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圈养大熊猫肠道大肠杆菌耐药性分析

2020-12-02阅读(102)

圈养大熊猫肠道大肠杆菌耐药性分析

论文摘要

大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）是温血动物体内的正常寄生菌,属条件性致病菌,致病性大肠杆菌可引起动物肠道炎症而腹泻,严重时造成动物死亡。大肠杆菌在不同药物的选择压力下易产生耐药性,使其成为耐药基因贮存和交换的主要场合。大熊猫是我国宝贵的野生动物资源,疾病致死是造成大熊猫濒危的主要原因之一,而肠道疾病是大熊猫疾病致死的最重要原因。迄今为止,国内外已有少量关于大熊猫肠道大肠杆菌耐药性的研究,但关于大熊猫肠道大肠杆菌携带可移动遗传元件的调查尚无报道。本研究对圈养大熊猫肠道大肠杆菌的耐药性及其携带的可移动遗传元件进行调查,为进一步探究大熊猫肠道大肠杆菌的耐药机制奠定基础,对我国大熊猫的保护具有重要意义。本试验从成都大熊猫繁育研究基地采集圈养大熊猫粪便样品,分离、纯化和鉴定出84株大熊猫肠道大肠杆菌。采取K-B法对分离的84株大肠杆菌对22种抗菌药物的耐药性进行检测。结果显示,84株大肠杆菌对22种抗菌药物表现出不同程度的耐药,其中,氨曲南（aztreonam,AZM）、阿莫西林-克拉维酸钾（amoxicillin-clavulanic acid,AMC）、氨苄西林（ampicillin,AMP）、多西环素（doxycycline,DOX）、四环素（tetracycline,TET）、阿莫西林（amoxicillin,AML）表现出较高的耐药性,耐药率分别为86.90%、80.95%、69.05%、61.90%、48.81%和46.43%。84株大肠杆菌中多重耐药菌株62株（占73.81%）,耐药谱以AMP/AMC为主。不同年龄大熊猫肠道大肠杆菌对氟苯尼考（florfenicol,FFC）的耐药率有极显著性差异（P<0.01）;不同性别大熊猫肠道大肠杆菌的耐药率无显著差异（P>0.05）。对84株大肠杆菌中的21种可移动遗传元件（traA、tbrC、traF、tnpU、tnpA/Tn21、tnsA、merA、tnp513、ISCR1、ISCR3/14、IS1133、ISEcp1、ISpa7、IS26、ISkpn6、ISkpn7、ISaba1、IS903、intI1、intI2、intI3）进行PCR扩增,结果表明,共检出11种可移动遗传元件,其中merA（64.30%,54/84）检出率最高,其次为tbrC（47.62%,40/84）、tnpA/Tn21（35.71%,30/84）、intI1（32.14%,27/84）、IS1133（29.76%,25/84）、IS903（17.86%,15/84）、ISECP1（15.48%,13/84）、ISaba1（13.10%,11/84）、IS26（5.95%,5/84）、ISCR3/14（4.76%,4/84）、intI2（3.57%,3/84）。分离菌株共有36种可移动遗传元件组合形式,其中以携带merA基因为主;84株大肠杆菌中有13株未检测出任何可移动遗传元件。采取PCR扩增27株携带Ⅰ类整合子和3株携带Ⅱ类整合子的大肠杆菌基因盒,结果显示,27株Ⅰ类整合子阳性菌的基因盒组合有6种,分别为dfrA17+aadA5（2株）、aadA2（1株）、dfrA12+aadA2（1株）、dfrA1+aadA1（1株）、dfrA1（1株）和aadA1（1株）;Ⅰ类整合子阳性菌株对CHL、FFC、AMC的耐药率极显著高于阴性菌株（P<0.01）;对AMP、TET、SXT的耐药率显著高于阴性菌株（P<0.05）。3株Ⅱ类整合子阳性菌未检出任何基因盒;Ⅱ类整合子阳性菌和阴性菌株对药物耐药率无显著差异（P>0.05）。本研究表明,圈养大熊猫肠道大肠杆菌对22种抗菌药物表现不同程度耐药,多数呈多重耐药;共检出11种可移动遗传元件;菌株以携带Ⅰ类整合子为主,少部分菌株携带Ⅱ类整合子,携带的基因盒主要为介导氨基糖苷类和甲氧苄啶类耐药的aadA和dfrA;菌株的耐药表型与其所携带的基因盒不一致。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 符号说明
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 大熊猫大肠杆菌病流行病学概述
  •     1.1.1 大肠杆菌病原学
  •     1.1.2 大熊猫大肠杆菌病
  •   1.2 大熊猫大肠杆菌耐药现状
  •   1.3 大肠杆菌耐药机制
  •     1.3.1 生物化学机制
  •       1.3.1.1 酶对抗生素的修饰和水解
  •       1.3.1.2 细菌主动外排机制
  •       1.3.1.3 抗生素作用靶位的改变
  •       1.3.1.4 改变细菌细胞膜的通透性
  •       1.3.1.5 细菌生物被膜的形成
  •       1.3.1.6 代谢途径或代谢状态的改变
  •     1.3.2 遗传学机制
  •       1.3.2.1 基因突变
  •       1.3.2.2 细菌间耐药基因转移
  •   1.4 研究目的和意义
  • 第二章 大熊猫肠道大肠杆菌的分离鉴定及耐药性检测
  •   2.1 材料和方法
  •     2.1.1 主要仪器和试剂
  •     2.1.2 细菌通用16S rDNA引物序列
  •     2.1.3 粪便样品采集
  •     2.1.4 大熊猫肠道大肠杆菌分离、鉴定及保存
  •       2.1.4.1 大熊猫肠道大肠杆菌的分离
  •       2.1.4.2 大熊猫肠道大肠杆菌的鉴定
  •       2.1.4.3 大熊猫肠道大肠杆菌的保存
  •     2.1.5 抗菌药物的耐药性检测
  •       2.1.5.1 药物敏感性试验
  •       2.1.5.2 药敏结果判断
  •       2.1.5.3 数据分析及处理
  •   2.2 结果
  •     2.2.1 大熊猫肠道大肠杆菌的分离和鉴定
  •       2.2.1.1 革兰氏染色结果
  •       2.2.1.2 16S rDNA基因PCR测序结果
  •     2.2.2 大熊猫肠道大肠杆菌的药敏结果
  •     2.2.3 不同年龄大熊猫肠道大肠杆菌的药敏结果
  •     2.2.4 不同性别大熊猫肠道大肠杆菌的药敏结果
  •     2.2.5 84株大熊猫肠道大肠杆菌的多重耐药性
  •   2.3 讨论
  •   2.4 小结
  • 第三章 大熊猫肠道大肠杆菌可移动遗传元件携带的研究
  •   3.1 材料和方法
  •     3.1.1 主要仪器和试剂
  •     3.1.2 PCR引物序列及合成
  •     3.1.3 大熊猫肠道大肠杆菌DNA的提取
  •     3.1.4 大熊猫肠道大肠杆菌可移动遗传元件的扩增
  •     3.1.5 目的片段的测序与序列分析
  •     3.1.6 数据分析及处理
  •   3.2 结果
  •     3.2.1 大熊猫肠道大肠杆菌可移动遗传元件的携带结果
  •     3.2.2 大熊猫肠道大肠杆菌可移动遗传元件的组合模式
  •     3.2.3 大熊猫肠道大肠杆菌菌株Ⅰ类整合子-基因盒的扩增结果
  •     3.2.4 大熊猫肠道大肠杆菌菌株Ⅱ类整合子-基因盒的扩增结果
  •     3.2.5 整合子-基因盒与分离菌株耐药表型间关系的分析
  •   3.3 讨论
  •   3.4 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 魏斌

    导师: 钟志军,石梅

    关键词: 大肠杆菌,圈养大熊猫,耐药性,可移动遗传元件,整合子基因盒

    来源: 四川农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 四川农业大学

    基金: “成都大熊猫繁育研究基金会项目”(编号CPF2015-4,CPF2017-05)

    分类号: S852.61

    DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000504

    总页数: 64

    文件大小: 1975k

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