CRISPR/Cas9介导基因编辑制备FoxJ1缺失小鼠气道上皮细胞和遗传修饰雪貂模型

论文摘要

基因编辑是指借助细胞自身的基因组损伤修复机制对目标基因的核苷酸序列进行碱基删除、插入、定点突变和组合编辑等基因操作技术。近年出现的CRISPR/Cas9定点基因编辑技术极大提高了基因编辑效率、推进了基因功能的研究,并在构建人类疾病模型、推动基因治疗、加快农作物和动物的遗传改良等领域有着巨大的应用潜力。在传统的呼吸道干细胞功能研究中,需要使用基因型相同的细胞群作为研究对象。如何运用CRISPR技术对呼吸道干细胞群进行基因编辑,并高效的筛选阳性编辑的细胞成为了一个急需攻克的难题。本研究首次将荧光报告基因的优势与CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术的特点相结合,建立了有效的基因编辑细胞富集平台,突破了 CRISPR技术在干细胞研究领域的应用瓶颈。首先,采用经体外酶切筛选出高效靶向Loxp位点的sgRNA（LoxP-sgRNA）转染表达Cas9的ROSA26-LoxP-tdTomato-stop-LoxP-EGFP（ROSA-TG）报告基因小鼠气道上皮细胞,结果发现CRISPR/Cas9高效介导LoxP位点中间的tdTomato基因剪切,红色荧光细胞向绿色和无色荧光的转变率达到72.7%。扩增并亚克隆转染细胞基因组内2个Loxp中间的序列,测序分析证实绝大部分克隆发生了双酶切（96.6%）。其次,使用该LoxP-sgRNA同2条靶向小鼠FoxJl基因2号外显子的sgRNA共转染上述ROSA-TG细胞,用流式细胞术筛选绿色荧光转换细胞作为FoxJl基因敲除富集细胞。对亚克隆绿色细胞FoxJl基因两个识别位点内的序列分析来评估该平台的富集效果,发现所有来自绿色荧光细胞的克隆子在FoxJl基因内100%发生了靶向双位点酶切（26/26）,而红色细胞内只有25%发生了双酶切（7/28）。基因表达分析进一步证实绿色荧光细胞内未检测到FoxJl的mRNA转录。上皮细胞分化试验结果显示,绿色荧光细胞分化的气道上皮中纤毛细胞占4.32%,而红色细胞中的纤毛细胞占38.5%。对囊性纤维化跨膜转运调节体（CFTR）介导的上皮细胞电生理功能分析进一步表明,无Loxp剪切的红色荧光细胞来源上皮中CFTR介导的诱导微电流和抑制微电流分别为33.6μA/cm3和64.5μA/cm3,分别是绿色荧光细胞诱导微电流7.21μA/cm3和抑制微电流13.4μA/cm3的4.66倍和4.81倍。说明FoxJl基因的敲除对细胞分化后的CFTR氯离子通道产生了明显的抑制作用。同时,为扩展该基因编辑细胞富集平台的应用,本研究额外筛选了靶向敲除EGFP和tdTomato基因的sgRNA,可用红、绿色荧光的淬灭作为替代筛选标签。与小鼠呼吸道比较,雪貂的呼吸道无论在生理学还是细胞组成与生物学方面都更接近于人类。表达平滑肌肌动蛋白（αSMA）的气道肌上皮细胞最近被确定为气道上皮内的重要干细胞亚群,在气道上皮的损伤修复和维护气道稳态方面发挥主要作用。为深入研究肌上皮干细胞的发育来源和慢性呼吸道疾病的病理发生,本项目在前期建立CRISPR/Cas9基因编辑细胞富集平台工作的基础上,进一步构建了雪貂ROSA-TG和αSMA-CreERT2品系报告基因模型。在技术上,为探索一种利用CRISPR技术快速、高效构建雪貂模型的新方法,本研究在构建这些转基因雪貂模型时分别尝试利用细胞内的两种不同的DNA损伤修复机制——非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HDR）来介导敲入。在雪貂ROSA-TG品系构建过程中,首先在雪貂基因组中设计了 3条靶向ROSA基因的sgRNA,并用体外酶切法筛选出最优的1条用于试验。将克隆构建好的供体质粒消化为单链DNA后与sgRNA共同显微注射到179枚雪貂受精卵中。将151枚发育到2细胞阶段的受精卵移植到5只假孕受体雪貂体内,产生了 23只雪貂幼崽。经PCR基因分型、测序分析及Southern blot验证,获得了 4只健康的ROSA位点敲入荧光报告系统TG的转基因杂合体雪貂。使用表达Cre重组酶的腺病毒感染转基因雪貂的纤维细胞的试验和Southern印迹法均证实了敲入的Cre/LoxP荧光报告系统的有效性和准确性。同样,在αSMA-CreERT2品系雪貂构建中,使用设计并筛选出的最佳的1条靶向雪貂基因组ACTA2基因的sgRNA,与构建好的单链DNA供体质粒共同显微注射到155枚雪貂受精卵内。将得到的110枚发育到2细胞阶段的受精卵移植到5只假孕受体雪貂体内,共产生16只雪貂幼崽。经PCR基因分型、测序分析及Southern印迹法验证,共获得4只健康的具有转基因靶向敲入的杂合体雪貂。通过对αSMA-CreERT2转基因雪貂纤维细胞的Cre报告基因慢病毒感染、TGFβ激活αSMA的表达和他莫昔芬协助Cre入核转运试验,证实了基因组整合的各个功能元件均具有完全功能。综上所述,本论文充分利用了 CRISPR/Cas9技术的无种属限制、特异性强和高效快捷的优势,将试验内容从小鼠原代细胞基因敲除株的建立逐步深入到转基因雪貂模型的构建,研究对象从体外小鼠气道上皮基底干细胞逐步扩展到体内雪貂受精卵和组织特异性的肌上皮干细胞,研究方式从荧光基因敲除延伸到分别利用NHEJ和HDR通路进行报告基因敲入。为CRISPR技术以及转基因雪貂模型在干细胞研究领域的广泛应用打下基础。本项目建立的雪貂模型可用于针对肌上皮干细胞的谱系追踪研究,以揭示呼吸道干细胞功能、修复再生以及细胞异常增生的发生机制。本研究内容将为利用CRISPR/Cas9技术制备基因修饰原代细胞模型,以及利用雪貂模型研究呼吸道干细胞生物学提供技术方法和有效可靠的模型。

论文目录

文章来源

类型: 博士论文

作者: 于淼

导师: 刘晓明

关键词: 基因敲除,荧光报告基因,雪貂模型,谱系追踪

来源: 宁夏大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 宁夏大学

基金: 国家自然科学基金(项目号:31472191)

分类号: Q78

DOI: 10.27257/d.cnki.gnxhc.2019.000001

总页数: 107

文件大小: 8769K

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标签：基因敲除论文;  荧光报告基因论文;  雪貂模型论文;  谱系追踪论文;