内质网应激抑制猪细小病毒复制的分子机制及其非结构蛋白1核转运机制的研究

论文摘要

内质网（Endoplasmic reticulum,ER）应激和未折叠蛋白反应（Unfolded protein response,UPR）与许多哺乳动物疾病,尤其是病毒性疾病有关。猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）是一个小的、无囊膜单股负链DNA病毒,是引起猪繁殖障碍的主要病原之一。尽管有研究表明PPV感染激活内质网应激,但是内质网应激是如何调控病毒复制的具体分子机制仍不清楚。我们的研究发现,PPV感染猪肾（PK-15）和猪睾丸（PT）细胞均可以激活内质网应激,且PPV感染激活内质网应激是通过蛋白激酶R样内质网应激酶（PERK）途径介导的,而不是肌醇依赖酶1（IRE1）和转录激活因子6（ATF6）途径。当用特异性内质网应激诱导剂毒胡萝卜素和衣霉素处理感染PPV的细胞后,我们发现内质网应激诱导剂抑制了病毒的吸附和释放,说明内质网应激的激活负调控PPV的复制。利用RNA干扰（siRNA）敲低细胞内PERK、真核起始因子2α（eIF2α）和转录激活因子4（ATF4）的表达,发现显著增强了 PPV复制。此外,我们还观察到内质网应激抑制PPV感染与细胞凋亡有关。利用特异性细胞凋亡激动剂（Nutlin-3）加速细胞凋亡显著抑制了 PPV复制。促凋亡因子c/ebp同源蛋白（CHOP）的过表达显著降低PPV感染,而利用shRNA敲低CHOP表达又明显促进PPV感染,说明加速内质网应激介导的凋亡抑制PPV的复制。总之,这些结果表明PPV感染通过PERK信号通路激活内质网应激,然后内质网应激通过促进细胞凋亡抑制PPV的复制。非结构蛋白1（NS1）是PPV主要的非结构蛋白,在PPV复制过程中起着重要作用。本研究中,我们首次验证了 NS1在细胞核和细胞质之间的动态穿梭,尽管其亚细胞定位主要出现在细胞核中。NS1在283-291和602-608氨基酸处有两个核输出信号（nuclear export signal,NES）,分别命名为NES1和NES2。NES1和NES2是功能性和可转移的NES,其核输出活性被leptomycin B阻断,说明NS1是通过CRM1途径出核的。此外,截短和缺失突变分析表明NS1在256-274氨基酸处含有一个双分型的核定位信号（nuclear localization signal,NLS）。免疫共沉淀试验表明NS1与核输入受体蛋白α5和α7有相互作用。核质穿梭蛋白的特性是既具有NES又具有NLS,因此我们通过NS1动力学及异核体试验进一步证实了 NS1是一个核质穿梭蛋白。

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摘要

Abstract

第一章综述

1.1 猪细小病毒简介

1.1.1 PPV病毒结构与基因组成

1.1.2 PPV的主要蛋白及其功能

1.2 内质网应激概述

1.2.1 未折叠蛋白反应的途径

1.2.2 内质网应激在病毒感染中的作用

1.2.3 内质网应激反应和细胞凋亡

1.2.4 内质网应激调控猪细小病毒复制分子机制的研究进展

1.3 蛋白质的核质转运

1.3.1 蛋白质的入核转运机制

1.3.2 蛋白质的出核转运机制

1.3.3 细小病毒非结构蛋白NS1的核转运机制研究进展

1.4 研究目的及意义

第二章实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 细胞与毒株

2.1.2 菌种及质粒

2.1.3 主要试剂、药品、工具酶和抗体

2.1.4 主要实验仪器及设备

2.2 实验方法

2.2.1 PPV的增殖

2.2.2 PPV病毒滴度的测定

2.2.3 病毒DNA的提取

2.2.4 细胞总RNA的提取

2.2.5 PCR产物的纯化

2.2.6 真核表达质粒的构建

2.2.7 连接产物的转化

2.2.8 小量质粒的提取

2.2.9 siRNA的合成

2.2.10 细胞转染

2.2.11 RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测

2.2.12 Western blot检测目的蛋白

2.2.13 间接免疫荧光实验

2.2.14 免疫共沉定

2.2.15 异核体试验

2.2.16 统计学方法

第三章内质网应激抑制PPV复制的分子机制研究

3.1 PPV感染诱导内质网应激

3.2 PPV感染通过PERK通路激活内质网应激

3.3 内质网应激抑制PPV感染

3.4 抑制PERK的表达有助于PPV复制

3.5 抑制eIF2α的表达有助于PPV复制

3.6 抑制ATF4的表达有助于PPV复制

3.7 促凋亡基因CHOP对PPV复制的影响

3.8 加速内质网应激介导的细胞凋亡抑制PPV复制

3.9 讨论

3.10 结论

第四章非结构蛋白NS1核转运机制的研究

4.1 NS1的亚细胞定位

4.2 NS1亚细胞定位信号的预测及鉴定

4.3 NS1含有两个功能性的NES基序,且其核输出依赖于CRM1信号通路

4.4 NS1功能性NLS的鉴定

4.5 NS1与入核转运受体α5和α7相互作用

4.6 NS1是一个核质穿梭蛋白

4.7 讨论

4.8 结论

参考文献

致谢

作者简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 曹丽艳

导师: 冯力

关键词: 猪细小病毒,非结构蛋白,内质网应激,核输出信号,核定位信号,分子机制

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

分类号: S852.651

DOI: 10.27630/d.cnki.gznky.2019.000012

总页数: 92

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内质网应激抑制猪细小病毒复制的分子机制及其非结构蛋白1核转运机制的研究

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