性心肌损伤小鼠心功能的作用与LPS模型组相比,LPS+PDS组小鼠腹腔注射PDS后,超声心动图检测显示其心功能的多项指标得到改善,EF和FS得到恢复,左心室形态也趋于正常,这一结果与LPS+DEX组小鼠结果相似。另一方面,检测小鼠心肌损伤标志物LDH和CK发现,LPS诱发的心肌炎性损伤使LDH和CK水平显着升高(P<0.01),在经过PDS和DEX治疗后下降。以上结果说明PDS和DEX可以在一定程度上改善LPS引起的小鼠心肌损伤,达到治疗效果。3.PDS可降低LPS诱导的急性心肌损伤小鼠血清和心肌组织中TNF-α和IL-6水平增高试剂盒检测小鼠血清中TNF-α、IL-6的水平,结果显示LPS组小鼠与对照组相比TNF-α、IL-6水平明显升高(P<0.05),表明LPS引起大量炎性因子入血;LPS+PDS组的TNF-α和IL-6的含量与LPS组相比,显着降低(P<0.05);DEX组相较于LPS组,TNF-a有所下降,但没有统计学意义;IL-6的含量显着降低(P<0.05)。检测小鼠心肌组织中TNF-α、IL-6的的m RNA水平,发现小鼠心脏组织中IL-6的m RNA水平组间没有差异;而TNF-α的m RNA水平在LPS组小鼠中显着增加(P<0.05),PDS和DEX治疗后显着下降(P<0.05)。提示PDS和DEX可能是通过抑制炎症反应来起到心肌保护作用。4.PDS可减少LPS诱导的急性心肌损伤小鼠心肌细胞凋亡使用Western Blot的方法检测各实验组凋亡相关蛋白在心脏中的表达情况。结果显示LPS组的小鼠与对照组小鼠相比凋亡蛋白Cleaved PARP,Cleaved caspase3,Bax的表达显着增加(P<0.05),细胞色素C表现出增多的趋势;抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显减少(P<0.05)。而LPS+PDS组与LPS组相比凋亡蛋白Cleaved PARP,Cleaved caspase3,Bax,Cyto C的表达明显减少(P<0.05);DEX治疗组凋亡蛋白Cleaved PARP,Cleaved caspase3也明显减少(P<0.05),Bax,和Cyto C有减少趋势,由此可见,PDS和DEX可以影响凋亡相关蛋白的表达,减少LPS引起的心脏细胞凋亡,起到保护心肌组织的作用。5.PDS可抑制LPS诱导的急性心肌损伤小鼠心脏NF-κB信号通路激活Western Blot结果显示LPS组小鼠心脏组织中磷酸化IκBα(p-IκBα)水平显着升高(P<0.05),p-IκBα/t-IκBα比值也明显增加(P<0.01)。当给予PDS和DEX作用后,可以显着降低p-IκBα/t-IκBα比值(P<0.01)。提取心肌细胞核蛋白,检测各组p50和p65的表达水平,发现,与对照组小鼠相比,LPS组小鼠心脏细胞核中NF-κBp50和p65蛋白表达水平显着升高(P<0.05),当给予了PDS和DEX治疗后,NF-κB p50和p65蛋白表达水平都有了明显的下降(P<0.05)。可见,NF-κB信号通路的活化被PDS和DEX抑制,LPS诱导的p50和p65蛋白入核减少,逆转了LPS诱导的小鼠心肌损伤。6.PDS可减轻LPS诱导的急性心肌损伤小鼠心肌氧化应激水平检测了四组小鼠心肌组织中NAD+/NADH的变化,发现在LPS组小鼠中这一比值明显高于对照组(P<0.01),提示在LPS引起的小鼠急性心肌损伤中,NAD+/NADH体内稳态破坏,细胞氧化损伤加重,心肌组织中MDA水平也明显增加(P<0.05),SOD的表达明显减少(P<0.05)。而经过PDS和DEX治疗后,NAD+/NADH比值出现明显的下调(P<0.05),MDA水平也出现下调,SOD表达恢复(P<0.05),说明减少细胞氧化损伤可能也是PDS抗LPS心肌损伤的机制之一。结论:1.PDS具有与地塞米松类似的改善LPS诱导的急性心肌损伤小鼠心脏的收缩功能,抑制炎性因子产生,减少心肌细胞的凋亡和氧化应激损伤的作用。2.PDS改善LPS诱导的急性心肌损伤的作用机制可能与抑制NF-κB信号通路的活化有关。 魏艳玲[7]2010年在《母体孕期炎症免疫刺激导致子代大鼠心肌血管重构及其机制初步研究》文中指出心血管疾病具有高患病率、高致残率、高死亡率的特点,其发病率和死亡率已超过肿瘤性疾病而跃居第一。心肌血管重构是心血管疾病发生发展的病理基础,心肌重构能够导致猝死、心肌梗死、心律失常等心血管意外事件,其中由重构而心衰是心血管疾病患者死亡的主要原因之一。血管重构是引起血管疾病和循环功能紊乱的病理基础,是引起高血压各种严重并发症的关键环节。对于心肌血管重构的病因研究目前主要包括机械刺激、神经体液因素等,仅仅是围绕成年个体展开,尚未完全阐明。近年来包括我室在内的关于炎症在心血管疾病发病中重要作用的发现是对心血管疾病病因寻找中最重要的进展之一,我室经过近7年的孕期炎症免疫刺激与子代心血管疾病之间关系的探索研究,成功地建立了大鼠孕期腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及酵母多糖(zymosan)引起子代高血压和体重增加的动物模型,并在一系列实验的基础上,提出了高血压病因探索的新假说:原发性高血压的形成可能要追溯来自于孕期的炎症免疫刺激所致,这一发现作为特别首报发表于2007年期刊《Acta Pharmacologica Sinica》。进一步研究发现子代动物出现了肾素-血管紧张素及内皮素系统的高表达,这一系列神经体液因素的改变,是心肌、血管重构发生的重要危险因素,因此,我们推测孕期的炎症免疫刺激可能会导致子代大鼠的心肌、血管重构,从而可能引发患者更为严重的心血管事件发生甚至死亡,据此我们在原有实验基础上,将所提出的假说拟进行范围上的延伸,即:原发性高血压、心肌血管重构等心血管疾病的形成可能要追溯来自于孕期的炎症免疫刺激所致。既往对于高血压、心肌血管重构等心血管疾病的预防和控制都是在病人成年以后,疾病已经发生了,才开始进行对症处理,该理论的提出将会扩大以往人们对于原发性高血压、心肌血管重构预防和治疗的时间窗。方法:1. 24只通过检查阴栓获得准确妊娠时间的怀孕SD大鼠,随机分为3组,叁组孕鼠分别在妊娠8、10、12天,腹腔注射0.79mg/kgLPS(LPS组);在孕第8、10、12天腹腔注射LPS 0.79mg/kg,第8-14天注射LPS后每天腹腔注射PDTC 100 mg/kg(LPS+PDTC组);在孕第8-14天腹腔注射无菌生理盐水1ml无菌生理盐水(对照组);因前期实验发现孕期8-14天单纯注射PDTC,对于孕鼠和仔鼠均没有任何影响,故此本实验未设PDTC组。子代大鼠随机选取用于该实验(雄性:对照组,n=18;LPS组,n=18;L+P组,n=18;雌性:对照组,n=18;LPS组,n=18;L+P组,n=18)。2.通过以下方法对孕期炎症免疫刺激及同时给予NF-κB抑制剂后导致子代大鼠的心血管功能变化进行评价:①大鼠血压的测定采用无创尾套法;②超声心动图评价大鼠的左心室、右心室结构和心功能;③心肥厚指数及左心室肥厚指数的测定评价大鼠的心室肥厚程度;④主动脉重构的评价采用病理切片HE染色,图像分析测定大鼠主动脉血管中层壁厚(MT)和内径(LD)并计算二者比值(MT/LD)的方法;⑤HE染色,光镜下观察大鼠心肌、血管平滑肌组织形态学改变;⑥透射电镜观察大鼠心肌细胞、血管平滑肌细胞超微结构的改变。3.用放射免疫法检测血浆ET-1水平、硝酸还原酶法测定血清NO含量、用TdT介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测左心室心肌细胞凋亡的变化,用免疫组织化学技术观察心肌、血管平滑肌NF-κBp65的激活、血管平滑肌细胞增殖细胞核抗原(PCNA),左心室Bcl-2抗原和Bax抗原表达的变化。结果:1.对照组、LPS组、L+P组每只孕鼠生育仔鼠的数量、雌雄比例及胎鼠出生体重,各组之间均没有明显统计学差异(P>0.05)。2.孕期炎症免疫刺激对于仔鼠血压的影响: LPS组仔鼠从2月龄起,同对照组仔鼠相比较,无论雌雄,血压均出现具有统计学意义的升高(P<0.05),该升高趋势一直持续到8月龄,在6月龄达到高血压标准,而在L+P组,则有效阻止了其血压统计学意义上的升高。3.孕期炎症免疫刺激对于仔鼠心室重构的影响:(1) LPS模型组仔鼠有明显的左心室重构现象:与正常组相比,LPS模型组仔鼠无论雌雄,在4月龄时出现了左室后壁厚度(PWT)的增厚,8月龄时则出现了左室后壁厚度(PWT)、室间隔厚度(IVST)、心肌肥厚指数(HMI)、左心室肥厚指数(LVMI)明显增高(p<0.05);而在L+P组,则有效改善了这一改变。(2) LPS模型组仔鼠有明显的心肌舒张功能障碍:与正常组相比,LPS模型组仔鼠无论雌雄,在8月龄时均出现了E/A指数、Tei指数的升高(p<0.05);而在L+P组,则有效改善了这一改变。(3)病理及电镜:①LPS模型组仔鼠,无论雌雄,心肌组织形态及心肌细胞超微结构受到损伤,光镜下可见心肌细胞明显浊肿,空泡样变化;细胞核肥大或固缩;细胞内容物呈颗粒状,断裂融合。电镜下可见心肌细胞肿大,核肥大、畸形、溶解等呈不规则变化;肌浆网扩张;线粒体增生明显,排列紊乱,不同程度(轻、中、重)肿胀,内有空泡形成。②在L+P组,孕期PDTC腹腔注射,能明显改善上述病理改变及心肌细胞超微结构,心肌组织形态及心肌细胞超微结构基本正常。4.孕期炎症免疫刺激对于仔鼠血管重构的影响:(1) LPS模型组仔鼠血管平滑肌存在明显重构现象:与对照组相比,4月龄和8月龄时,LPS组胸主动脉MT明显增加、LD也明显增大,而MT/LD值也明显增高(p<0.05),表明LPS组大鼠胸主动脉在4月龄时即存在着明显的血管重构现象。而在L+P组仔鼠则明显改善了这一现象。(2)病理及电镜:①LPS模型组仔鼠,无论雌雄,平滑肌细胞肥大增生明显,排列紊乱,细胞核明显增多。电镜下可见管壁中膜平滑肌细胞明显肥大,核形态不规则,核内常染色质丰富,核浆间隙增大,肌膜下吞饮小泡减少,肌丝成分少,细胞外纤维成分增多,平滑肌细胞内线粒体肿胀,密度低,呈现嵴溶解和空泡样变性,粗面内质网增多。②在L+P组,孕期PDTC腹腔注射,能明显改善上述病理改变及血管平滑肌细胞超微结构,血管平滑肌组织形态及平滑肌细胞超微结构基本正常。5.对孕期炎症免疫刺激导致仔鼠心肌血管重构的机制研究;(1) LPS模型组子代大鼠第2、4、6、8月龄血浆ET-1较对照组均显着升高(P<0.05),至8月龄子鼠出现心肌血管重构时,其水平升高加快,LPS组血浆ET-1水平为(151.07±19.03)μmol/L,较对照组(78.56±12.39)μmol/L和L+P组的(84.78±5.71)μmol/L明显升高接近1倍。(2) LPS模型组大鼠的心肌和血管平滑肌NF-κBp65被激活,从胞浆中转移到细胞核,阳性细胞比率明显较对照组和L+P组增多(P<0.01),在正常心肌和血管平滑肌组织中,则基本没有NF-κBp65表达。(3) LPS组子代大鼠左心室心肌细胞TUNEL阳性心肌细胞的数量较对照组和L+P组明显增多(P<0.01),左心室心肌细胞的Bcl-2抗原的表达明显下调(P<0.01)、而心肌细胞的Bax抗原的表达则明显上调(P<0.01)。(4)子代大鼠第2、4、6、8月龄血清NO各组之间较对照组无统计学差异(P>0.05),与对照组和L+P组相比,LPS组子代大鼠胸主动脉PCNA表达增加显着增加(P<0.01),说明其血管平滑肌细胞增殖明显。结论:1.孕期暴露于LPS后,子代大鼠6月龄时高血压形成,成功的建立了孕期炎症刺激导致子代高血压的大鼠动物模型。2.孕期暴露于LPS后,子代大鼠4月龄时出现了向心性重构现象,8月龄出现了向心性肥厚并伴有心肌舒张功能障碍,说明孕期LPS刺激导致了子代大鼠心肌重构,其发生于高血压形成之前并在高血压形成后明显加重。3.孕期暴露于LPS后,子代大鼠4月龄时出现了血管重构,8月龄时重构更加明显,表明孕期LPS刺激导致了子代大鼠的血管重构,同心肌重构一样发生于高血压形成之前,并在高血压形成后明显加重。4.孕期的炎症免疫刺激导致了子代大鼠心肌、血管重构的发生,其发病机制可能与血浆ET-1水平的升高和NF-κBp65的激活有关;其中子代大鼠心肌重构的机制,可能还与心肌细胞凋亡增多有关;血管重构的机制,可能还与ET-1/NO失衡,血管平滑肌细胞增殖增多有关。5.在孕期暴露于LPS同时给予NF-κB的抑制剂PDTC的子代大鼠,有效改善了血压升高、心肌血管重构的现象,NF-κB可能是生命早期有效防治子代心血管疾病发生的靶点之一。 孙萌[8]2017年在《LTB4/BLT1及其介导的关键信号通路在脓毒症心脏功能障碍中的作用机制研究》文中进行了进一步梳理脓毒症(Sepsis)是以多器官功能衰竭和心血管抑制为特征的全身炎症反应综合征,其死亡率高,预后差且治疗费用高,目前已成为非心血管重症病房中最常见的死亡原因。目前对脓毒症的研究大都聚焦于促炎与抗炎、氧化与抗氧化以及凝血与纤溶等诸多系统的启动、放大与调控。虽然已有许多新药上市,可以调节免疫功能、阻断脂质过氧化、恢复凝血/纤溶平衡等,但是其临床效果欠佳。而且,脓毒性休克是一种临床急症。心血管系统是重要的循环系统,心血管功能异常在脓毒症早期即已存在,尤其在严重脓毒症和脓毒症休克患者中较为显着,有较大比例患者存在左室收缩/舒张功能异常。临床研究证明心脏功能抑制显着增加脓毒血症病人的死亡率。脓毒性心功能障碍已经广泛被关注,但其潜在的机制没有很好的解释。白叁烯B4(LTB4)是一种强有力的炎性介质和趋化因子,通过与其相应受体结合而发挥生物学效应,其潜在的炎性脂调节可被涉及在支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化、急性呼吸窘迫综合征、类风湿关节炎和缺血性心脏病等多种疾病的病理生理过程。另外,LTB4通过白叁烯B4受体1(BLT1)介导白细胞聚集从而在脓毒症中发挥重要的作用。目前国外已有研究表明LTB4/BLT1通路参与天然免疫和获得性免疫系统免疫细胞功能的调控。LTB4介导的炎症已经证明在1型糖尿病患者中发生脓毒症的敏感性提高。研究发现在脓毒症中血清LTB4浓度提高促进血管内皮功能紊乱,脓毒症中血清LTB4浓度提高,使用BLT1受体拮抗剂后可使脓毒症诱导的各种器官损伤程度减轻,表明LTB4和BLT1对脂多糖诱导的急性心功能障碍可能起作用。腺苷5-单磷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是丝、苏氨酸蛋白激酶,主要协调能量和代谢的需要,是细胞能量稳态的重要调节因子。AMPK存在于细胞核和细胞质中允许快速变化(细胞质中蛋白质的磷酸化)和代谢过程的逐渐调整(基因转录的变化)以维持能量的稳态,可启动分解代谢途径,增加ATP的产生,同时关闭合成代谢途径,减少ATP的消耗。研究发现AMPK信号通路与脂多糖诱导的急性心功能障碍有关。值得注意的是,AMPK与能量代谢相关疾病如2型糖尿病、肥胖症、癌症、脑缺血损害、心脏缺血再灌注等相关。研究发现,AMPK信号通路在心脏面临缺血性损伤对能量需求增加时具有重要作用,活化的AMPK有助于增加葡萄糖摄取和糖酵解,加速脂肪酸氧化,增加心肌组织的能量供应,并可以抑制心肌细胞凋亡保护心肌组织,而且对血管平滑肌细胞、内皮细胞的增殖及能量代谢均有影响,在心血管重构过程中起重要作用。然而AMPK和BLT1两者在脂多糖致脓毒性心功能障碍中的关系尚不清楚。综上所述,我们提出:抑制LTB4/BLT1受体可能通过激活AMPK信号通路发挥抗脓毒性心功能障碍的作用,并最终通过减轻线粒体功能障碍和抗凋亡途径发挥心肌保护作用。本课题将采用一系列研究模型和实验方法,阐明AMPK和BLT1在脂多糖致脓毒性心功能障碍中的关系及具体作用机制。本研究中,我们探究LTB4/BLT1在脂多糖诱导的小鼠急性心肌损伤模型中的作用和阐明其潜在的机制。通过研究其作用机制和了解治疗靶点才能更好的用于指导临床,进一步改善脓毒症患者的病死率。第一部分:建立LPS诱导的脓毒性心功能障碍小鼠模型,研究抑制LTB4/BLT1受体后对脓毒性心功能障碍的影响目的:建立脓毒性心功能障碍小鼠模型,观察LTB4对脓毒症小鼠心功能的影响及抑制LTB4/BLT1受体后对小鼠心功能的影响,明确抑制LTB4/BLT1受体对脓毒症小鼠心功能的作用。方法:C57小鼠腹腔注射脂多糖(LPS)建立脓毒症模型,观察LTB4对脓毒症小鼠心功能的影响。实验分为5组:(1)Control;(2)LPS;(3)LTB4;(4)LTB4+LPS;(5)U753021μM+LTB4。观察不同浓度LTB4/BLT1受体抑制剂U75302对脓毒性心功能障碍小鼠的影响。实验分为5组:(1)Control;(2)LPS;(3)U75302 0.25μM+LPS;(4)U753020.5μM+LPS;(5)U75302 1μM+LPS。LPS(6mg/kg),LPS(6mg/kg)+U75302(0.25,0.5,1mg/kg),LTB4(10mg/kg),腹腔注射,对照组给予PBS。U75302(0.25,0.5,1mg/kg),LPS注射前1h进行。LPS注射6h后,小鼠麻醉接受超声心动图检测。记录超声心动图指标,包括:左室射血分数(left ventricular ejection fractions,LVEF%)、左室缩短分数(left ventricular fractional shortening,FS%),和舒张早期到晚期二尖瓣充盈峰值流速比(the peak velocity ratios of early to late mitral inflow filling,E/A ratio)。结果:1)LTB4是否对脓毒症小鼠心功能造成影响。超声心动图分析表明,LTB4组FS%和EF%显着减低(与Control组相比,P<0.01);LPS+LTB4组FS%和EF%显着减低(与LPS组相比,P<0.05);U75302+LTB4组中小鼠的EF轻度减低(与Control组相比,P>0.05)。表明LTB4可导致脓毒症小鼠心功能的损伤。2)不同浓度LTB4/BLT1抑制剂U75302对脓毒症小鼠的心功能是否有保护作用。超声心动图分析表明,LPS处理组可导致FS%和LVEF%有意义的减低,E/A比显着增加(与Control组相比,P<0.05)。U75302预处理组逆转了FS%和LVEF%的减低和E/A比增加,还呈浓度依赖性(与LPS组相比,P<0.05)。结果表明不同浓度U75302(0.25,0.5,1μM)对脓毒症小鼠的心功能均有明确的保护作用。结论:(1)LPS可以诱导脓毒症小鼠心功能损伤,LTB4可加剧脓毒症小鼠心功能损伤;(2)LBT4/BLT1抑制剂U75302可能有保护脓毒症小鼠心功能损伤的作用。第二部分:研究抑制LTB4/BLT1受体对脓毒症小鼠心肌炎症、凋亡、线粒体功能、生存率的影响及可能的作用机制目的:观察LTB4/BLT1受体抑制剂U75302对脓毒症小鼠心肌炎症、凋亡、线粒体功能的各项指标、小鼠生存率的影响及可能的作用机制。方法:实验分为5组:(1)Control;(2)LPS;(3)U75302 0.25μM+LPS;(4)U75302 0.5μM+LPS;(5)U75302 1μM+LPS。LPS(6mg/kg),LPS(6mg/kg)+U75302(0.25,0.5,1mg/kg),腹腔注射,对照组给予PBS。U75302(0.25,0.5,1mg/kg),LPS注射前1h进行。LPS注射6h后,测血浆LTB4的水平。BLT1另一种抑制剂CP105,696也用于评估其对脓毒性心功能障碍心肌炎症、凋亡和线粒体功能的影响。1)通过Real-time PCR法检测TNF-α和IL-6m RNA水平,Western blot法检测p NF-k B和Ik B-α蛋白表达来评估不同浓度BLT1抑制剂U75302对脓毒性心功能障碍小鼠心肌炎症的影响;2)通过Westernblot法检测BCL-2、BAX和cleaved caspase-3的蛋白表达来评估不同浓度BLT1抑制剂U75302对脓毒性心功能障碍小鼠心肌凋亡的影响;3)分离提取心肌细胞线粒体,评估complex I(Nd)and complex IV(Co)亚单位密码m RNA表达通过通过Real-time PCR法检测核DNA(Cox4i and Cox5a)or mt DNA(mt-Nd1,mt-Nd2,mt-Co1,and mt-Co2),Western blot法检测ComplexⅠ、ComplexⅡ和OPA1蛋白表达来评估不同浓度BLT1抑制剂U75302对脓毒性心功能障碍小鼠心肌线粒体生物学和功能学的影响;4)通过Westernblot法检测p AMPK、AMPK、p ACC、ACC和PGC1α的蛋白表达来评估不同浓度BLT1抑制剂U75302对保护脓毒症小鼠心功能障碍可能的作用通路;5)基于之前的研究,我们选择U75302 1mg/kg作为最佳浓度。实验分为3组:(1)PBS;(2)LPS;(3)LPS+U75302,LPS(30mg/kg),LPS(30mg/kg)+U75302(1mg/kg),腹腔注射,对照组给予PBS。U75302(1mg/kg),LPS注射前1h进行。LPS注射6h后,观察6h到3d内小鼠生存率并绘制Kaplan-Meier生存曲线。结果:1)LPS预处理后显着增加TNF-α和IL-6m RNA水平及p NF-k B表达(与Control组相比,P<0.05),但是Ik B-α表达减少(与Control组相比,P<0.05),然而U75302可以显着降低TNF-α,IL-6和p NF-κB表达水平及增加Ik B-α表达(与LPS组相比,P<0.05)。BLT1另一种抑制剂CP105,696可以逆转p NF-k B增加和Ik B-α减少(与LPS组相比,P<0.05)。2)LPS预处理可导致心肌凋亡,相关凋亡蛋白Bcl-2表达减少,Bax和cleavedcaspase-3表达增加(与Control组相比,P<0.05)。然而U75302可以降低凋亡呈浓度依赖的方式(与LPS组相比,P<0.05)。BLT1另一种抑制剂CP105,696可以减少凋亡,Bax表达减少,Bcl-2表达增加。(与LPS组相比,P<0.05)。3)LPS预处理可致complexⅠ,complexⅡ和OPA1表达减少(与Control组相比,P<0.05),核DNA和mt DNA缺失(P<0.05);U75302可以减弱这些改变和保持complex I,complex II and OPA1表达(P<0.05);U75302轻度的逆转m RNA在线粒体的改变(与LPS组相比,P<0.05)。BLT1另一种抑制剂CP105,696通过保持complex I,complex II and OPA1表达可以减轻线粒体损伤。4)LPS预处理后可致p AMPK,p ACC和PGC1α显著增加(与Control组相比,P<0.05)。U75302抑制BLT1受体后导致p AMPK,p ACC和PGC1α表达的增加(与LPS组相比,P<0.05),这表明AMPK信号传导途径的进一步被活化。5)Kaplan-Meier生存曲线结果显示,LPS+U75302组小鼠在LPS注射后72h死亡率显着减低(与LPS组相比,P<0.01)。结论:抑制LTB4/BLT1受体,可以保护脓毒症小鼠心肌细胞炎症、凋亡及线粒体损伤且该保护可能是通过AMPK信号通路介导,从而明确LTB4/BLT1抑制剂U75302对脓毒症小鼠心功能损伤的保护作用。第叁部分:研究AMPK信号通路是否参与BLT1抑制剂对毒性心功能障碍的保护作用并探讨其作用机制目的:进一步探讨AMPK信号通路在LPS诱导的小鼠脓毒性心功能障碍过程中可能的作用并阐明其作用机制。方法:1)实验分为5组:(1)Control;(2)LPS;(3)U75302 0.25μM+LPS;(4)U753020.5μM+LPS;(5)U75302 1μM+LPS。 LPS(6mg/kg),LPS(6mg/kg)+U75302(0.25,0.5,1mg/kg),腹腔注射,对照组给予PBS。U75302(0.25,0.5,1mg/kg),LPS注射前1h进行,腹腔注射。通过Western blot方法检测p AMPK/AMPK,p ACC/ACC,PGC1α表达来评估AMPK通路阻断剂Compound C对U75302抗脓毒性心功能障碍是否有影响。2)实验分为4组:(1)LPS;(2)LPS+Compound C;(3)LPS+U75302;(4)LPS+U75302 + Compound C。LPS(6mg/kg),LPS(6mg/kg)+Compound C(20mg/kg),LPS(6mg/kg)+U75302(1mg/kg),LPS(6mg/kg)+U75302(1mg/kg)+ CompoundC(20mg/kg),腹腔注射。U75302(1mg/kg),LPS注射前1h进行。Compound C(20mg/kg),LPS注射前30min进行。1 LPS注射6h后,小鼠麻醉接受超声心动图检测。观察AMPK通路阻断剂Compound C对U75302抗脓毒性心功能障碍作用的影响。记录超声心动图指标,包括:左室射血分数(left ventricular ejection fractions,LVEF%)、左室缩短分数(left ventricular fractional shortening,FS%),和舒张早期到晚期二尖瓣充盈峰值流速比(the peak velocity ratios of early to late mitral inflow filling,E/A ratio)。2 Real-time PCR法检测TNF-α和IL-6m RNA水平,Western blot法检测p NF-k B和Ik B-α蛋白表达来评估AMPK通路阻断剂Compound C对U75302抗脓毒性心功能障碍心肌炎症的影响。3 Western blot法检测BCL-2、BAX和cleaved caspase-3的蛋白表达来评估AMPK通路阻断剂Compound C对U75302抗脓毒性心功能障碍心肌凋亡的影响。4分离提取心肌细胞线粒体。Real-time PCR法检测Cox4i、Cox5am RNA和mt-Nd1、mt-Nd2、mt-Co1、mt-Co2m RNA水平,Western blot法检测ComplexⅠ、ComplexⅡ和OPA1蛋白表达来评估AMPK通路阻断剂Compound C对U75302抗脓毒性心功能障碍心肌线粒体生物学和功能学的影响。结果:1)U75302处理能显着提高p AMPK/AMPK、p ACC/ACC和PGC1α蛋白的表达(与control或LPS组相比,P<0.05)。2)Compound C没有导致FS%,E/A比或LVEF%改善(与LPS组相比,P>0.05)。然而,Compound C可以显着地降低FS%和LVEF%,增加E/A比(与LPS+U75302组相比,P<0.05)。3)Compound C处理后TNF-α、IL-6 m RNA、p NF-κB和IκB-α蛋白表达水平轻度改变(与LPS组比较,P>0.05)。然而,Compound C通过上调TNF-α、IL-6 m RNA和p NF-κB蛋白表达水平,下调IκB-α蛋白表达水平逆转了U75302的抗炎症作用(与LPS+U75302组比较,P<0.05)。4)Compound C显着地抑制AMPK和ACC磷酸化,轻度的下调PGC1α表达(与LPS组比较,P<0.05)。而且,Compound C逆转了通过U75302处理后PGC1α、AMPK和ACC磷酸化的上调表达(与LPS+U75302组比较,P<0.05)。5)Compound C处理没有影响凋亡依赖蛋白的表达(与LPS组比较,P>0.05)。然而,Compound C逆转U75302处理后Bcl-2的增加和Bax及cleaved caspase-3的减少(与LPS+U75302组比较,P<0.05)。6)Compound C处理没有影响complex I,complex II and OPA1表达(与LPS组比较,P>0.05)。然而,Compound C处理下调complex I,complex II and OPA1表达(与LPS+U75302组相比,P<0.05)。mt-Nd1,mt-Nd2,mt-Co1,mt-Co2,Cox4i and Cox5a m RNA水平与Western blot检测结果显示呈一个持续的趋势。结论:抑制LTB4/BLT1受体减轻心肌细胞炎症及凋亡,其可能通过激活AMPK信号通路,抑制NF-κB信号传导和线粒体损伤来介导发挥抗脓毒性心功能障碍的保护作用。 朱坤杰[9]2007年在《朱砂雄黄在安宫牛黄丸抗大鼠脑损伤中的作用及机制研究》文中提出安宫牛黄丸是中医传统的“瘟病叁宝”之一,具有清热解毒、镇惊开窍的功效,主治瘟病高热、神昏、中风、口眼歪斜、筋脉牵引、痰痫壅盛等证。临床实践证明,安宫牛黄丸对各种原因所致的脑功能障碍及昏迷,都具有确切的促进清醒作用。但由于组方中朱砂、雄黄含有HgS和As2S2,且近年来关于安宫牛黄丸引起汞毒性肾病等临床毒副作用的报道不断出现,使人们对安宫牛黄丸使用的安全性及朱砂、雄黄在方中存在的合理性提出质疑。因此,朱砂、雄黄在安宫牛黄丸不同药理作用中存在的意义成为关注的焦点。已有研究表明,安宫牛黄丸对脑细胞有明显的保护作用,并提出其脑保护作用即可能是安宫牛黄丸开窍醒脑作用的主要机制之一。含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸可增加皮层神经元c-fos的表达,对皮层神经元有直接的激活作用,而去朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对皮层神经元的活化作用明显减弱。这些资料提示,朱砂、雄黄可能在安宫牛黄丸改善脑损伤中发挥一定作用。对朱砂、雄黄在安宫牛黄丸改善脑损伤、促清醒中的作用及机制进行深入研究,可为朱砂、雄黄在方中存在的合理性提供实验依据。2006年北京市科委立专项课题(课题编号:H040230130710),探讨安宫牛黄的安全范围及朱砂、雄黄在安宫牛黄丸中存在的必要性。本研究作为北京市科委研究专项的一部分,主要采用大鼠内毒素脑损伤和缺血性脑损伤两种模型,观察含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对不同脑损伤大鼠脑电图的影响。采用放射性配体结合法、免疫组织化学(IHC)、分子生物学等方法,观察含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对脑损伤胆碱、单胺类递质功能及突触超微结构的影响,同时观察了方中等量朱砂+雄黄、雄黄、朱砂的作用,探讨含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对脑损伤的改善作用,并分析朱砂、雄黄在其中存在的意义。1含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对脑损伤大鼠脑电图的影响脑电图(EEG)作为一种自发电活动,是脑功能变化的客观指标,和大脑皮层的活动水平密切相关。意识状态的变化和EEG改变存在密切的关系,改善机体的意识状态,同时伴有EEG的激活。EEG在睡眠向觉醒过渡过程中的转化,称为EEG激活,激活时慢波被抑制快波节律增加,即主要表现β波增加。EEG激活是觉醒的标志,也是大脑皮层活动增强的标志。在哺乳动物的新皮层EEG激活反映了行为唤醒状态。δ波是频率在0.5～3Hz之间的慢波,各种脑损伤意识障碍时EEG的典型特征是皮层广泛的δ波出现。抑制脑损伤δ波活动、增加β波活动、激活脑电图可能是安宫牛黄丸改善脑损伤、促进清醒的重要标志。实验以大鼠缺血性脑损伤、内毒素脑损伤为模型,观察了含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对大鼠脑损伤脑电图β波、δ波功率和相对功率的作用。1.1对缺血性脑损伤大鼠皮层EEG的影响将预先放置皮层永久电极的SD大鼠随机分为6组:假手术组,模型组,含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸(全方)高剂量组(0.4g/kg)、低剂量组(0.2g/kg),不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸(简方)高剂量组(0.32g/kg)、低剂量组(0.16g/kg)。假手术组及模型组分别灌胃等容量的蒸馏水,连续给药3天后,末次给药后1h,采用MCAO法复制大鼠脑缺血模型,缺血后即刻描记大鼠左右额顶叶皮层EEG。结果显示,造模后大鼠双侧额顶叶皮层脑电图β波的功率及相对功率均降低,δ波功率降低,而相对功率增加,和对照组比较,均P<0.05。全方可使缺血侧β波相对功率提高;简方作用不明显。简方和全方均可提高未缺血侧δ波功率。1.2对LPS脑损伤大鼠皮层EEG的影响将预先放置皮层永久电极的SD大鼠随机分为9组:对照组,模型组,全方高剂量(0.4g/kg),全方低剂量组(0.2g/kg),简方高剂量组(0.32g/kg),简方低剂量组(0.16g/kg),朱砂+雄黄组(0.08g/kg),雄黄组(0.04g/kg),朱砂组(0.04g/kg)。按上述剂量连续给药3天,末次给药后1h,采用LPS 16mg/kg尾静脉注射复制内毒素脑损伤模型,连续描记LPS注射后1h、2h、4h、6h大鼠额顶叶皮层EEG的变化,并观察药物对内毒素脑损伤6h后皮层EEG的影响。结果显示,内毒素可引起大鼠皮层EEGβ波功率和相对功率持续降低,δ波相对功率升高,即表现脑电图的快活动(主要β波)减弱,慢活动(主要δ波)增强,且以内毒素注射后6h变化最显着,和对照组比较,P<0.05。全方可提高β波功率和相对功率,和模型组比,P<0.05;简方对β波功率的作用明显减弱,简方低剂量和全方比较差异显着,P<0.05,简方高剂量可以提高β波相对功率;朱砂+雄黄、雄黄可提高β波功率和相对功率。全方、简方、朱砂、雄黄均可抑制内毒素脑损伤6h脑电图δ波相对功率,组间差异不显着。小结:缺血性及内毒素性脑损伤脑电图的主要变化是:β波功率及相对功率明显降低,δ波相对功率明显提高,δ波功率降低或变化不明显。各组药物对δ波作用相同,但对β波的作用不同。全方可提高两种脑损伤β波功率及相对功率(和模型比,P<0.05);简方对β波作用弱,其中对LPS脑损伤β波功率作用和全方比,P<0.05,简方高剂量可提高β波相对功率,和模型比,P<0.05;朱砂+雄黄、雄黄、朱砂和全方的作用一致,也可使β波功率及相对功率提高,上述结果提示,朱砂、雄黄可能参与了安宫牛黄丸对脑损伤脑电图的激活作用。2含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对LPS脑损伤大鼠皮层、脑干胆碱系统的影响乙酰胆碱(Ach)是脑内主要的兴奋性神经递质,Ach通路的高功能状态对保持机体的觉醒状态具有重要作用,也是脑电图激活的直接通路之一。胆碱乙酰转移酶(ChAT)是Ach合成的唯一限速酶,可作为胆碱能神经活性的标志。乙酰胆碱酯酶(ChE)是Ach的代谢酶,主要调节脑内Ach的含量。M-R是G-蛋白偶联受体,Ach通过作用于M-R激活皮质,促进觉醒。实验将SD大鼠随机分7组:对照组,模型组,全方组(0.4g/kg),简方组(0.32g/kg),朱砂+雄黄组(0.08g/kg),雄黄组(0.04g/kg),朱砂组(0.04g/kg)。采用生化法、放射性配体结合法、免疫组化及分子生物学的方法,观察含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对LPS脑损伤6h大鼠皮层及脑干ChAT含量、ChE的活性、ChAT及ChATmRNA表达、Ach的含量、M-R的亲和力、G-蛋白的影响。观察含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对脑损伤中枢胆碱系统功能的影响及朱砂、雄黄在其中发挥的作用。2.1对LPS致脑损伤大鼠皮层及脑干Ach含量的影响采用碱性羟胺比色法测定皮层和脑干中Ach的含量,结果显示,LPS尾静脉注射后6h,大鼠皮层Ach含量变化不明显,但脑干Ach含量明显降低。全方可明显增加脑干Ach含量,和模型组比较,P<0.05;简方对脑干Ach含量作用不明显;朱砂+雄黄、朱砂、雄黄亦无明显作用。2.2对LPS致脑损伤大鼠皮层及脑干ChAT和ChE的影响静脉注射LPS后,可见皮层及脑干ChAT含量增加,ChE变化不明显。全方降低皮层及脑干ChAT含量,和模型组比较,P<0.05;简方对皮层及脑干ChAT含量增加均无明显影响,和全方比较,P<0.05;朱砂+雄黄、雄黄降低皮层ChAT含量的作用和全方相同。朱砂则使脑干ChAT含量降低。2.3对LPS脑损伤大鼠皮质不同区ChAT及ChATmRNA表达的影响免疫组化结果显示,脑内ChAT的表达主要集中在海马,在海马的4个区都有大量表达,皮层也有少量表达。LPS注射后,皮质第3层、海马CA1、海马CA3区的ChAT的表达均增加。全方可抑制3个部位ChAT的表达增加,和模型组比,P<0.05;而简方对ChAT表达无明显抑制作用,和全方比较,P<0.05;朱砂+雄黄、雄黄和全方相同,可以使ChAT在皮层和海马的表达减少。ChATmRNA检测结果显示,组间无明显差异。2.4对LPS脑损伤大鼠脑皮层及脑干M-R亲和力的影响采用放射性配体结合法测定皮层及脑干M-R亲和力。结果显示,LPS尾静脉注射6h后,皮层中M-R的亲和力降低,脑干中M-R亲和力提高。全方可使皮层M-R的亲和力增加;而简方对M-R亲和力无明显影响,和全方比较,P<0.05;朱砂+雄黄和全方相同,可使皮层M-R亲和力增加。2.5对LPS脑损伤大鼠皮层及脑干G-Protein含量的影响G-蛋白是细胞外信息进入细胞的门户,是M受体信号转导的重要组成部分。G-蛋白主要有两类:兴奋性G-蛋白(Gs),可激活腺苷酸环化酶(AC)使cAMP增加;抑制性G-蛋白(Gi),抑制AC,使cAMP减少,正常的Gsα/Giα比例是维持正常细胞功能的基础。LPS使皮层及脑干Gsα减少,而Giα含量增加,Gsα/Giα比值降低。全方通过增加Gsα含量,使Gsα/Giα比值提高;简方无增加Gsα含量的作用,可轻度降低Giα含量,提高Gsα/Giα比值;朱砂+雄黄、雄黄增加Gsα含量,提高Gsα/Giα比值作用,和全方一致。小结:LPS可损伤皮层及脑干胆碱系统,引起脑干Ach含量降低,皮层及脑干ChAT含量升高,皮层M-R亲和力降低,脑干M-R亲和力提高,皮层及脑干Gsα/Giα比值下降。全方可提高脑干Ach含量、降低皮层及脑干ChAT含量,提高皮层M-R亲和力,增加Gsα含量,上调Gsα/Giα比值,从而拮抗LPS引起的中枢胆碱系统功能的损伤;简方对LPS引起的皮层及脑干M-R亲和力、ChAT含量的变化无明显改善作用;朱砂+雄黄、雄黄在对皮层ChAT含量、G-蛋白含量、M-R亲和力的作用上和全方一致。因此,朱砂、雄黄在全方改善LPS引起胆碱能系统功能损伤中发挥作用,其中雄黄的作用更明显。3含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对LPS脑损伤大鼠皮层、脑干单胺系统的影响参与中枢兴奋性调节的单胺类递质主要包括:NE,5-HT,DA。NE,DA主要参与脑电和行为觉醒的维持,5-HT和Ach一起被称为皮层激活的直接通路,可见,单胺类递质参与中枢神经系统觉醒的维持。但脑内单胺类递质异常增多也可导致脑损伤。NE,DA,5-TH可能成为安宫牛黄丸改善脑损伤、促清醒作用的重要方面。本实验采用HPLC-ECD检测法,测定了大鼠尾静脉注射LPS 6h后皮层和脑干儿茶酚胺类及其代谢产物的含量变化。并对皮层及脑干MAO活性及皮层TH、THmRNA表达进行测定,观察含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对LPS脑损伤单胺递质系统的影响及朱砂、雄黄在其中的作用。实验分组、给药方法及造模方法同前。3.1对LPS脑损伤大鼠皮层、脑干单胺类递质及代谢产物含量的影响LPS注射后6h,可见皮层中NE、5-HT及代谢产物5-HIAA含量明显升高;DOPAC的含量降低,即主要表现为NE、5-HT两类递质的紊乱。全方有降低NE含量、增加DOPAC含量的趋势,且明显降低5-HIAA含量,和模型组比较,P<0.05;简方对皮层NE含量增加改善作用不明显,和模型组及全方组比较,P<0.05,也可使皮层DA含量显着升高,和其他各给药组比较,均有显着差异;单用朱砂、雄黄和全方相同,可降低NE含量,和模型组比较,P<0.05。LPS注射后,同样引起脑干NE、5-HT递质功能紊乱,即NE、5-HT、5-HIAA含量升高。全方可明显降低NE含量;简方对NE含量无影响;单用朱砂、雄黄可显着降低NE含量,和模型组比较,P<0.05。3.2对LPS脑损伤大鼠皮层、脑干单胺类递质TH及MAO的影响LPS及各组药物对大鼠皮层TH、THmRNA表达均无明显影响,皮层MAO活力略有降低,脑干MAO的活力略增加。全方和简方对LPS引起的皮层及脑干MAO的变化均显示一定的复衡作用。小结:LPS可导致NE、5-HT、5-HIAA在皮层及脑干大量增加,皮层MAO活力降低,脑干MAO的活力增加,引起NE、5-HT递质功能紊乱,致脑损伤。全方抑制皮层及脑干NE的增加,改善5-HT的代谢,并对LPS引起的MAO活性改变有轻度复衡作用;简方对皮层及脑干NE的增加无明显影响,并可增加皮层DA含量;而单用朱砂、雄黄可抑制皮层及脑干NE增加。朱砂、雄黄对NE的影响和全方的一致性,提示朱砂、雄黄在全方改善脑损伤单胺类递质紊乱中发挥作用。4含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对LPS脑损伤大鼠皮层锥体细胞形态及突触超微结构的影响神经元是中枢神经系统的基本结构和功能单位,神经元形态的正常是脑功能正常的基础,缺血及内毒素均可导致神经元的损伤,引起神经元功能的缺失。突触作为神经元之间相接触部分的特化区,是神经元实现生理功能的关键性部位,对保持脑功能的正常起非常重要的作用。本实验采用光学显微镜、透射电子显微镜对LPS脑损伤大鼠皮层锥体细胞形态及突触超微结构进行观察,并对突触结构参数进行计量统计。探讨安宫牛黄丸改善脑损伤的结构基础,及朱砂、雄黄在其中的作用。4.1对LPS脑损伤大鼠皮层锥体细胞形态的影响LPS可引起明显的组织水肿,大量的神经元胞体缩小,核固缩,部分固缩呈叁角形,多数细胞核仁消失,胞浆红染。全方可使组织水肿减轻,锥体细胞胞体缩小及核固缩减轻,多数细胞核仁清晰,胞浆均质淡染;简方组组织水肿减轻,但仍可见较多的锥体细胞胞体缩小,核仁消失,并有明显的核固缩,胞浆染色深;朱砂+雄黄、雄黄组锥体细胞胞体缩小、核固缩减轻,核仁清晰,胞浆染色浅淡,朱砂组锥体细胞形态也有改善。4.2对LPS脑损伤大鼠皮层突触结构的影响透射电镜的结果显示,LPS可导致皮层突触数量减少,突触前、后膜融合,突触间隙模糊不清,突触后膜PSD明显减少,突触前膜大量囊泡聚集。全方组皮层镜下多见保存完好的突触结构和大的笑型突触,前膜附近无明显的囊泡聚集,突触后膜PSD保持较好;简方组突触结构保存尚好,但突触前膜囊泡大量聚集现象明显,突触后膜PSD有一定改善;朱砂+雄黄组、雄黄组、朱砂组大鼠皮层突触超微结构变化相似:突触结构清晰,突触前膜囊泡聚集较少,甚至少于正常组,突触后膜电子致密体保存较好,在镜下偶见大的突触结构。定量统计结果显示,LPS脑损伤皮层突触数量、PSD的厚度和长度明显减少,突触间隙轻度缩窄。除突触数量外,全方对上述指标均有明显的改善作用;简方可增加皮层突触数量和PSD的厚度,在对突触间隙及PSD厚度的影响上,全方和简方差异显着,P<0.05;朱砂+雄黄可增加突触数量、PSD的厚度,并使突触间隙增加,和全方一致。小结:安宫牛黄丸可显着改善LPS引起的皮层锥体细胞的损伤,改善突触结构的破坏及突触前膜囊泡聚集,对PSD的保护作用明显;简方可以增加突触的数量,对PSD也有一定的保护作用,但对突触间隙改善作用不明显,和全方比差异显着,对突触前膜的囊泡聚集无明显作用;朱砂+雄黄可增加PSD的厚度、改善突触间隙的缩窄,和全方的作用相似,同时改善突触前膜囊泡聚集作用明显。可见,全方在保护皮层神经元形态的正常,改善LPS引起的突触结构的损伤方面优于简方,在改善突触前膜囊泡聚集中朱砂、雄黄显示更明显的作用。5含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对LPS脑损伤大鼠皮层、脑干ATP及SynapsinⅠ的影响递质释放是影响神经递质功能的因素之一,可能成为安宫牛黄丸改善胆碱及单胺类递质功能紊乱,改善脑损伤的重要方面。影响神经递质释放的因素很多,其中SynapsinⅠ调节神经递质释放的动力学过程;Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶则通过维持神经细胞静息膜电位和细胞内钙的低稳态来影响递质释放。本实验主要观察含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对LPS脑损伤ATP酶及SynapsinⅠ的影响,初步探讨安宫牛黄丸对中枢神经递质释放的作用及朱砂、雄黄对其影响。5.1对LPS脑损伤大鼠皮层SynapsinⅠ及其mRNA表达的影响LPS注射后,海马DG区SynapsinⅠ明显较少。全方可使SynapsinⅠ表达明显增加,简方作用不明显,和全方组比较,P<0.05。朱砂+雄黄、朱砂可使SynapsinⅠ增加,其中朱砂作用明显,和模型比较,P<0.05。朱砂可使皮层SynapsinⅠm RNA表达增加,优于其他各给药组。5.2对LPS脑损伤大鼠皮层及脑干ATP酶活性的影响尾静脉注射LPS可使皮层及脑干Na+-K+-ATP酶活性、皮层Ca2+-ATP酶活性轻度降低。全方可使皮层及脑干Na+-K+-ATP酶活性升高,简方仅能升高脑干Na+-K+-ATP酶活性,全方和简方均不影响Ca2+-ATP酶活性。雄黄可使脑干Na+-K+-ATP酶活性升高。小结:全方可提高LPS注射后皮层及脑干Na+-K+-ATP酶活性,增加SynapsinⅠ表达;简方仅提高LPS脑损伤脑干Na+-K+-ATP酶活性,对皮层SynapsinⅠ的改善作用不明显,和全方比较,P<0.05;雄黄可使脑干Na+-K+-ATP酶活性升高,朱砂则可增加DG区SynapsinⅠ的表达。全方和简方、朱砂、雄黄比较,具有明显的优势,对LPS所引起的ATP及SynapsinⅠ改变有更全面的复衡作用,朱砂在全方增加SynapsinⅠ表达中发挥作用。结论:本研究分别以缺血及内毒素性脑损伤大鼠为观察对象,应用电生理学方法、生化法、放射性配体结合法、HPLC-ECD法及分子生物学的方法,观察了含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对脑损伤脑电图、胆碱及单胺类递质系统的功能、皮层锥体细胞的形态及突触超微结构、ATP活性和SynapsinⅠ表达等的影响。结果显示,缺血性及内毒素脑损伤可引起大鼠脑电图β波功率及相对功率明显降低,δ波相对功率明显提高,脑电图慢化。胆碱、单胺递质的紊乱及神经元和突触结构的损伤可能是LPS引起的脑电图慢化、脑功能降低的机制。全方可提高不同脑损伤脑电图β波功率及相对功率,而抑制δ波相对功率,发挥明显的脑电激活作用;提高LPS脑损伤脑干Ach含量、降低皮层及脑干ChAT含量,提高皮层M-R亲和力,增加Gsα含量,上调Gsα/Giα比值,拮抗LPS引起的胆碱系统功能损伤;抑制LPS引起的皮层及脑干NE的增加,改善5-HT的代谢,改善中枢单胺类递质的功能;显着改善LPS所致皮层锥体细胞形态损伤,改善突触结构的破坏,保护突触后膜PSD;提高LPS注射后Na+-K+-ATP酶活性,增加SynapsinⅠ表达。可见,安宫牛黄丸通过改善皮层及脑干乙酰胆碱及单胺类递质的功能,保护损伤造成的皮层神经元形态和突触结构的破坏,从而发挥激活脑电图、改善脑功能、促进清醒作用。简方在对脑损伤脑电图激活、ChAT含量、M-R亲和力、NE含量、DA含量、突触间隙、PSD的厚度、SynapsinⅠ表达等方面的影响上,和全方差异显着。而朱砂、雄黄在上述几个方面和全方表现相似或相同的作用,因此,朱砂、雄黄与安宫牛黄丸改善胆碱及单胺类递质的功能,保护神经元形态及突触超微结构等作用机制密切相关,在安宫牛黄丸改善脑损伤、促清醒中发挥积极作用。本课题的创新点:1论文采用电生理的方法,通过观察含与不含朱砂、雄黄安宫牛黄丸对脑损伤大鼠皮层脑电图的激活作用,明确了安宫牛黄丸改善大鼠实验性脑损伤脑功能、促清醒的作用,首次报道了朱砂、雄黄的存在与否对安宫牛黄丸改善脑功能的影响。2通过对含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸及朱砂、雄黄改善脑损伤作用机制的研究,证明了朱砂、雄黄与安宫牛黄丸改善脑损伤胆碱及单胺类递质的功能密切相关。 燕芳芳[10]2008年在《芪参益气滴丸对心肌梗死二级预防的作用及其机制研究》文中研究说明背景心血管疾病是严重威胁人类生命健康的常见病和多发病,全球每年大约有2000万人死于急性心血管事件,其中,半数以上死于急性心肌梗死(acutemyocardial infarction,AMI)。随着人口老龄化的发展,我国急性心肌梗死的发病率呈明显上升趋势,已接近国际平均水平。近年来,由于监控和治疗水平的提高,心肌梗死的死亡率明显降低,但存活患者再次发生心肌梗死、充血性心力衰竭和猝死等急性心血管事件的危险性仍很高。因此,除在急性期应积极治疗外,还应加强心肌梗死后的二级预防。心肌梗死的二级预防是指心肌梗死发生后,预防再梗死和猝死,大量研究业已证明,抗血小板制剂、β-受体阻滞剂、他汀类调脂药物及血管紧张素转换酶抑制剂等对心肌梗死后的长期二级预防具有积极而肯定的疗效,并且其疗效不受患者其他情况(如年龄、性别等)的影响。自从第一个标志性试验显示他汀类药物能够降低心肌梗死后患者冠心病危险事件的发生率和总病死率以来,该类药物已经成为预防治疗的基础。调脂治疗虽只能使冠状动脉狭窄的病变减轻1%～4%,但可显着降低心肌梗死的再发率和病死率,其原因在于心肌梗死多发生于轻或中度狭窄的冠状动脉,导致心肌坏死的主要原因为粥样斑块的破裂、出血及继发形成的血栓与血管腔闭塞,而非冠状动脉的固定性狭窄。调脂治疗在防止斑块破裂和出血方面的功效,正是其用于心肌梗死二级预防的基础和依据。冠状动脉粥样硬化斑块不稳定或易于破裂者及血栓形成倾向严重者易发生再梗死,因此,心肌梗死后急性心血管事件的发生与否取决于斑块的易损性,与防治血栓相比,稳定易损斑块具有更大的临床价值,是心肌梗死二级预防的最终目标。近年来的研究发现,急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)患者常具有多个易损斑块,因此,全身性的药物治疗成为稳定易损斑块的首选方法。虽然基础研究证明,他汀类药物可以通过改善血脂、抑制斑块炎症及增加纤维帽厚度等作用稳定易损斑块。但Prove-It临床试验的结果显示,服用大剂量阿托伐他汀的治疗组两年后仍有22.4%的患者发生了急性冠状动脉事件,且服药后的肝功能异常使部分患者无法坚持用药。此外,使用单一药物进行二级预防效果很可能不如联合用药,作为心肌梗死二级预防最突出的范例就是2004年由2位英国学者提出的“复合制剂”想法。尽管文章发表后遭到了一定程度的置疑,但这一模式的转变意义重大。炎症反应在不稳定斑块形成及破裂中起着重要的作用,中医药具有多途径、多环节、多靶点的特点,可通过保护血管内皮细胞、调节脂质代谢、抑制炎症反应和抑制胶原纤维降解等多个角度稳定动脉粥样硬化斑块,在稳定易损斑块方面具有潜在的疗效优势,且中药制剂药效缓和,药物之间因配伍而减毒增效,副作用较小,适宜作为二级预防用药长期服用。近年来,中医对心肌梗死的研究很多,进展很快,但有关心肌梗死二级预防与斑块稳定性的相关研究甚少。芪参益气滴丸是天士力集团研制的治疗心血管疾病的现代中药,具有益气活血、通络止痛的功效,在冠心病防治中疗效肯定,但对于不稳定斑块的干预作用如何,尚未见系统研究报道。近年来,血管生物学和分子生物学技术的发展为深入研究中医药稳定动脉粥样斑块的机制提供了新的手段。大量循证医学研究证明,他汀类降脂药物具有一定稳定斑块的作用,可显着降低急性心血管事件的发生率和死亡率,因此,本研究以辛伐他汀作为阳性对照药物,应用本实验室已成功构建的易损斑块动物模型,运用分子生物学及影像学等技术,观察芪参益气滴丸消退和稳定动脉粥样硬化斑块的疗效,并阐明其分子生物学机制。目的(1)建立与人类动脉粥样硬化病变特征相似,易于观察药物疗效的易损斑块动物模型;(2)应用血管内超声显像技术观察易损斑块影像学特征,评价其动态观察动脉粥样硬化斑块变化的价值;(3)对比芪参益气滴丸和辛伐他汀稳定易损斑块的疗效及其分子生物学机制。方法1.动物模型的建立健康雄性新西兰大白兔70只,随机分为正常对照组和实验组。正常对照组10只,给予普通颗粒饲料;实验组60只,在适应性饲养1周后,球囊损伤腹主动脉+高胆固醇饲料喂养,造模期为12周。2.实验分组及药物干预球囊损伤手术中2只实验兔麻醉意外死亡,造模过程中1只实验兔死于腹泻,8只作为AS验证组,49只动脉粥样硬化模型兔停止高胆固醇饲料饲养,随机分为3组。对照组15只,喂以普通饲料;中药组(芪参益气滴丸组)17只,喂以普通饲料加芪参益气滴丸1.5g/kg/d;西药组(辛伐他汀组)17只,喂以普通饲料加辛伐他汀5mg/kg/d,持续12周。3.斑块局部的p53基因转染24周末对3组实验兔进行斑块局部的基因转染,向转染部位的管腔中注入10μl携带人野生型p53基因的复制缺陷型重组腺病毒载体(Ad5-p53,滴度为1.5×10~(10)pfu/ml)。所有实验兔继续普通颗粒饲料喂养2周。4.药物触发26周末,对实验兔进行药物触发:中国斑点蝰蛇毒0.15mg/kg腹膜下注射,30min后耳缘静脉注射组胺0.02mg/kg,于处死动物前24h、48h给予两次药物触发。5.称量体重实验前、12周造模后及26周末药物干预后分别对所有实验兔称量体重。6.血脂检测分别于实验开始、12周末及24周末采血作血液生化检查。采用酶法测定血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油叁酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇(highdensitylipoprotein cholesterol,HDL-C)水平。7.血清炎性因子的检测分别于实验开始、12周末及26周末采血,采用速率散射光比浊法测定血浆纤维蛋白原(fibrinogen,Fib)水平;应用酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)检测触发前后血清高敏C反应蛋白(highsensitivity C-reactive protein,hs-CRP)、可溶性血管间细胞黏附分子-1(solublevascular cell adhesion molecule-1,sVCAM-1)和氧化低密度脂蛋白(oxidizedlow-density lipoprotein,ox-LDL)的水平。8.高频体表超声检查分别于实验开始、12周末、24周末行腹主动脉高频体表超声检查。测量腹主动脉舒张末期内径(end-diastolic luminal diameter,Dd)、收缩末期内径(endsystolicluminal diameter,Ds)、腹主动脉后壁内膜-中层厚度(intima-mediathickness,IMT)、腹主动脉收缩期血流峰值速度(peak velocity,Vp)、收缩期平均速度(mean velocity,Vm)和收缩期流速积分(velocity integral,VTI)。将内-中膜平均回声强度AⅡ-Ⅰ与外膜平均回声强度AⅡ-A的比值作为内-中膜校正的AD值(AⅡc%),AⅡc%=AⅡ-Ⅰ/(AⅡ-A)×100%。9.高频血管内超声显像检查分别于实验开始、12周末及26周末处死动物前行腹主动脉血管内超声(IVUS)检查。测量血管外弹力膜面积(external elastic membrane area,EEMA)、管腔面积(lumen area,LA)、斑块面积(plaque area,PA)、血管内径(vesseldiameter,VD)、管腔内径(lumen diameter,LD),并计算偏心指数(eccentricityindex,EI)和血管重构指数(remodeling index,RI)。10.病理染色留取腹主动脉标本,苏木素—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、Masson叁色染色、油红O染色和Movat五色套染法染色。11.免疫组织化学染色行p53、RAM11、a-actin、VCAM-1、MCP-1、MMP-9及TIMP-1免疫组织化学染色。12.电镜检查留取标本进行扫描电子显微镜和透射电子显微镜检查,观察血管超微结构的变化。13.Real-time PCR检测血管组织中p53、VCAM-1、MCP-1、MMP-9及TIMP-1的mRNA表达水平,并以管家基因GAPDH作为参照。14.Western blot检测血管组织中p53、VCAM-1、MCP-1、MMP-9及TIMP-1的蛋白表达水平。15.统计学分析连续性数据用(?)±SD表示,离散数据用例数和百分数表示。叁组间斑块破裂率的比较应用Pearson Chi-Square检验,其他指标应用单因素方差分析。应用SPSS统计软件进行统计学处理(version 13.0;SPSS Inc),P＜0.05有统计学差异。结果1.实验动物基本情况进入药物干预阶段的49只实验兔中,中药组和西药组各有1只实验兔死亡,分别死于腹泻和呼吸道感染。最终完成药物干预的实验兔共47只,其中,对照组15只,中药组和西药组各16只。本文对完成药物干预的47只实验兔的资料进行分析。2.实验动物体重的变化基础状态和12周末各组实验兔体重的比较均无显着性差异(P均＞0.05),26周末中药组实验兔体重较对照组显着降低(P＜0.05),而西药组和对照组之间无显着差异。3.斑块破裂率的比较大体病理形态学特征结合病理学及血管内超声显像证实对照组、中药组和西药组分别有12只,6只和7只实验兔出现斑块破裂、血栓形成。破裂率分别为80.00%,37.50%和43.75%。与对照组比较,中药组和西药组斑块破裂率均显着降低(P均＜0.05),而两药物组间斑块破裂率无显着差异。4.血脂检测与对照组相比,中药组和西药组LDL-C水平均显着降低(P均＜0.01),且西药组水平显着低于中药组(P＜0.01);与对照组相比,中药组的TG水平显着降低(P＜0.01),西药组虽有所降低,但未达统计学意义;与对照组相比,西药组的TC水平显着降低(P＜0.01),中药组虽有所降低,但未达统计学意义,且西药组水平显着低于中药组(P＜0.01);叁组间HDL-C水平无显着差异。5.血清炎性因子的检测与对照组相比,中药组和西药组hs-CRP水平均显着降低(P均＜0.01),且西药组显着低于中药组(P＜0.05);与对照组相比,中药组和西药组纤维蛋白原水平均显着降低(P＜0.05和P＜0.01),且西药组显着低于中药组(P＜0.01);与对照组相比,中药组和西药组ox-LDL水平均显着降低(P＜0.01和P＜0.05),且中药组显着低于西药组(P＜0.01);与对照组相比,中药组sVCAM-1显着降低(P＜0.05),西药组虽有所降低,但未达统计学意义。6.高频体表超声与对照组相比,中药组和西药组IMT均显着降低(P均＜0.01),且西药组显着低于中药组(P＜0.05);与对照组相比,中药组和西药组AⅡc%均显着升高(P均＜0.01),而两药物组之间无显着差异;各组间血流速度测值无显着差异(P均＞0.05)。7.血管内超声显像检查与对照组相比,中药组和西药组PA均显着减小(P均＜0.01),且西药组显着低于中药组(P＜0.05);与对照组相比,西药组LAS%和EEMA均显着降低(P＜0.05和P＜0.01),中药组虽有所降低,但未达统计学意义;叁组间其他测值无显着性差异(P均＞0.05)。8.病理染色病理染色显示,对照组斑块内脂质含量较高,多数斑块破裂,且有血栓形成,斑块破裂处及血栓内可见大量炎性细胞浸润,血栓与血管壁附着紧密,中膜明显萎缩。中药组和西药组泡沫细胞减少,纤维组织增生明显。9.免疫组织化学染色免疫组化染色显示转染Ad5-p53兔腹主动脉p53表达明显较之未转染兔明显增强。叁组斑块内均有a-actin(平滑肌细胞)、RAM11(巨噬细胞)、VCAM-1、MCP-1、MMP-9及TIMP-1的局部表达,且与对照组相比,两药物组a-actin的表达明显增强,其余炎症因子的表达明显减弱。10.电镜检查对照组大部分实验兔发生斑块破裂、血栓形成,内皮细胞不完整,平滑肌细胞核固缩,胞质浓染,胶原纤维排列紊乱,线粒体空泡状变性。中药组和西药组泡沫细胞减少,平滑肌形态基本正常,细胞间连接较紧密,胶原纤维排列稍紊乱,异染色质轻微边聚。11.Real-time PCR与对照组比,中药组和西药组腹主动脉VCAM-1、MCP-1、MMP-9及TIMP-1mRNA水平均显着降低(P＜0.01或P＜0.05),其中,中药组VCAM-1 mRNA表达水平显着低于西药组(P＜0.01),而西药组MMP-9 mRNA表达显着低于中药组(P＜0.05),两药物组间其余炎症因子mRNA表达水平无显着差异;叁组间p53 mRNA表达水平无显着差异。12.Western blot与对照组比,中药组和西药组腹主动脉MCP-1、MMP-9和TIMP-1蛋白表达均显着降低(P均＜0.01),而两药物组间无显着差异;与对照组比,中药组和西药组腹主动脉VCAM-1蛋白表达水平均显着降低(P均＜0.01),且中药组水平显着低于西药组(P＜0.01);叁组间p53蛋白表达水平无显着差异。结论(1)应用内皮损伤、高脂饲养、斑块局部转染p53基因和药物触发的方法可建立与人类动脉粥样硬化病变特征相似、造模时间短及适于观察药物疗效的易损斑块的动物模型;(2)血管内超声成像技术是识别易损斑块的可靠影像学技术,可用于动态观察AS斑块变化及判断药物疗效;(3)芪参益气滴丸和辛伐他汀均能通过降低血脂和血清炎症因子水平、抗脂质过氧化、减少斑块局部的脂质含量及抑制斑块局部炎性反应等作用稳定易损斑块,辛伐他汀的降血脂及抗炎效果明显优于芪参益气滴丸,而芪参益气滴丸的抗脂质过氧化作用强于辛伐他汀,两药合用可能在心肌梗死二级预防方面起到更好的疗效。背景内皮功能障碍与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)等心血管疾病有密切关系,血管内皮细胞损伤被认为是AS发展的一个早期关键性环节,持续、轻度的内皮细胞损伤可使内皮细胞的调节功能出现异常,且急性冠脉综合征(acutecoronary syndrome,ACS)患者体内亦有不同程度的血管内皮细胞功能紊乱和损伤。一氧化氮(Nitric oxide,NO)是影响内皮细胞功能的一种重要生物活性物质,由L-精氨酸在一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)作用下氧化生成,具有维持血管的舒张状态、抑制血小板和单核巨噬细胞的粘附和聚集、抑制血管平滑肌细胞分裂增殖等作用。NO的减少可增加血管紧张度、使血管易于发生炎性改变、促使斑块不稳定及诱发血栓形成。由于内皮细胞直接和血液接触,因此,很易受到血液中有害物质如细菌内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、炎症介质和自由基等的刺激而受损。其中,LPS由于其广泛的生物学作用,越来越引起人们的关注。大量研究表明,内毒素参与AS的形成过程,特别是AS血管炎症的初始过程。内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的表达或活性改变均可直接影响内皮NO生成,从而影响内皮细胞功能,eNOS磷酸化/去磷酸化对于机体的eNOS活化具有重要作用。在eNOS众多的磷酸化位点中,丝氨酸-1177(Ser1177)和苏氨酸-495(Thr495)是2个最重要的磷酸化位点,前者磷酸化可以增强其活性,而后者磷酸化可以抑制其活性。在生理状态下,内皮释放的NO可减少血小板聚集、抑制单核细胞黏附和平滑肌细胞增殖;假如内皮功能障碍,NO合成和释放减少,未受伤但功能失调的内皮细胞通过在其表面表达的黏附分子与各种类型的白细胞结合,激活炎症细胞进入动脉壁,释放水解酶、细胞因子、化学因子和生长因子等,引起斑块的生长,启动AS的发生。因此,eNOS功能障碍在AS发生和发展中发挥着重要作用。改善内皮细胞功能、加强对内皮功能障碍的预防性治疗是冠心病治疗领域的一个新的发展趋势。冠心病发病与NO的生物利用度降低有关,因此,增强eNOS活性和表达可能会对心血管系统有保护作用。芪参益气滴丸经前期体内实验已证实具有调节血脂及抗炎作用,方中主要代表药物黄芪的现代药理研究表明,该药物对血管内皮细胞具有保护作用,可能与其防止细胞凋亡、改变血管通透性、抗氧化、调节血管舒缩等作用有关。黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)是黄芪的主要有效成分之一,具有保护血管内皮细胞的功能,但这种作用与上调eNOS的表达与活性是否有关还不甚清楚。以往研究多采用静脉内皮细胞或牛动脉内皮细胞进行培养,且研究多关注LPS对iNOS的影响,为更好地模拟人动脉内皮细胞的功能,本实验采用原代人主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells,HAECs),以LPS作为形成内皮细胞损伤的诱导因子,观察不同浓度及不同时间点LPS对于体外培养人主动脉内皮细胞eNOS及Phospho-eNOS蛋白表达的影响,并观察黄芪多糖对LPS诱导的内皮细胞损伤的防治疗效。目的(1)建立人主动脉内皮细胞损伤的模型;(2)观察不同浓度黄芪多糖对脂多糖所致的内皮细胞损伤的保护作用及其机制。方法为建立内皮细胞损伤模型,确定LPS最终刺激浓度及刺激时间,本实验通过体外培养人主动脉内皮细胞,观察不同浓度和不同时间LPS刺激后,人主动脉内皮细胞eNOS及Phospho-eNOS表达变化,选定LPS的最佳刺激条件。不同浓度的黄芪多糖(0.025mg/ml、0.25mg/ml、2.5mg/ml)预孵育12h后再加LPS,倒置显微镜下观察细胞形态的变化,并且用RT-PCR方法检测各组eNOS的mRNA表达水平,western blot方法测定各组eNOS及Phospho-eNOS的蛋白表达水平。结果倒置显微镜下观察,正常血管内皮细胞生长状态良好,贴壁较牢,呈梭形或圆形,形态饱满,呈铺路石状生长,细胞间连接紧密,分裂相多,未见悬浮细胞。LPS损伤组可见不同程度及范围的细胞收缩、变圆、胞间隙变宽、细胞脱壁悬浮;黄芪多糖2.5mg/ml治疗组细胞形态与正常组差别不明显。根据不同浓度及不同时间LPS刺激后人主动脉内皮细胞eNOS及Phospho-eNOS变化情况及本实验的研究目的,我们选定100ng/ml的LPS培养液培养细胞24h为最佳刺激条件。100ng/ml LPS培养细胞24h,eNOS的mRNA及蛋白表达水平均显着下降,Phospho-eNOS(Ser1177)蛋白表达水平显着下降,而Phospho-eNOS(Thr495)蛋白表达水平显着上升。0.25mg/ml和2.5mg/ml黄芪多糖可以显着缓解LPS对eNOS mRNA表达、eNOS和Phospho-eNOS(Ser1177)蛋白表达的抑制作用,但对于Phospho-eNOS(Thr495)蛋白表达无明显影响。结论(1)100ng/ml LPS培养人主动脉内皮细胞24h不仅可以降低eNOS表达水平,还可以通过降低Phospho-eNOS(Ser1177)表达水平及升高Phospho-eNOS(Thr495)表达水平,使eNOS活性降低,为适合本实验的最佳刺激条件;(2)0.25mg/ml和2.5mg/ml黄芪多糖可以通过上调eNOS表达水平及Phospho-eNOS(Ser1177)蛋白表达水平,从而改善内皮细胞功能;(3)黄芪多糖对Phospho-eNOS(Thr495)蛋白表达无明显影响。 [1]. LPS引起的心血管功能障碍及相关机制研究[D]. 屠洁. 浙江大学. 2004 [2]. 慢性迷走神经刺激减轻去势大鼠血管内皮损伤和炎症反应的作用及机制研究[D]. 李平. 中山大学. 2016 [3]. 血浆内毒素在牙周炎患者罹患冠心病中的作用及机制研究[D]. 郭世杰. 天津医科大学. 2013 [4]. 1、牛磺酸及血管紧张素转化酶抑制剂对大鼠急性肺损伤的保护作用研究 2、ALI/ARDS影响因素分析[D]. 马晓薇. 重庆医科大学. 2013 [5]. 白藜芦醇对小鼠败血症心脏损害保护作用的机制研究[D]. 白涛. 吉林大学. 2017 [6]. 人参二醇组皂苷对LPS导致的小鼠心肌损伤的保护作用[D]. 杨方园. 吉林大学. 2017 [7]. 母体孕期炎症免疫刺激导致子代大鼠心肌血管重构及其机制初步研究[D]. 魏艳玲. 第叁军医大学. 2010 [8]. LTB4/BLT1及其介导的关键信号通路在脓毒症心脏功能障碍中的作用机制研究[D]. 孙萌. 山西医科大学. 2017 [9]. 朱砂雄黄在安宫牛黄丸抗大鼠脑损伤中的作用及机制研究[D]. 朱坤杰. 北京中医药大学. 2007 [10]. 芪参益气滴丸对心肌梗死二级预防的作用及其机制研究[D]. 燕芳芳. 山东大学. 2008参考文献：