谢谆怡[1]2004年在《核受体PPARγ结合小肽的筛选及初步功能鉴定》文中研究说明过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)是一类由配体激活的转录因子,属于核受体超家族的成员。PPARs存在叁种亚型:PPARα、PPARβ/δ和PPARγ。其中PPARγ可由多种脂肪酸及其代谢产物激活,在机体糖类和脂类代谢中起到重要调节作用,与2型糖尿病、动脉粥样硬化、高血压等多种代谢性疾病以及炎症、肿瘤等的发生密切相关。目前,PPARγ作为多种疾病治疗的一个重要靶分子,正受到越来越多的关注。近年来发展较快的噬菌体肽库筛选技术正广泛应用于小分子药物设计、重组疫苗研制、抗病毒药物筛选及细胞信号传导研究等领域,其筛选的共同点是钓取与蛋白(如抗体,受体,酶)特异性结合的配基。这种筛选功能性短肽的策略对于PPARγ与其作用分子的研究有很大的借鉴意义。本研究表达纯化了PPARγ配体结合域(ligand bind- ing domain, LBD)的his融合蛋白,并以之为靶,从噬菌体肽库中筛选结合PPARγ受体的短肽,对短肽分子进行了初步鉴定,为进一步研究PPARγ作用的分子机理以及开发以PPARγ为作用靶点的药物奠定了基础。本研究进行了以下工作:1.在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达核受体PPARγ配体结合域的融合蛋白。经终浓度为0.5mmol/L的IPTG在20℃诱导表达12小时,重组PPARγ-LBD融合蛋白得到高效表达。SDS-PAGE分析可见,表达蛋白的分子量约为34kD,近半数以可溶蛋白形式存在。2.利用Ni2+-NTA纯化系统对表达蛋白进行有效纯化。纯化蛋白在SDS-PAGE上呈现单一条带,凝胶成像系统软件分析纯化蛋白的纯度大于90%。3.以纯化的重组PPARγ-LBD融合蛋白为靶,采用固体包被法对噬菌体展示随机十二肽库及环七肽库进行亲和筛选。ELISA法鉴定特异结合的高亲和力阳性噬菌体单克隆并测序,获得与PPARγ-LBD高亲和力的噬菌体展示十二肽单克隆3个,环七肽单克隆5个,十二肽中出现LXXLL基序,环七肽序列中包含较为特征性的DXXRW序列。再经ELISA法从测序后的阳性噬菌体展示肽中选择与PPARγ-LBD亲和力最高的肽段,进行多肽合成。
谢谆怡, 江渝, 叶治家, 彭家和, 何凤田[2]2005年在《核受体PPARγ结合小肽的筛选及其功能》文中进行了进一步梳理为筛选与核受体过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)结合的功能短肽,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达PPARγ配体结合域(LBD)的融合蛋白,并利用Ni2+-NTA离子交换树脂对表达蛋白进行纯化.以此纯化蛋白为靶,采用固体包被法对噬菌体展示随机十二肽库及环七肽库进行亲和筛选.经ELISA法鉴定特异结合的高亲和力阳性噬菌体单克隆并测序.同时利用PPARγ的配体rosiglitazone与噬菌体小肽进行竞争性结合抑制实验.最终获得与PPARγ-LBD高亲和力的十二肽3个,环七肽5个,分别含LXXLL和DXXRW(其中X为非特异氨基酸残基)保守序列.Rosiglitazone不影响噬菌体小肽与靶蛋白的结合,说明获得与配体rosiglitazone结合位点不同的目的肽.
周越[3]2013年在《贻贝肽与贻贝多糖对衰老的干预作用及其机制》文中提出贻贝是一种药食同源的海洋贝类,我国资源极其丰富。多肽与多糖是主要活性成分,可以改善或减缓年龄相关性疾病的发生,延长老年人的健康期,但其延缓衰老的作用及机制并不明确。鉴于此,本研究以紫贻贝为原料,制备贻贝肽和贻贝多糖,在初步证实了贻贝肽和贻贝多糖对衰老的干预作用的基础上,并从机体、组织器官、细胞以及分子等不同层次深入研究了贻贝肽和多糖的抗衰老机制,为高效利用贻贝资源以及抗衰老膳食补充剂或药物的开发提供实验依据和技术支撑。主要研究内容与结果如下：(1)采用碱提酸沉法提取贻贝蛋白,优化了酶解蛋白的工艺参数,并采用超滤分级制备贻贝寡肽。结果表明,在pH值为11.5时蛋白提取率可达76.1%；以中性蛋白酶和风味酶两种蛋白酶,复合酶法酶解贻贝蛋白,在酶用量各为4000U/g、温度50℃、pH值6.5、时间120min的条件下,酶解液对羟自由基清除率可达88%。采用3-10KDa的超滤膜对酶解液进行超滤分级,得到四种组分,其中分子量小于1kDa的贻贝肽占总量的77.1%,且抗氧化活性最强。(2)采用加酶辅助提取和热水浸提法相结合工艺,制备了贻贝多糖,并进行了初步纯化。结果表明,采用热水浸法提贻贝多糖时,较优的提取条件为料液比为1：40、浸提温度为60℃、浸提时间为6h；加酶辅助提取的总糖含量由8.8%增加到10.3%,且减少了脱蛋白次数；粗多糖经过脱蛋白后,经醇沉、透析等处理后,其特征吸收峰为196nm,贻贝多糖中含有的糖醛酸、硫酸基及糖胺聚糖的含量分别为9.77%、4.14%和10.2%,主要由鼠李糖、木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖5种单糖组成,是一种潜在的活性功能多糖。(3)建立应激诱导的人二倍体细胞株MRC-5早衰细胞模型,系统地研究了贻贝肽与贻贝多糖对细胞早衰的影响。结果表明,200μmol/L的H202可诱导年轻的MRC-5细胞早衰；0.2mg/mL的贻贝肽、贻贝多糖对细胞早衰均有显着地干预作用,表现为细胞形态正常；细胞活力明显增加(p<0.01), SA-β-gal染色及SAHF阳性率显着降低(p<0.05)；并促使细胞增殖,缓解H202对线粒体膜电位的损伤,贻贝肽的干预作用更加显着,其机制可能与上调Sirtl及Nampt的mRNA的表达有关,同时使GSH含量上升,Prx1mRNA表达量上调,通过保持细胞较强的还原性,实现对细胞衰老的干预。(4)采用黑腹果蝇为模式生物,研究贻贝肽、多糖对雌雄果蝇的寿命和生命活力的影响。结果表明,0.3mg/mL以及3mg/mL的贻贝肽、贻贝多糖均可以延长果蝇平均寿命以及最高寿命,并显着提高果蝇的性活力(p<0.05);3mg/mL的贻贝肽、贻贝多糖还增强了SOD活性,并降低MDA的含量(p<0.05),减少果蝇体内的氧化损伤。(5)建立D-半乳糖致衰老小鼠模型,研究了贻贝肽、多糖对衰老小鼠脑退行性变化的保护作用及机制。结果表明,200mg/kg.d的D-半乳糖注射处理,可诱导ICR小鼠的学习记忆能力和运动平衡能力显着下降(p<0.05),1000mg/kg.d的贻贝肽、多糖均可以显着改善这些行为障碍(p<0.05);贻贝肽、多糖通过降低脑组织中乳酸水平、抑制iNOS活性,维持NO平衡,减少自由基损伤,促进神经细胞存活；贻贝肽还上调PI3K、Akt的蛋白表达、调控PI3K/Akt信号通路,从而改善小鼠的脑退行性变化。(6)采用D-半乳糖致衰老小鼠模型,研究了贻贝肽、多糖对衰老小鼠糖脂代谢的影响及其分子机制。结果表明,给小鼠灌胃1000mg/kg.d和200mg/kg.d贻贝肽、多糖,可缓解模型小鼠的衰老症状与腹腔脂肪堆积；高剂量的贻贝肽可使小鼠的血糖和TG水平显着降低(p<0.05),HDL-C水平的显着升高(p<0.05);同时,使肝脏组织中游离脂肪酸显着降低(p<0.05)、肝糖原含量升高；贻贝肽、多糖可使小鼠肝、肾组织中SOD活性和GSH含量均显着升高(p<0.05),MDA的含量均显着下降(p<0.05),减少了小鼠体内氧化损伤；同时使肝脏、脂肪组织的PPARa和PPARy蛋白表达增加,从而改善衰老小鼠的糖脂代谢。
丹妮[4]2018年在《粗饲料品质对奶牛乳脂脂肪酸组成的影响及其机理研究》文中提出本论文以饲喂不同日粮的奶牛乳腺组织为材料,进行转录组测序探讨奶牛乳腺组织差异基因的表达,测序结果提示PPARG途径在不同日粮组间有明显的差异,结合乳中脂肪酸的变化推测PPARG途径的变化与乳脂的合成有关联。因此,通过腺病毒介导的RNA干扰、过表达以及外源添加长链饱和及不饱和脂肪酸验证PPARG基因在奶牛乳腺上皮细胞中对脂肪合成的影响及其机理。本论文的主要研究内容和结果如下:1.本试验研究了奶牛饲喂不同粗饲料和精粗比的日粮后,乳中脂肪酸及乳腺组织转录水平的差异。试验采取单因素完全随机试验设计,将30头体重相近、泌乳中期的经产荷斯坦奶牛随机分为3个组,分别饲喂3种日粮,即混合粗饲料组(MF),精粗比为46:54;高精料秸秆组(CS1),精粗比为65:35;低精料秸秆组(CS2),精粗比为46:54。试验包括3周的预饲期和9周的正式试验期,每3周为一个试验周期。每个试验周期采集乳样,试验期最后一天采集乳腺组织样品。结果显示,CS2组与MF组的乳脂率无差异(P>0.05),但CS2组乳中长链脂肪酸、单不饱和脂肪酸以及C18:3含量显着高于MF组,而从头合成的脂肪酸和饱和脂肪酸含量则显着低于混合粗饲料组(P<0.05);乳腺组织内PPARG调控途径的差异表达基因为CS2组高于MF组转录丰度,推测在乳腺脂肪酸的代谢过程中PPARG发挥一定作用。2.通过腺病毒介导的RNA干扰技术,研究了奶牛乳腺上皮细胞中PPARG基因表达量的降低对乳脂合成的影响。本试验中腺病毒干扰乳腺细胞后PPARG的基因和蛋白表达量均下降55%,说明对PPARG活性干扰成功。PPARG被干扰后,ACACA、FASN、SCD、ACSL1、AGPAT6、GPAM、LPIN1等乳脂合成相关基因显着下调(P<0.05),转录因子SREBF1和PPARA表达量显着下调(P<0.05),而FABP3及DGAT1表达量显着提高(P<0.05)。细胞内甘油叁酯的含量没有显着变化(P>0.05)。3.通过腺病毒过表达奶牛乳腺上皮细胞内PPARG基因后,其mRNA和蛋白表达量明显上升(P<0.05),说明过表达病毒构建成功。过表达PPARG后ACACA、FASN、SCD、ACSL1、AGPAT6、DGAT1、GPAM、LPIN1以及PPARA等乳脂合成代谢相关基因的表达显着上调(P<0.05),而LPL、CD36和FABP3无变化(P>0.05)。此外,细胞内甘油叁酯含量增加明显(P<0.05)。4.脂肪酸是PPARG的天然配体,本试验研究了混合饱和或不饱和脂肪酸对PPARG和乳脂合成基因的影响。通过不同浓度C16:0、C18:0、C18:1、C18:2及C18:3长链脂肪酸对细胞活性的影响,筛选了不抑制细胞活性的添加浓度。本试验将脂肪酸分为混合饱和脂肪酸组(SFA)和混合不饱和脂肪酸组(UFA),SFA组脂肪酸浓度为C18:0 50μM和C16:0 100μM,UFA组脂肪酸浓度为C18:1 75μM,C18:2 100μM和C18:3 3μM。添加UFA和SFA均会抑制细胞内ACACA、FASN、SCD、FABP3以及SREBF1基因表达量(P<0.05);此外,SFA显着下调CD36、ACSL1、DGAT1、GPAM、PPARA(P<0.05),UFA对这些基因无影响。外源添加UFA或SFA都会明显提高细胞内甘油叁酯的含量以及PPARG的蛋白表达量(P<0.05)。5.在PPARG干扰的奶牛乳腺上皮细胞中添加UFA或SFA会明显影响乳脂合成相关基因的表达量,其中ACACA、FASN、FABP3、LPIN1受到抑制(P<0.05),而CD36和ACSL1则显着提高(P<0.05)。UFA显着提高甘油叁酯合成相关基因、PPARG以及PPARA表达量,并抑制SCD和SREBF1基因的表达(P<0.05)。PPARG表达量较低时外源脂肪酸对细胞内甘油叁酯含量及PPARG蛋白表达没有影响(P>0.05)。6.PPARG过表达的奶牛乳腺细胞中添加UFA或SFA会下调ACACA、FASN和SREBF1的mRNA水平(P<0.01),上调CD36、DGAT1、GPAM和PPARG的表达量(P<0.05)。饱和脂肪酸明显促进SCD、LPL、ACSL1、FABP3、AGPAT6以及LPIN1的表达量(P<0.01),而不饱和脂肪酸组对这些基因无促进效果此外,PPARG表达量较高时,长链脂肪酸会提高细胞内PPARG蛋白表达以及甘油叁酯的合成量(P<0.05)。总之,相比优质混合粗饲料,以低劣质秸秆为粗饲料的日粮组奶牛乳腺摄取更多长链脂肪酸,并抑制脂肪酸从头合成。以奶牛乳腺上皮细胞为模型的体外试验显示转录因子PPARG是奶牛乳腺中脂肪酸代谢过程的关键调控因子,参与调控脂肪酸的从头合成、去饱和、甘油叁酯的生成等过程。长链脂肪酸激活PPARG活性,激活的PPARG参与长链脂肪酸对脂肪酸从头合成基因的抑制过程,并且提高细胞内甘油叁酯的含量。
参考文献：
[1]. 核受体PPARγ结合小肽的筛选及初步功能鉴定[D]. 谢谆怡. 第叁军医大学. 2004
[2]. 核受体PPARγ结合小肽的筛选及其功能[J]. 谢谆怡, 江渝, 叶治家, 彭家和, 何凤田. 中国生物化学与分子生物学报. 2005
[3]. 贻贝肽与贻贝多糖对衰老的干预作用及其机制[D]. 周越. 江苏大学. 2013
[4]. 粗饲料品质对奶牛乳脂脂肪酸组成的影响及其机理研究[D]. 丹妮. 内蒙古农业大学. 2018