PK-15细胞敲除TANK结合激酶1基因促进猪伪狂犬病病毒复制的研究

论文摘要

TANK结合激酶1（TBK1）是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲除PK-15细胞系,并利用CCK-8检测敲除TBK1对PK-15细胞活力的影响。然后利用流式细胞术检测PRV-GFP荧光强度,用RT-qPCR检测PRV-gB、PRV-gE、PRV-TK、IL-1β、IFN-β和ISG15的转录水平,用Western blot检测PRV-gB和PRV-gE蛋白表达水平,以及通过滴度测定检测子代病毒的感染力,综合评价TBK1基因稳定敲除PK-15细胞对PRV病毒复制的影响。结果显示:T7E1检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均切出了目的条带,选取编辑效率最高的TBK1-sgRNA1细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1基因的单克隆细胞,随机选取4号细胞株进行CCK-8检测,结果显示敲除TBK1对PK-15细胞活力无影响。流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15细胞的56.89%,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15-TBK1-/-细胞的77.95%,表明PK-15-TBK1-/-细胞可以促进PRV-GFP复制。RT-qPCR及WB检测显示该细胞系可以促进PRV mRNA转录和蛋白表达。滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK-15细胞复制后TCID50为106.8TCID50·0.1 mL-1,而在PK-15-TBK1-/-细胞中复制后TCID50为108.5TCID50·0.1 mL-1。另外,RT-qPCR结果显示该细胞系可以抑制PRV感染引起的IL-1β、IFN-β和ISG15转录上调。以上结果表明TBK1基因敲除PK-15细胞系促进PRV复制,可能与IL-1β、IFN-β和ISG15转录水平抑制有关。

论文目录

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计与合成

1.2.2 Cas9/sgRNA表达载体的构建

1.2.3 TBK1敲除细胞系的构建

1.2.4 T7核酸内切酶检测

1.2.5 CCK-8细胞活力检测

1.2.6 荧光观察及流式检测

1.2.7 Real-time Quantitative PCR （RT-qPCR）

1.2.8 Western blot检测PRV-gE蛋白的表达

1.2.9 PRV病毒感染力测定（TCID50）

1.2.10 统计学分析

2 结果

2.1 TBK1敲除细胞系的构建

2.2 TBK1基因敲除对PK-15细胞活力的影响

2.3 TBK1基因敲除对PRV-GFP病毒复制的影响

2.4 TBK1基因敲除对PRV-gB、PRV-gE和PRV-TK mRNA表达水平的影响

2.5 TBK1基因敲除对PRV-gB、PRV-gE蛋白表达的影响

2.6 TBK1基因敲除对PRV半数感染量（TCID50）的影响

2.7 TBK1基因敲除对IL-1β、IFN-β及ISG15转录的影响

3 讨论

4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 刘晓贺,巴根,李坚,韩莹倩,张爽,明胜利,杜永坤,褚贝贝,杨国宇,王江

关键词: 结合激酶,基因敲除,猪伪狂犬病病毒

来源: 畜牧兽医学报 2019年06期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河南农业大学牧医工程学院

基金: 转基因生物新品种培育重大专项(2016ZX08006001-006),国家自然科学基金(31502031),霍英东教育基金会高等院校青年教师基金(151033),优势特色学科建设经费(203,18xk0102)

分类号: S852.651

页码: 1239-1248

总页数: 10

文件大小: 2710K

下载量: 248

PK-15细胞敲除TANK结合激酶1基因促进猪伪狂犬病病毒复制的研究

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢