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水貂肠炎病毒NS1非结构蛋白调控细胞凋亡的分子机制

2020-12-02阅读(823)

水貂肠炎病毒NS1非结构蛋白调控细胞凋亡的分子机制

论文摘要

水貂病毒性肠炎（Mink viral enteritis,MVE）是由水貂肠炎病毒（Mink enteritis virus,MEV）引起水貂一种高度接触性、急性传染病,具有高发病率和高死亡率特点,其中幼貂极易感染。MEV DNA基因组包含两个主要的开放阅读框:编码非结构蛋白NS1和NS2以及结构蛋白VP1和VP2,其中NS1非结构蛋白主要调节MEV复制,反式激活编码病毒结构蛋白。目前已经被证实多种细小病毒NS1具有细胞毒性且能诱导细胞凋亡,因此细小病毒NS1一直是研究的热点。目前MEV及其NS1诱导细胞凋亡的分子机理仍不明确。本研究旨在通过分析MEV及其NS1诱导细胞凋亡的信号途径及其作用机制,为揭示MEV引起水貂致病机理奠定理论基础。为了揭示MEV在体内、体外是否能诱导细胞凋亡的发生。体内方面,我们将MEVB细胞毒株感染健康的水貂,分析体内消化道各个组织细胞凋亡情况。结果分析发现,感染病毒的水貂消化道组织出现不同程度的病理变化;采用TUNEL方法检测凋亡细胞,发现被病毒感染水貂的食管、小肠、肠系膜淋巴结、肾脏中发现有凋亡细胞,而舌没有发现细胞凋亡情况。体外方面研究发现MEVB感染F81细胞后,能显著抑制细胞的生长,并且导致细胞在G1期的积累,诱导细胞凋亡的发生。这些结果表明MEV在体内、体外均能诱导细胞凋亡的发生。为了进一步确定MEV NS1、NS2、VP1和VP2是否能诱导细胞凋亡的发生,我们分别构建MEV NS1、NS2、VP1和VP2真核表达质粒,转染到F81和HEK293T细胞中分析诱导细胞凋亡情况。研究显示NS1能显著抑制F81和HEK293T细胞活性,对细胞产生毒性反应,然而VP1和VP2不能抑制细胞活性且不能产生细胞毒性。利用流式细胞术检测NS1、NS2、VP1和VP2对细胞周期和细胞凋亡情况的影响,结果显示NS1能导致F81和HEK293T细胞周期阻滞在G1期,同时采用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测发现,NS1能诱导细胞凋亡的发生。进一步研究发现MEV NS1能导致细胞核呈现碎块状致密浓染、并且能产生DNA Ladder现象,电镜发现染色质浓缩,细胞核凝聚形成大小不等,产生凋亡小体。这些结果表明MEV NS1具有诱导细胞凋亡的能力,而NS2、VP1和VP2不能诱导细胞凋亡。在上述研究的基础上,进一步分析MEV NS1引起细胞凋亡的作用机制。利用Western blot、免疫荧光和流式细胞术分析MEV NS1对细胞内Caspase和凋亡相关蛋白的影响。发现NS1能激活Caspase-9和Caspase-3,而Caspase-8和Caspase-12没有被活化;同时发现NS1能使Bax/Bcl-2比值升高,Bcl-2（Ser 70）磷酸化;促进Bax从胞浆中转位进入线粒体,Cyt C线粒体释放进入细胞质中诱导凋亡发生;NS1能降低线粒体膜电位、提高线粒体膜通透性并且导致细胞内ROS积累;NS1能抑制p38 MAPK和p53启动子活性,还能导致p38 MAPK（Thr 180/Tyr 182）和p53（Ser 15）、p53（Ser 20）发生磷酸化;为了进一步揭示其作用机制,我们用p38 MAPK和p53特异性抑制剂预处理细胞,结果显示NS1诱导细胞凋亡的能力显著下降。综合以上研究结果表明,MEV NS1通过线粒体介导的细胞凋亡途径诱导凋亡,同时p38 MAPK和p53在NS1诱导细胞凋亡过程中起到重要的调节作用。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 英文缩略表
  • 第一章 引言
  •   1.1 水貂病毒性肠炎
  •     1.1.1 水貂病毒性肠炎概述
  •     1.1.2 水貂肠炎病毒病原学
  •     1.1.3 水貂肠炎病毒的分子生物学特征
  •     1.1.4 水貂肠炎病毒编码的蛋白及其功能
  •     1.1.5 水貂肠炎病毒特异性受体
  •     1.1.6 水貂肠炎病毒复制机制
  •     1.1.7 水貂病毒性肠炎的诊断和防治
  •   1.2 细胞凋亡
  •     1.2.1 概述
  •     1.2.2 细胞凋亡与细胞坏死的区别
  •     1.2.3 细胞凋亡的途径
  •     1.2.4 病毒感染与细胞凋亡
  •     1.2.5 细小病毒及其非结构蛋白NS1诱导细胞凋亡
  • 第二章 水貂肠炎病毒诱导细胞凋亡
  •   2.1 试验材料
  •     2.1.1 试验动物、细胞和毒种
  •     2.1.2 主要试剂
  •     2.1.3 主要仪器
  •   2.2 试验方法
  •     2.2.1 MEVB的扩增及其病毒滴度的测定
  •     2.2.2 试验动物分组与攻毒试验
  •     2.2.3 试验动物样品采集
  •     2.2.4 MEV感染水貂后病理学变化
  •     2.2.5 TUNEL细胞凋亡检测
  •     2.2.6 MEV感染F81细胞后对细胞增殖的影响
  •     2.2.7 流式细胞术检测细胞周期
  •     2.2.8 流式细胞术检测细胞凋亡率
  •     2.2.9 数据分析
  •   2.3 结果
  •     2.3.1 MEV感染水貂病理变化
  •     2.3.2 MEV诱导水貂体内不同组织细胞凋亡情况
  •     2.3.3 MEV抑制F81细胞活性
  •     2.3.4 MEV感染诱导F81细胞周期阻滞
  •     2.3.5 MEV感染诱导F81细胞凋亡
  •   2.4 讨论
  •   2.5 小结
  • 第三章 水貂肠炎病毒NS1蛋白调控宿主细胞凋亡
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 细胞株
  •     3.1.2 主要试剂
  •     3.1.3 主要仪器
  •   3.2 试验方法
  •     3.2.1 提取病毒基因组
  •     3.2.2 构建真核表达质粒
  •     3.2.3 鉴定目的蛋白表达
  •     3.2.4 不同蛋白对细胞生存状态的影响
  •     3.2.5 流式细胞术检测细胞周期
  •     3.2.6 流式细胞术检测不同蛋白诱导细胞凋亡情况
  •     3.2.7 Hoechst染色
  •     3.2.8 DNA Ladder检测
  •     3.2.9 超微结构观察
  •     3.2.10 数据分析
  •   3.3 结果
  •     3.3.1 MEV NS1、NS2、VP1和VP2真核表达质粒构建
  •     3.3.2 MEV NS1、NS2、VP1和VP2蛋白表达分析
  •     3.3.3 MTT检测MEV NS1、VP1和VP2蛋白对细胞活性的影响
  •     3.3.4 LDH方法检测MEV NS1、VP1和VP2蛋白对细胞毒性的影响
  •     3.3.5 MEV NS1、VP1和VP2蛋白对细胞周期的影响
  •     3.3.6 MEV NS1、VP1和VP2蛋白对细胞凋亡的影响
  •     3.3.7 MEV NS2蛋白对细胞周期和细胞凋亡的影响
  •     3.3.8 Hoechst染色
  •     3.3.9 DNA片段化分析
  •     3.3.10 电镜观察MEV NS1蛋白诱导细胞凋亡
  •   3.4 讨论
  •   3.5 小结
  • 第四章 水貂肠炎病毒NS1蛋白通过线粒体信号通路诱导细胞凋亡
  •   4.1 试验材料
  •     4.1.1 细胞和质粒
  •     4.1.2 主要试剂
  •     4.1.3 主要仪器
  •   4.2 试验方法
  •     4.2.1 构建p38 MAPK报告基因质粒
  •     4.2.2 检测Caspase-3/9 活性
  •     4.2.3 Western blot试验
  •     4.2.4 细胞线粒体分离
  •     4.2.5 检测线粒体膜电位变化
  •     4.2.6 检测细胞内活性氧
  •     4.2.7 检测线粒体通透性
  •     4.2.8 双荧光素酶检测试验
  •     4.2.9 数据分析
  •   4.3 结果
  •     4.3.1 MEV NS1蛋白通过激活Caspase-9 引起细胞凋亡
  •     4.3.2 MEV NS1蛋白对细胞内Caspase-9 和Caspase-3 活性的影响
  •     4.3.3 MEV NS1蛋白通过线粒体介导的凋亡通路诱导细胞凋亡
  •     4.3.4 MEV NS1蛋白诱导细胞线粒体膜电位消失
  •     4.3.5 MEV NS1蛋白诱导细胞线粒体通透性转变孔开放
  •     4.3.6 MEV NS1蛋白引起细胞内ROS的积累
  •     4.3.7 MEV NS1蛋白抑制p38 MAPK和p53启动子表达
  •     4.3.8 p38 MAPK和p53参与调控MEV NS1蛋白诱导细胞凋亡
  •   4.4 讨论
  •   4.5 小结
  • 第五章 全文结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 作者简历

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 林鹏

    导师: 程世鹏

    关键词: 水貂肠炎病毒,非结构蛋白,细胞凋亡,线粒体介导的细胞凋亡

    来源: 中国农业科学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 中国农业科学院

    基金: 国家自然科学基金青年科学基金项目(No.31602056),吉林省青年科研基金项目(No.20160520034JH)

    分类号: S852.65

    总页数: 96

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