户义[1]2003年在《抗融合标签单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究》文中研究说明融合蛋白(fusion protein)是将两个或两个以上的基因通过一定方式连接在一起共同表达出的重组蛋白。标签融合蛋白(tag fusion protein)是融合蛋白的一种，它是由目的蛋白(target protein)和融合标签(fusion tag)共同构成的蛋白嵌合体。常见的融合标签包括：多聚组氨酸(poly-His)、FLAG多肽、葡萄球菌蛋白A(SPA)、免疫球蛋白的Fc段以及谷胱甘肽转移酶(GST)等。融合标签的使用不仅方便了目的蛋白的表达和纯化，同时为目的蛋白结构和功能的研究提供了便利手段。随着人类基因组计划(Human Genome Project，HGP)的完成，后基因组学(post-genomics)和蛋白质组学(proteomics)已经成为生命科学发展的重点，这一时期，科学家面临的最大挑战是在整体水平上系统地、综合地研究蛋白质的结构、功能以及蛋白质与蛋白质、核酸等生物大分子之间的相互作用。蛋白质的表达和纯化是蛋白质研究的关键环节。与标签蛋白融合表达提供了一个高通量(high-through)表达和筛选功能蛋白的平台，因而为学者广泛重视，已成为一条联系基因组和蛋白质组的重要纽带。另外，融合蛋白在蛋白复合物的分离、药物筛选以及临床治疗等领域也发挥着重要作用。 单克隆抗体技术是1975年由Khler和Milstein共同创立的用于生产针对单一表位抗体的免疫学技术。由于单克隆抗体具有纯度高、特异性强、效价高、少或无交叉反应等优点，被广泛应用于生命科学的各个领域。在蛋白质组学的研究中，针对融合标签的单克隆抗体不但可以作为亲和层析介质对融合蛋白进行分离和纯化，还可以方便地研究目的蛋白质的分布和功能，是后基因学研究的重要工具。一 本实验中，我们制备了7株稳定分泌抗Ig融合蛋白FC段单克隆抗体的杂交瘤细胞株FMUI7CI～7，其中FMUFCZ、F刚FC4、FMUFCS和F删FC6为 IgGI（K）；FMUFCI、F删FC3及 FMwC7为 IgGZb（K）。7株 InAb所未腹水效价为在 0．5～IXIO－’，酶标 a效价为在 10叫～10刁。竞争 ELISA u生物传感器分析表明，获得的7株单克隆抗体识别7个不同的表位，其中FMUFCS、FMUFC6和FMUFC3的表位比较接近，FMUF。2和FMU’FC4的表位相差最远。在表位分析的基础上，我们利用FMUFC4作为包被抗体，H肚F 作为酶标记抗体，构建了用于检测Ig融合蛋白的双单抗夹心ELISA系统，并通过选择包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度对其进行了优化。敏感性与特异性试验表明该系统的检测水平达到Zv叭且与其它物种的IgG没有交叉反应。利用该系统对COS河细胞表达的LAIRl工g融合蛋白和抗Notch配体Deftal的嵌合抗体进行了测定，均获得浓度依赖的A值曲线。这表明，该夹心ELISA系统能够用于细胞培养上清中的Ig融合蛋白和嵌合抗体水平的检测。有趣的是尽管 F则FC3、FMUFCS和 F刚FC6的表位非常接近，但在免疫印迹只有FMUFC6可同时用于Ig融合蛋白和hlgG的免疫印迹检测，提示在蛋白质变性过程中，随着蛋白质空间结构的破坏，许多抗体识别的表位会消失或减弱，进一步说明抗原抗体之间的特异性反应有赖于抗原和抗体分子在空间结构上的识别，而不仅仅取决于氨基酸在蛋白质中的线性排列。利用 FMUFCS InAb制备的亲和层析柱，对转染后COS河细胞培养上清的LAIR1 融合蛋白进行纯化，纯化产物经SDS．PAGE后显示层析所得蛋白质的分子量与理论值相符，纯度大于 80％。这说明免疫亲和层析能够有效的纯化培养基中的Ig融合蛋白，为Ig融合蛋 白纯化提供了新的有效途径。 另外，我们对我室制备的5株抗GST、5株抗m 和 1株抗FLAG单克 隆抗体进行了比较系统的鉴定，并对其中部分单克隆抗体进行了初步应用 研究。结果表明除抗FLAG单克隆抗体的腹水效价较低，不能用于相应融合蛋白的免疫印迹外，其他 10株单克隆抗体的腹水效价均在 10’～10’之间， 并且全部可以用于相应融合蛋白的免疫印迹检测。比较发现，抗His标签的 单克隆抗体制备的亲和层析柱对m 融合蛋白的纯化效果优于以 N iu十TA 为基质的金属亲和层析。 FasL是重要的凋亡诱导配体（poptosis inducing ligand，AIL），在免疫 防御和免疫自稳中发挥着重要作用。FasL抗原以及抗 FasL ti体在基础和临 床研究中有巨大的应用价值。我们采用基因工程技术，构建并表达了人FasL 胞膜外区与GST的融合蛋白并利用抗GST和抗hFasL的单克隆抗体对其进 行了鉴定，为FasL抗原和抗体的制备提供了有利条件。
李忠信[2]2010年在《FLAG标签单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究》文中研究表明随着基因组学和蛋白质组学的发展,融合蛋白的纯化已成为蛋白质组学的重要任务,后期蛋白纯化已占总成本的70%以上,因此建立快速、高效、方便、低廉的纯化方法已成为其发展的瓶颈问题。本研究通过应用淋巴细胞杂交瘤技术,获得具有效价高、特异性强、反应性好、亲和力高等特点的抗FLAG单抗,在含FLAG的融合蛋白的亲和层析纯化中取得良好效果,建立可用于FLAG融合蛋白纯化和检测的方法,这将为后基因组时代大量涌现的新分子的结构和功能研究提供重要的工具,有很高的实用价值。同时,本研究方法可作为一种技术平台,为其他多种带标签蛋白单克隆抗体的制备提供技术支持。探讨不同方法、多种载体制备FLAG完全抗原进而制备抗FLAG标签单克隆抗体的效果,以及抗FLAG标签单抗在融合蛋白纯化中的作用。利用牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)和匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体蛋白,通过碳化二亚胺法合成FLAG-BSA、FLAG-OVA和FLAG-KLH叁种完全抗原,采用SDS-PAGE初步判断偶联效果,并将叁种抗原作为免疫原通过腹腔、脾内和皮下免疫BALB/c小鼠,取尾血后利用间接ELISA方法检测血清效价,以此最终确定偶联效果,选最优者利用杂交瘤技术制备抗FLAG标签单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水,并对其纯化、分析和鉴定。用Western-blot方法检测mAb对融合蛋白的反应性,并制备交联抗FLAGmAb的亲和层析柱,用以纯化带FLAG标签的融合蛋白,经SDS -PAGE后薄层扫描分析纯化后蛋白纯度。经间接ELISA检测小鼠尾血效价,FLAG-KLH偶联效果最好,小鼠免疫效价在104以上,共制备1株抗FLAG标签单克隆抗体杂交瘤细胞株,命名为5F-2,此单抗鉴定结果为:抗体属于IgG,其亚类为IgG1,体外多次传代培养后分泌抗体稳定。5F2单抗的腹水效价达到106。间接ELISA法证实此单抗与其他抗原无交叉反应,特异性高。制备出酶标抗体,活性达到104。融合蛋白经亲和层析纯化后的纯度85%以上,且可用于融合蛋白的Western-blot检测,建立了可用于带FLAG标签融合蛋白的纯化方法和检测方法。成功进行了FLAG完全抗原的偶联,同时制备出抗FLAG标签的单克隆抗体,为带FLAG标签的融合蛋白纯化提供重要工具。
王晓艳[3]2007年在《鸡贫血病毒结构蛋白抗原表位研究及感染性克隆构建》文中指出为了研究鸡贫血病毒(Chicken anemia virus，CAV)VPI蛋白的抗原表位，本研究根据生物软件Lasergene对VP1蛋白抗原性的分析结果，将VP1蛋白进行了分段表达，选取缺失VP1 N端68个氨基酸的融合表达产物VP1-A进行纯化，免疫BALB/c鼠，制备了6株抗VP1蛋白的单克隆抗体(MAb)。以这些MAbs对分段表达的VP1蛋白进行Western blot分析，在VP1蛋白上初步鉴定出3个抗原位点，分别位于VP1的219-274氨基酸(aa)残基、324-369aa和275-302aa残基内。为了更详细而全面地了解VP1蛋白的抗原结构，构建了vp1基因特异性噬菌体展示肽库，利用多克隆抗体对肽库进行3轮淘选，得到9个阳性噬菌体。序列分析表明，有5个克隆展示有相同的序列“T~(309)YMSFATLTALGAQWSFPPGQRSVSRRSFNHHKARG~(344)”，有4个克隆展示有相同的序列“M~(196)FGGWHLFRHIETRFQLLA~(214)”。利用制备的6株MAbs与这些阳性噬菌体进行Western blot分析，结果表明2F3等4株MAbs与噬菌体P12反应。为了对这4株MAbs及MAb 4D5对应的表位精确定位，人工合成一系列成对的寡核苷酸，退火后插入pET32a载体中进行融合表达。利用MAbs对融合蛋白进行Western blot反应性扫描，鉴定出2F3等4株MAbs对应的表位位于D~(245)HQNRWRKG~(253)。利用同样的方法鉴定出MAb 4D5对应的表位位于W~(353)HTLVPLGTE~(362)。根据生物软件Lasergene对VP2蛋白的分析发现该蛋白具有良好的抗原性，为了对其进行表位作图(epitope mapping)，首先在E．coli中克隆、表达了VP2蛋白全长，纯化后免疫BALB/c鼠，制备了7株抗VP2蛋白的单克隆抗体。人工合成一套彼此重迭6个氨基酸长度为16个氨基酸并覆盖VP2全长的短肽，融合表达后与MAbs进行Western blot和ELISA反应性扫描，鉴定出3个抗原表位，分别为G~(21)QPGPSGAAQGQVISN~(36)，L~(111)EDRSTQASLEEAILR~(126)和E~(121)EAILRPLRVQGKRAK~(136)，而G~(16)AAQ~(20)，Q~(117)ASL~(120)和P~(127)LRV~(130)分别为各表位的的主要功能区。用这3个纯化后的融合短肽免疫BALB/c鼠，结果表明这些融合蛋白均能诱导小鼠产生VP2蛋白的特异性抗体。为了研究vp3基因对病毒复制及致病力的影响，构建了CAV的感染性克隆及vp3完全缺失(pBluem2CAVVP3~-)和NLS2缺失(pBluem2CAVNLS2~-)的两个突变体。首先构建了含有CAV双拷贝基因组顺向串联的重组子，转染MDCC-MSB1细胞，获得了能够自我复制的CAV，体内试验显示该质粒注入鸡体内，可以引起与CAV感染相似的病理变化。又对vp3基因及vp3基因C端的核定位信号(Nuclear location signal NLS)进行缺失，分别构建了带有缺失的突变体pBluem2CAVVP3~-和pBluem2CAVNLS2~-，转染MDCC-MSB1细胞，初步证实vp3基因缺失后在体内体外均检测不到病毒复制，但vp3 C端NLS2缺失后在体外可以检测到病毒复制，而体内试验结果显示NLS2缺失的突变体可以引起鸡胸腺小体数目增多等变化。CAV感染性克隆的构建为获得纯化的病毒及研制新型疫苗奠定了基础，两个vp3基因突变体的构建为研究vp3基因功能及获得毒力减弱的病毒奠定了基础。
孙莹[4]2011年在《TET癌基因家族成员2（TET2）N末端的表达及其多克隆和单克隆抗体的制备》文中认为2009年3月,骨髓增生性肿瘤(myeloproliferative neoplasms, MPNs)患者体内TET2(Ten-Eleven Translocation 2)突变的发现,使得对包括MPNs在内的髓系恶性肿瘤的研究再次成为血液疾病研究领域的热点。TET2作为一种抑癌基因,其缺失或者突变会引起骨髓细胞的恶性增生。目前,对TET2的研究还都局限在基因水平上,至于TET2如何发挥抑癌功能,我们尚不知晓。由于TET2与多种恶性肿瘤相关且其突变具有多样性,因此,制备TET2蛋白的抗体对于研究TET2蛋白的功能以及在突变水平检测TET2突变具有重要的意义。经用软件对TET2蛋白N端优势抗原表位分析,本研究设计一对引物克隆TET2 N末端抗原性较好的抗原编码基因,命名为TET2N,并克隆到载体pBluescript II KS(pKS)质粒中,经酶切及测序鉴定正确后分别构建pGEX-TET2N和pMAL-TET2N表达质粒,然后转化到E. coli Rosetta DE3 pLysS中高效表达,并通过亲和层析等技术,提取纯化了两种TET2融合蛋白—GST-TET2N和MBP-TET2N,分子量分别约为46kDa和63kDa。其中,GST-TET2N作为抗原免疫动物,制备Anti-TET2N多抗及单抗;融合蛋白MBP-TET2N则用于多抗纯化和单抗杂交瘤细胞筛选。多克隆抗体的制备:以GST-TET2N作为抗原对新西兰白兔进行免疫,获得了Anti-TET2N的多克隆抗体,其灵敏度高达10-1ng,并利用正、负亲和层析的方法对抗体进行了纯化(融合蛋白MBP-TET2N用于正选择亲和层析以筛选抗体),纯化后的抗体可以有效识别HepG2细胞中所含有的TET2蛋白,制备Anti-TET2N的多克隆抗体的目的是为了进一步验证Anti-TET2N单克隆抗体的鉴定结果,以便多方面更好的分析抗体检测结果。单克隆抗体的制备:以GST-TET2N为抗原对BALB/c小鼠进行免疫,用另一种融合蛋白MBP-TET2N进行抗体筛选,获得了Anti-TET2N的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies,MAb),其效价达到8:10~4,获得的抗体可以识别HepG2细胞中的TET2蛋白。该MAb的成功制备将为进一步建立利用MAb在蛋白水平上检测TET2突变的诊断方法及分析TET2蛋白的生理生化功能等方面的研究奠定基础。
侯强[5]2006年在《猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的表达及其单克隆抗体的制备》文中指出猪瘟病毒(classical swine fever virus;CSFV)E2囊膜糖蛋白是猪瘟病毒的主要结构蛋白之一,是猪瘟病毒中和抗体的主要靶标,是抗猪瘟病毒感染的主要保护性抗原;因此,猪瘟病毒E2蛋白是开发猪瘟新型疫苗、诊断试剂及研究猪瘟病毒致病机理的重要蛋白分子。 利用TRIzol试剂提取猪瘟病毒兔化弱毒疫苗(C株)的基因组RNA,经反转录获取其cDNA,再以cDNA为模板,扩增编码E2蛋白主要抗原区的DNA片段(378bp),再将扩增产物正确插入到原核表达载体pPROEX-HTb中,得到重组质粒pPROEX-tE2,然后以其转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,高效表达出了带有组氨酸标签的截短的重组蛋白(tE2),占细菌总蛋白的35%。经Western blotting分析和间接ELISA检测,该重组蛋白能被猪瘟病毒抗血清所识别。 用IPTG大量诱导重组质粒pPROEX-tE2转化菌后,通过亲和层析柱纯化重组蛋白tE2,以纯化的tE2蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,然后取抗体转阳免疫小鼠的脾淋巴细胞,以PEG与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经过3～5轮的筛选和纯化,最终获得一株能稳定分泌抗CSFV E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经鉴定,该株单克隆抗体能够与CSFV C株和石门株特异性结合,且识别CSFVE2蛋白上的一个线性表位;该单克隆抗体重链为IgG1亚型,轻链为κ型。 总之,本研究利用原核表达系统高效表达了CSFV E2蛋白的主要抗原区,然后以该重组蛋白作为免疫原制备了一株能够稳定分泌抗E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,为以后建立猪瘟诊断方法和研究CSFV E2蛋白的结构与功能提供了材料。
温晓艳[6]2013年在《抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6单克隆抗体制备及鉴定》文中认为流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae, Hi)是广泛存在于健康人呼吸道的条件致病菌,可分为荚膜型和无荚膜型两类,荚膜型包括a-f共6个血清型,无荚膜型又称为不可分型流感嗜血杆菌(nontypeable Haemophilus influenzae, NTHi)。Hi感染十分普遍,可引起脑膜炎、肺炎、关节脓肿等多种疾病,其临床表现严重而缺乏独特性,因此早期、快速的病原学检测对Hi感染的诊断和治疗都具有非常重要的意义。目前我国临床实验室对Hi的检测以培养法为主,其次有血清学方法与各种聚合酶链反应。相比较而言,血清学方法操作简便、敏感性高、无需特殊仪器,具较高的临床实用价值,但目前所用抗体试剂基本依赖进口,价格昂贵,制约了它的使用。本研究旨在获得理想的小鼠抗Hi单克隆抗体杂交瘤细胞株,以制备大量高纯度的Hi单克隆抗体,为改善Hi抗体试剂依赖进口的局面和进一步开发更准确、快速的血清学诊断方法而打下基础。P6蛋白是一种有荚膜和无荚膜的不可分型Hi菌株中均存在的重要外膜蛋白,遗传上具有高度的保守性,而相对于其它种类细菌又具有高度的特异性,因此,确定以P6蛋白作为制备单克隆抗体的特定免疫原。实验过程如下：复苏并扩增基因工程重组菌BL21(pGEX-6p-2-P6),按照实验室确定的表达条件诱导融合蛋白GST-P6表达,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析证实结果与预期一致；利用谷胱甘肽微珠对融合标签GST的吸附作用纯化重组蛋白,以分光光度计测定纯化液的吸光度,计算出GST-P6蛋白的含量约为958μg·mL-1。取纯化的GST-P6与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后腹腔免疫BALB/c小鼠,剂量为每只50μg；以后每隔2周,用相同剂量的免疫原和等体积弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔免疫,连续2次；间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清抗P6蛋白抗体滴度,有3只小鼠的抗体滴度达到1：10000以上；选择滴度高者腹腔注射同等剂量不含佐剂的重组蛋白加强免疫1次,3d后进行融合。按常规程序留取免疫小鼠血清并制备脾细胞与SP2/0细胞,加入聚乙二醇(PEG1500)进行融合；以经甲醛固定的标准Hi菌体和纯化重组蛋白GST-P6分别作为检测抗原,通过方阵实验确定抗原最佳包被浓度、阳性与阴性血清最佳稀释度等,建立间接ELISA法用于筛选杂交瘤细胞；用有限稀释法对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆,共获得2株抗P6蛋白单克隆抗体(McAb)细胞株,分别命名为α2G3和y2C4.经培养上清液检测,证实α2G3和y2C4两株细胞在连续培养、多次传代及冻存复苏后均能稳定分泌抗P6蛋白单克隆抗体；细胞培养上清液最高滴度分别为1：256和1：512.核型分析显示杂交瘤细胞株α2G3的染色体众数为103条,y2C4为95条,特征性的中间着丝粒染色体各为1条,符合融合细胞的特征。通过细胞数量、单抗产量等的观察,推定a2G3的细胞周期约为4-5天。以胶体金单克隆抗体试带鉴定α2G3为IgG2b, y2C4为IgM,两者均为Kappa型。间接ELISA检测表明2种单抗可能识别P6蛋白不同表位；均只与标准或临床分离的Hi菌株起反应,而与绿脓杆菌、产气肠杆菌、大肠杆菌等均不反应,具有良好的特异性；检出Hi标准株的最低包被浓度为每孔6.25×103个细菌,敏感性也较高。本研究成功地制备了2株可稳定产生抗Hi外膜蛋白P6单克隆抗体的杂交瘤细胞株,获得了2种具有良好敏感性与特异性、可结合不同P6抗原表位的单克隆抗体,为进一步研究和开发更准确、快捷的Hi临床检测方法奠定了基础。
杨文超[7]2007年在《猪瘟病毒E2基因部分片段的克隆和原核表达及其抗体制备》文中研究表明E2蛋白是猪瘟病毒的跨膜结构糖蛋白,是最易发生变异的一种蛋白,能诱导感染动物产生保护性免疫和猪瘟病毒中和抗体,是一种免疫优势蛋白,其中A1、B、C区对介导中和抗体的产生很重要,用A1和B或A1和C的单抗可见协同中和反应。表达CSFV Brescia株E2蛋白重组伪狂犬病毒以及用亲和层析法从昆虫细胞中的基因工程E2蛋白均能保护免疫猪抵抗猪瘟病毒的感染,可以确定E2蛋白诱导的免疫反应足以保护免疫猪抵抗猪瘟病毒的感染。为制备猪瘟病毒E2蛋白的抗体,研究E2基因表达产物在免疫检测中的应用及E2蛋白的中和性抗原表位,我们进行了猪瘟病毒E2基因部分片段的克隆和原核表达。首先根据GenBank中登录的猪瘟病毒基因组序列,设计一对引物,利用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术从本实验室保存的重组质粒(PGEX-4T-1-PE2)中扩增出大小约为622bp的基因;经单酶切鉴定,与已知的猪瘟病毒E2基因含有相同的DraⅠ酶切位点。PCR产物分离纯化后连接到pMD18-T载体,并转化宿主菌DH5α,经菌液PCR筛选出阳性重组克隆PMD18-T-TE2,结果表明本实验成功的克隆到猪瘟病毒TE2基因。其次,根据所克隆的猪瘟病毒TE2基因序列和原核表达载体PGEX-4T-1多克隆酶切位点设计另一对引物,应用PCR技术从重组质粒PMD18-T-TE2中扩增出长约622bp的猪瘟病毒TE2基因,编码包括CSFV E2囊膜糖蛋白主要抗原区域A、B、C和D。再将扩增的猪瘟病毒TE2基因克隆到原核表达载体PGEX-4T-1中,经质粒PCR和EcoRⅠ、SalⅠ双酶切鉴定,筛选出阳性重组克隆,构建原核表达重组质粒PGEX-4T-1-TE2。然后将该重组质粒转化大肠杆菌(EcoliRosetta(DE3)BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)表达出谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与TE2的融合蛋白GST-TE2,融合蛋白的分子量约为47.0KD,与预期结果相符。通过优化原核表达条件,确定了原核表达的最佳诱导时间和诱导剂浓度。对表达蛋白的可溶性进行鉴定,结果表明表达产物GST-TE2融合蛋白以包涵体形式存在。我们用优化的原核表达条件对含有PGEX-4T-1-TE2质粒的Rosetta(DE3)BL21菌进行大量诱导表达,反复冻融和超声方法裂解诱导菌,用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法使包涵体充分溶解,Folin-酚法测定提取的融合蛋白GST-TE2浓度约为1.2mg/ml。应用提取的GST-TE2融合蛋白作为抗原免疫小鼠制备鼠抗猪瘟病毒TE2多克隆抗体。琼脂扩散实验表明制备的多抗具有良好的反应性,ELISA实验表明鼠多抗的有效稀释度可达1:25600,免疫印记(Western-blotting,WB)实验证实鼠抗猪瘟病毒GST-TE2多抗含有抗GST抗体和抗融合蛋白GST-TE2抗体。综上所述,本研究成功地克隆了猪瘟病毒TE2基因,成功构建了原核表达质粒PGEX-4T-1-TE2并进行了原核表达,提取了融合蛋白GST-TE2,并且制备了效价高、反应性强的鼠源抗猪瘟病毒GST-TE2多克隆抗体,这些为进一步研究猪瘟病毒E2蛋白免疫学功能及其应用提供了试验材料。
洪琴[8]2011年在《鸡痘免疫增强型核酸疫苗构建及免疫评价》文中研究指明本实验将疑似“混合型”鸡痘的病料进行病理学检查,发现皮肤、气管和喉头病料的细胞胞浆内嗜酸性染色的A型包涵体。病原分离鉴定表明,病毒能在10日龄鸡胚绒毛尿囊膜上形成典型的痘斑,并在CEF上形成鸡痘病毒典型病变。据GenBank发表的FPV美国标准强毒株基因序列,利用Oligo 6.0和Primer 5.0软件设计1对扩增4b core蛋白基因引物,通过PCR扩增测序及动物回归试验证明所分离的病毒是鸡痘病毒(FPV),命名为HH2008。本实验根据Afonso等人已发表的FPV核苷酸全序列(AF198100),针对FPV140上下游设计了1对引物,PCR扩增出FPV140完整的开放阅读框,进行亚克隆构建原核表达质粒pET30a-ENV,表达蛋白大小约为42 ku。制备兔抗ENV多克隆抗体,抗体效价可达到2~(18),Westernblot检测发现多抗血清特异性好,可通过ELISA鉴定鸡痘病毒。本试验将FPV ORF140基因亚克隆至pVAX1真核表达载体中,构建了重组真核表达质粒pVAX-ENV。利用一段编码(G_4S)_3多肽的碱基Linker将ChIFN-γ分别与FPV ENV基因进行连接,成功构建pVAX-ENV-IFN融合基因真核表达质粒。通过脂质体转染法将pVAX-ENV和pVAX-ENV-IFN转入BHK21细胞中并检测到目的蛋白表达。重组真核表达质粒免疫雏鸡进行体内表达检测,ENV基因和ENV-IFN融合基因能够在体内进行表达,同时表达后的融合蛋白可以被ChIFN-γ多克隆抗体和FPV ENV多克隆抗体检测出来,进一步证明了融合基因表达的蛋白保留了融合前两段基因各自的生物学活性,为后续动物试验提供了理论基础。动物免疫试验分为5个组,即E组(FPV ENV基因真核表达质粒免疫组)、E-I组(pVAX-ENV-IFN真核表达质粒免疫组)、V组(鸡痘商品化疫苗免疫组)、P组(pVAX1空质粒免疫组)和PBS对照组(B组)。利用淋巴细胞转化试验、酶联免疫吸附试验和流式细胞术对不同处理组雏鸡的各项免疫指标进行了检测,最后应用病毒攻击试验比较不同质粒免疫组间保护率的差异。结果表明,免疫组各日龄雏鸡免疫指标均比pVAX1空载体组和PBS组高,以ENV-IFN融合基因的结果尤为显着。其中T、B淋巴细胞增殖功能、CD4~+、CD8~+、T细胞数量和外周血液中抗FPV ENV特异性抗体与pVAX1空载体组和PBS组相比较都有明显的提高,且以融合基因组和疫苗组最为显着。综上所述,ChIFN-γ基因在配合FPV抗原基因免疫过程中,机体免疫应答能力增强,提高了机体抵抗病毒的攻击能力。本试验构建ChIFN-γ与病毒抗原基因融合基因质粒鸡免疫保护试验为进一步研究ChIFN-γ生物学活性提供了试验依据,同时为探讨研制新型免疫增强型抗病毒疫苗提供了理论基础。
贾仁勇[9]2008年在《鸭瘟病毒蛋白质组二维电泳特性和UL24基因的发现、原核表达及应用研究》文中指出鸭瘟(Duck Plague,DP)又称鸭病毒性肠炎(Duck Viral Enteritis,DVE),是由鸭瘟病毒(Duck Plague Virus,DPV)引起的常见于鸭、鹅等雁行目禽类的一种急性败血性的接触性传染病,具有较高的发病率和死亡率,是目前水禽养殖业的重要传染病之一。本文通过超速离心获得高纯度的鸭瘟病毒粒子免疫动物制备高免血清,特异与二维电泳分离的病毒蛋白质组印迹而获得单一病毒蛋白,辅以高效液相色谱——四极杆串联电喷雾质谱解析多肽氨基酸序列,以此设计兼并引物扩增鸭瘟病毒基因组,扩增片段进一步杂交验证、分析为鸭瘟病毒UL24(DPV-UL24)基因。通过构建DPV-UL24原核表达质粒并诱导表达,从而对表达蛋白免疫原性、表达蛋白抗体介导的免疫组化和免疫荧光检测人工感染DPV后UL24基因在体内的表达时相与蛋白定位分析、表达蛋白捕获DPV抗体和表达蛋白抗体捕获抗原ELISA方法的研究以及建立了基于DPV-UL24基因检测DPV的PCR方法,结果如下:1.鸭瘟病毒超微结构研究结果表明:病毒粒子具有疱疹病毒典型形态结构,剖面六角外观轮廓清楚,成熟病毒粒子直径约150～266nm,病毒囊膜、核衣壳和核心清晰可见;囊膜外层较内层着色略深,且可见尚未形成完整囊膜的柄状拖尾结构;多数病毒粒子以单核衣壳为主,一定数量的病毒粒子具有双核衣壳,偶见叁核衣壳,核衣壳直径为100～150nm,呈现致密圆形、半圆形或马蹄形等类型;在核衣壳外和囊膜之间可见明显的亮晕;核心DNA电子染色较深,集中分布,直径40～65nm。并且以纯净的病毒粒子免疫成年鸭获得了抗鸭瘟病毒高免血清。2.鸭瘟病毒蛋白质组研究显示:样品经丙酮处理、30mMDTT水化浓度、pH5-8 IPG固相胶条、混合两性载体电解质、0.8mg的上样量,蛋白分离效果好,获1253个银染蛋白点或388个考染蛋白点,不同时期2-DE分离胶蛋白点匹配率达88%,建立鸭瘟病毒蛋白质组二维电泳模型重复性好、稳定、可靠。以此进行蛋白免疫印迹,结果表明至少可以检测到32种免疫印迹蛋白多肽点,其中有5种非特异性蛋白多肽,在27种DPV蛋白多肽中,相对分子量主要集中在20KD～120KD之间,等电点主要位于pH5.30—pH7.50范围。对选择两个病毒蛋白点高效液相色谱——四极杆串联电喷雾质谱鉴定、解析多肽序列,与病毒蛋白库比对获得了七段可信氨基酸肽段序列。3.鸭瘟病毒UL24基因的发现、原核表达、产物纯化及其抗体制备:以鸭瘟病毒基因组为模板,氨基酸肽段设计的兼并引物能够扩增出两条(420bp、730bp)片段,其中730bp片段能够与不同限制性内切酶酶切DPV基因组电泳片段杂交,形成大小不等杂交条带,从而验证了该片段为鸭瘟病毒基因组片段;生物信息学分析,该片段与疱疹病毒基因序列同源性最高,表明了扩增基因片段为鸭瘟病毒UL24基因;进一步研究还表明该基因全序列为具有1230bp开放阅读框核酸序列,与26株同属疱疹病毒氨基酸序列具有较高的相似性,与MDV-1亲缘性最近,该基因编码409个氨基酸残基,有16个抗原决定簇,不含有信号肽,在第56位、284位、294位、325位和383位存在5个潜在的N-糖基化位点,跨膜螺旋预测为外膜蛋白。根据DPV-UL24序列,设计一对特异性引物,从鸭瘟病毒基因组中扩增目标基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将鸭瘟病毒UL24基因正向插入原核表达载体pET-32a(+)的EcoRⅠ和XhoI位点间,成功构建了重组表达质粒pET32a(+)/DPV-UL24。重组表达质粒pET32a(+)/DPV-UL24转化表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导,能表达出了大小约为38kD的UL24重组蛋白,与预期表达蛋白分子量大小相符;经对不同诱导时间及诱导剂IPTG浓度等条件进行优化,确定重组质粒pET32a(+)/DPV-UL24的最佳诱导条件为0.2mmol/L IPTG、37℃条件下诱导5h。表达产物用镍柱亲和层析纯化、梯度透析复性后与等量弗氏佐剂混合制备UL24重组蛋白疫苗,四次免疫家兔,获得的兔抗UL24高免血清经辛酸-硫酸铵粗提后,High Q阴离子交换柱层析纯化抗体IgG。4.鸭瘟病毒UL24基因原核表达产物免疫原性研究:制备的UL24重组蛋白疫苗免疫7日龄雏鸭,并在免疫后3、5、7、10、14、21、28、35、42、49、56、70、84、98d分别血清检测ELISA效价和中和效价,并于免疫后21d将其中一半进行保护试验。结果显示:在免疫后28d重组蛋白ELISA抗体效价OD_(450nm)达到最高1:5120,弱毒疫苗组达1:10240,显着高于对照组(P≤0.05),此后两个月抗体效价均维持较高水平,其消长规律一致。中和试验也表明在免疫后21～28d,重组蛋白组和弱毒免疫组中和效价分别可达1:128、1:256以上,其抗体消长规律与ELISA检测结果相似。重组蛋白免疫保护组发病率50%、死亡率30%,较对照组鸭的发病率100%、死亡率100%明显减少,与弱毒疫苗免疫组(发病率30%、死亡率10%)比较差异不显着。表明DPV-UL24重组蛋白对鸭瘟病毒强毒感染具有一定的保护能力。5.UL24基因在人工感染鸭瘟病毒鸭组织中的表达时相与定位:采用鸭瘟病毒强毒CHv株(DPV-CHv)人工方法感染28日龄鸭,攻毒后于不同时间采集脾脏、胰腺、哈氏腺、法氏囊、肝脏、肠道、肾脏、肺脏、心、脑等组织或器官,经建立的DPV-UL24基因表达蛋白抗体间接免疫组化方法,检测DPV-UL24基因在感染鸭体内的表达时相、侵染过程与定位分布。结果显示:感染后2h可在脾脏、胸腺、肝脏、十二指肠中检测到DPV-UL24基因编码蛋白抗原:攻毒4h时,哈氏腺、腺胃可检测到DPV-UL24基因表达蛋白,8h时在回肠、肺脏,12h在法氏囊和肾脏,24h时在胰腺和肠道各段均呈现阳性反应。通过对鸭瘟病毒蛋白与UL24基因编码蛋白的侵染过程与定位比较发现,免疫器官与肠道黏膜既是病毒,也是UL24基因编码蛋白的靶器官或靶组织,但UL24基因编码蛋白在脑组织嗜性低,分析表明该蛋白可能是膜蛋白,具有运输核浆与引导病毒组分进入核内参与病毒复制的功能。同时,建立的DPV-UL24基因表达蛋白抗体介导的间接免疫荧光方法,也对UL24基因在鸭体组织中的表达时相检测,并对该基因表达蛋白侵染与定位分布进行分析。结果显示:感染鸭瘟病毒强毒2h时,UL24基因即可在脾脏、胸腺、法氏囊、哈德氏腺等免疫器官和肝脏、肺脏、腺胃及大部分肠段编码蛋白,4h时,在脑、心肌和胰腺也检测出UL24基因编码蛋白,8h时在食道粘膜层表达蛋白荧光阳性反应。研究表明:脾脏、胸腺、法氏囊、哈氏腺免疫器官和肠道粘膜也是UL24基因编码蛋白主要的靶器官或靶组织,且在靶器官的侵染与分布具有一定选择性,对粘膜上皮细胞损害严重。26份鸭瘟组织检验,检出25份阳性,阳性率为96.1%(25/26),表明免疫荧光检测石蜡切片中DPV-UL24基因编码蛋白的方法灵敏、特异性强。6.抗鸭瘟病毒UL24基因原核表达蛋白抗体介导的ELISA检测DPV抗原:通过包被兔抗鸭瘟病毒UL24基因原核表达蛋白抗体,以鸭抗DPV-UL24抗体作为夹心抗体,建立并优化DPV抗原捕获ELISA方法,结果表明:兔抗DPV-UL24抗体浓度为5.0μg/100μL,鸭抗DPV-UL24抗体浓度为9.0μg/100μL,酶标抗体浓度为1:2000时获得最适比例稀释度;对乙型肝炎病毒(DHBV)等非鸭瘟病毒感染其它鸭源病原体阳性血清检验均呈现阴性反应,酶标板板间、板内检测变异系数均小于10%,且可检测出46ng纯化的鸭瘟病毒含量,表明了AC-ELISA具有良好的特异、敏感、稳定性。对人工感染DPV强毒后,病毒在雏鸭肝、脾脏、脑、食道、肺、肾等各组织器官的分布与增殖检测与免疫组化、免疫荧光检测UL24基因编码蛋白结果相似。7.抗鸭瘟病毒UL24基因原核表达蛋白ELISA检测DP抗体:以包被重组DPV-UL24蛋白作为抗原检测DPV抗体研究表明:重组表达蛋白包被浓度为1:80(2.5μg/100μL),被检血清稀稀释倍数为1:320,酶标二抗1:2000时为最适稀释比例,建立的间接ELISA方法检测鸭乙肝、鸭疫里默氏菌病等阳性血清均为阴性,板内或板间重复试验显示变异系数均小于7%,能检出经1:2560倍稀释的鸭瘟阳性血清,对127份鸭临床疫病血清检测,阳性检出率为77.2%,与包被全病毒检测DPV试剂盒相比,符合率为92.5%。8.基于鸭瘟病毒UL24基因PCR方法建立和应用:根据本研究获得的DPV-UL24基因序列设计一对引物(P1/P2),对DPV基因组DNA进行扩增。结果显示:能扩增出与预期(585bp)大小一致的片段,对鸭病毒性肝炎病毒、鸭乙型肝炎病毒等病原体核酸提取物均不能扩增出任何条带;且DPV-UL24基因引物P1/P2对DPV基因组DNA检测灵敏度可达到1pg;对14份DPV强毒感染鸭病料进行检测,均扩增出大小一致的特异片段,5份未感染DPV鸭病料扩增结果均为阴性。结果表明,鸭瘟病毒UL24基因PCR方法可靠、灵敏,可应用于临床鸭瘟的诊断与监测。通过对建立的基于鸭瘟病毒UL24基因间接免疫组化、免疫荧光、AC-ELISA和PCR方法的特异性、敏感性和对鸭瘟病料检测结果的比较分析发现,四种方法对鸭瘟阳性病料检测为阳性,对未感染鸭瘟病毒病料、空白对照、山羊血清和鸭源性其它病原体检测均为阴性,说明了四种检测病毒抗原方法均具有良好的特异性;人工感染DPV后分别对鸭组织检测显示,感染4h在脾脏、胸腺、肝脏、十二指肠等部位均呈现阳性反应,而免疫组化方法在感染24h时几乎在全身组织中均有UL24基因蛋白表达,免疫荧光与PCR方法则需12h就呈现阳性反应;AC-ELISA在感染24h对所检测的11份样本均能检出,临床鸭瘟病料检测显示,免疫组化阳性检测率88.4%、免疫荧光阳性检测率96.1%、抗原捕获ELISA阳性检测率为84.6%,PCR阳性率则为100%。
卢敏[10]2008年在《SOD和Env的靶向给药研究》文中研究指明癌症是危害人类健康的重大疾病之一,目前全世界患癌症人口约1500万,我国每年患癌死亡人数约140万。我国居民每死亡5人中,即有1人死于癌症。在国内,癌症已成为健康的重大杀手。在全球,艾滋病已超过癌症成为当前人类的最大敌人。几十年来全世界投入了无尽的人力和物力,但尚未能研制出有效的艾滋病疫苗。人类克服了麻疹、天花、流感,却在艾滋病疫苗研究上举步维艰,甚至首次对科学产生了动摇。在相当长一段时间内,癌症和艾滋病还将和人类共存,威胁着人类的生存和健康。人类一方面努力研究这两种疾病的生物特征,一方面据此设计具针对性的药物,试图攻克这两大疾病。比如,具肿瘤细胞氧自由基清除能力的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和能诱导艾滋病中和抗体的免疫原(人类免疫缺陷病毒包膜糖蛋白,Human immune deficiency virus envelop glycoprotein,Env)。我们的研究主要集中在这两个生物大分子的改造和体内外靶向投递上,特别是对SOD的改造上。目前对SOD的研究集中于Cu/Zn-SOD,而对Fe-SOD的研究较少。Fe-SOD的结构、功能、临床抗氧化功效报道甚少;其产业化制备,临床应用均未起步。然而,临床上Cu/Zn-SOD的体内半衰期仅为7 min,而Fe-SOD则可长达数小时,这暗示了Fe-SOD的临床应用前景。故此我们选择Fe-SOD为研究对象。SOD的肿瘤临床应用还存在诸多其它限制:如无肿瘤细胞定位能力和低细胞穿透能力;而且目前对SOD的抗肿瘤功效争论不一,存在这些争论的原因是SOD的底物(活性氧,Reactive oxygen species,ROS)在生物体内角色多样,功能复杂。我们对Fe-SOD的研究改造即基于以上2个应用缺陷与1个争论展开。第二章在蛋白水平对Fe-SOD进行改造,实现了Fe-SOD的体内外靶向给药;第叁章则在基因水平对Fe-SOD进行单抗融合,实现了对肺肿瘤细胞的高效透膜和靶向杀伤,并揭示了相关的信号转导通路;第四章在单细胞水平上向读者展示了SOD底物(ROS)在肿瘤细胞中的多重角色,以及角色发挥的机制;第五章则为Fe-SOD的产业化制备、临床研究,确立了其临床上的抗氧化效果。诱导具广泛中和效果的抗人类免疫缺陷病毒抗体(即艾滋病疫苗)仍然是目前艾滋病研究领域,甚至是科学研究领域最顶尖的难点。中和抗体诱导失败的原因很复杂,一则HIV病毒表面存在各种非功能性Env免疫原,它们大量诱导出非中和性抗体;二则HIV能快速进化出各种亚型,目前很少有抗体能广泛中和各种亚型HIV。最后一章中我们制备了单一的功能性Env叁聚体,并应用脂质体靶向策略对其进行免疫器官的靶向投递,在体内成功诱导了具广泛中和效果的HIV抗体。研究的内容、结论和主要创新点如下:一、Fe-SOD的克隆表达及体内外靶向投递研究制备了一种既能在体外透膜,又能在体内有效靶向到目标器官的荧光纳米脂质体。研究克隆了完整的念珠藻fe-sod基因(Accession number:AY830114),并构建成高效表达的工程菌pET-SOD(表达量达78%)。研究还设计了一种双重荧光标记的磁靶向纳米脂质体(~100 nm),并确立了SOD靶向脂质体的体内外给药模型:体外透膜投递中,此纳米脂质体主要以内吞方式投递SOD到细胞内部;透膜后SOD从脂质体中释放,进而降低细胞氧化压力:在体内靶向投递中,小尺寸的脂质体更容易进入代谢循环,而共包裹的磁粒子则有效将SOD靶向至小鼠目标组织。这是我国首次利用基因工程方法制备获得Fe-SOD,这将解决工业上从动植物中提取Fe-SOD的来源限制问题。具靶向效果的荧光磁纳米脂质体的制备、以及Fe-SOD的体内靶向投递均属国内外首次。二、肺腺癌靶向性SOD的克隆、靶向投递及抗肿瘤机理分析研究利用基因工程技术制备了具肿瘤靶向杀伤能力的融合SOD。对Fe-SOD序列的进化和结构分析表明其羧基端适于融合改造。单链抗体(ScFv)在保持抗原抗体结合特异性的同时具有较小的分子量,易于到达靶组织。研究从分泌抗肺腺癌单克隆抗体的LC-1细胞系中提取总mRNA,PCR改造获得了抗肺腺癌ScFv。将此ScFv融合到fe-sod的羧基端,获得了具双重活性的SOD-ScFv融合蛋白。荧光标记追踪和Fe-SOD抗血清(以天然纯化的藻类Fe-SOD免疫动物制备)免疫追踪均证实SOD融合蛋白具有靶向识别并进入SPC-A-1肺腺癌细胞的能力。透膜后SOD能清除胞内超氧阴离子,缓解细胞氧化压力(表现为ROS水平降低和GSH水平升高),进而激活Akt/P27~(kipl)信号通路,实现了对SPC-A-1肺腺癌细胞的靶向杀伤。研究同时克服了临床上SOD无肿瘤细胞趋向性和难于进入实体瘤的两大局限;单链抗体对大分子的靶向研究为靶向领域先行者;SOD引发的Akt/P27~(kipl)信号通路属国内外首次报道。叁、ROS在SPC-A-1肺腺癌细胞中的双重角色分析研究在一个肿瘤细胞内部展开,揭示了SOD底物(ROS)的多重角色,进而提出了两条基于ROS水平控制的抗肿瘤策略。ROS在肿瘤细胞生命活动中发挥着双重角色:既可以作为“生长信号”刺激细胞增殖,又能诱导细胞死亡。细胞内Ca~(2+)信号作为大多数应激反应的“第二信使”,在传递氧化信号,控制下游信号转导通路中发挥重要作用。本章研究在一个肿瘤细胞内部展开,以线粒体为研究中心,确定了:1) ROS爆发必需的Ca~(2+)信号传递途径:内质网Ca~(2+)的大量释放以及细胞外Ca~(2+)的少量流入,引发细胞质游离Ca~(2+)和线粒体Ca~(2+)的超载;2)外源氧化压力下胞内ROS为内源性产生:细胞外ROS不能直接穿透细胞膜,胞内的ROS是通过Ca~(2+)信号介导、于线粒体部位内源性产生的,这侧面回答了当前国际上“H_2O_2这个异常重要但又难以追踪的信号分子能否透膜”的争论。3) ROS引发的矛盾信号通路:研究认为ROS是Ca~(2+)信使(“第二信使”)调控的“第叁信使”,它的水平变化能进一步激活细胞生长相关的P-Akt和Bcl-2/cyt c通路。这两条矛盾信号通路在不同氧化压力下各自的主导作用,导致了ROS在肿瘤细胞内的双重角色。四、Fe-SOD的产业化制备和临床研究研究实施了Fe-SOD的大规模提取和临床研究。优化后的Fe-SOD大规模提取工艺一次性过柱即获得高达7 500 U/mg比活的Fe-SOD,革命性地缩短了SOD的纯化周期和纯化成本。临床上,受试者试食SOD类脂质体胶囊后血清的抗氧化指标明显降低。研究实现了Fe-SOD的预产业化,为其临床应用作了直接铺垫。五、Env的靶向性投递研究改造了HIV免疫原,并对其进行了体内免疫器官的靶向投递。我们将HIV包膜糖蛋白(Env)靶向性投递到免疫组织器官,以期产生高效的、具广泛中和效果的抗HIV抗体。研究以脂质体修饰Env叁聚体,并通过对脂质体的尺寸控制来实现对免疫原的免疫器官靶向。在经典的皮下免疫注射实验中,小尺寸脂质体结合的Env有效提高了血清的HIV病毒中和活性,诱导的抗血清至少能中和4种亚型HIV-1病毒。几十年来,制备具广泛中和效果的HIV-1中和抗体一直举步维艰。当前研究证实了免疫原靶向投递策略在这个领域的可应用性。总之,我们的对SOD的改造克服了其临床应用的两大局限,而产业化临床水平的研究则直接为Fe-SOD将来的社会应用作了铺垫,这具有相当大的现实意义。ROS的肿瘤细胞角色分析,明细了SOD基于ROS清除能力的抗肿瘤机理,并在理论上提出了两条基于ROS水平控制的抗肿瘤策略。研究还首创性地在HIV-1疫苗制备领域引入免疫原靶向投递策略,并证实了其可行性,这在举步维艰的HIV-1疫苗研究领域提供了一种新型的免疫思路,具有相当大的理论和现实意义。
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[10]. SOD和Env的靶向给药研究[D]. 卢敏. 浙江大学. 2008
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