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摘要目的：观察苦参碱对人皮肤癌A431细胞体外增殖、细胞周期及细胞凋亡作用的影响，探讨其对皮肤癌可能的作用机制。方法：选用人皮肤癌细胞株A431，设置苦参碱的浓度为0.5、0.75、1g/L浓度组，阴性对照组和阳性对照组（顺铂组）。MTT法检测苦参碱对人皮肤癌细胞增殖的，流式细胞仪检测苦参碱对人皮肤癌细胞周期的影响。结果：苦参碱在0.5、0.75、1g/L浓度时均能明显抑制人皮肤癌A431细胞增殖，抑制率分别为13.35%、23.61%和41.47%，存在着明显地浓度依赖关系，与对照组相比差异显著（P<0.01），IC50为1.21g/L。苦参碱0.5、0.75、1g/L浓度组G0/G1期细胞数量明显高于对照组，并呈浓度依赖关系。另外，苦参碱可诱导人皮肤癌细胞发生凋亡，凋亡率分别为5.86%、10.27%和20.32%。结论：苦参碱对人皮肤癌细胞有明显的生长抑制作用，并有明显的剂量依赖关系；苦参碱可能是通过将人皮肤癌细胞周期阻滞在G0/G1期，抑制其增殖，通过诱导人皮肤癌细胞发生凋亡等，发挥其抗皮肤癌作用。
关键词：苦参碱；人皮肤癌细胞；细胞增殖；细胞周期；凋亡
Effectsofmatrineoncellproliferation,cellcycleofhumanskincancercelllineA431
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofmatrineoncellproliferation,cellcycleandapoptosisrateofhumanskincancercelllineA431.MethodsMTTwasusedtomeasureinhibitoryeffectsofmatrineongrowthofA431cells，flowcytometrywasusedtoanalyzethecellcycleandapoptosisrate．Results:MatrinecanobviouslyinhibitedthegrowthofA431attheconcentrationof0.5,0.75and1g/L,andtheinhibitingrateswere13.35%、23.61%and41.47%,respectively,whichwasinadose-dependentmanner，andthereweresignificantdifferenceincomparisonwiththecontrolgroup(P<0.01).IC50valuewas1.21g/L.ThenumberofA431cellsinG0/G1phaseofmatrinegroupsweresignificantlymorethanthatinthecontrolgroupandinaconcentration-dependentmanner.A431cellsshowedapoptosiswhenexposedtomatrine,theapoptosisratewere5.86%、10.27%and20.32%,respectively.Conclusion:Matrinehadasignificantinhibitingeffectonhumanskincancercellsinanobviousdose-dependentmanner.MatrineinhibitedtheproliferationofthecellsbyblockingtheskincancercellcycletoG0/G1phase,anddevelopeditsanti-tumorfunctionbyinducinghumanA431cellsapoptosis.
Keywords:Matrine;humanskincancerA431cells;cellproliferation;cellcycle;apoptosis
引言
皮肤鳞状细胞癌（squamouscellcarcinoma，SCC）是最常见的皮肤恶性肿瘤之一，来源于表皮角质形成细胞。日光中的紫外线，是引起皮肤鳞状细胞癌发生的主要环境因素之一。随着环境污染、臭氧层破坏加重，其发病率近年来呈现逐年上升的趋势。皮肤鳞状细胞癌病情发展迅速，对组织的破坏性较大，晚期可出现淋巴结转移、内脏转移，逐渐发展成为威胁人类健康的主要皮肤肿瘤[1-3]。皮肤鳞癌的防治也越来越受到人们的广泛关注，目前仍以手术治疗为主[4]。但是，临床病例中有些不适合手术治疗的患者，或某些术后需要预防复发的患者，采用非手术的治疗方法就显得尤为必要。因此，研究有效的抗皮肤鳞状细胞癌的药物具有重要的意义[5]。其中，中医药对皮肤鳞癌的治疗作用和优势也越来越受到医学工作者的重视[6-7]。
苦参系豆科植物苦参的干燥根。其含有多种生物碱，但主要为苦参碱和氧化苦参碱[8]。苦参碱具有抗病毒、抗心律失常、抗炎、抗肿瘤、抗纤维化等多种药理作用[9-13]，广泛应用于临床。本文针对苦参碱对人皮肤癌细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡作用的影响，探讨其对皮肤癌可能的作用机制。
1材料和方法
1.1材料人皮肤癌细胞株A431购自中科院上海细胞库。
1.2试剂苦参碱（西安东华生物工程有限公司），顺铂（浙江海正药业），RPMI1640培养基（美国GIBCO产品)；胎牛血清（杭州四季青）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、碘化丙啶（PI染料）、DMSO均购自Sigma公司，AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自北京鼎国生物技术公司。
1.3仪器自动酶标仪550（日本BIO-RAD公司）；倒置显徽镜（日本NIOKO公司）；CO2孵箱（日本株式会社）；流式细胞仪（美国Beckman公司）；凝胶成像系统GIS-2019（上海Tannon公司）。
1.2方法
1.2.1细胞培养人皮肤癌A431细胞在RPMI-1640培养基(含10%FBS及1%青霉素-链霉素)中，于37℃、5%CO2、100%湿度条件下传代培养，3～4d传代1次。
1.2.2MTT法检测苦参碱对人皮肤癌细胞增殖的作用
将对数生长期的人皮肤癌A431细胞经0.25%胰酶消化后，调整细胞密度为5×105/L，按每孔100μL接种到96孔板内，培养24h后加入不同浓度（0.5、0.75、1g/L）的苦参碱，继续培养72h。弃上清，每孔加100μL0.5g/L的MTT，继续培养4h后，弃上清，每孔加200μL的DMSO，振荡摇匀，用酶标仪检测OD490值。实验同时设阴性对照组和阳性对照组（顺铂组），每组设6个复孔，重复三次。计算细胞生长抑制率和半数抑制浓度（IC50）。
抑制率=（对照组平均OD值－加药组平均OD值）/对照组平均OD值×100%
1.2.2流式细胞术检测苦参碱对人皮肤癌细胞周期及凋亡率的影响
将对数生长期的A431细胞，以1×105/孔接种于6孔板中，随机分为对照组和实验组，实验组分别用苦参碱（0.5、0.75、1g/L）处理48h后，再用含有0.25g/L胰酶消化，收集细胞，用预冷的PBS缓冲液洗2次，1500r/min离心10min，然后用预冷的75%乙醇固定，置于4℃冰箱过夜。次日用PBS缓冲液洗2次，1500r/min离心10min，重悬于200μL的BindingBuffer中，加入10μL的AnnexinV-FITC后，室温避光15min。再加入含有20mg/L的RNaseA的PI染液避光染色30min，调整细胞浓度至1×109/L，流式细胞仪检测，每样本至少检测10000个细胞，按FACSort软件求得各细胞周期的百分比及细胞凋亡率。
1.2.3统计学分析
采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，实验数据均以表示，采用方差分析及t检验。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异非常显著。
2结果
2.1苦参碱对人皮肤癌A431细胞增殖作用的影响
苦参碱组（0.5、0.75、1g/L）浓度组对人皮肤癌A431细胞的增殖有明显抑制作用（P<0.01），且存在剂量依赖关系，其抑制率分别为13.35%、23.61%和41.47%，IC50为1.21g/L。
3讨论
苦参碱是中药苦参的主要活性成分，具有抗过敏、抗炎、抗纤维化、抗肿瘤及免疫调节等多种药理活性。近年来对其治疗恶性肿瘤的研究日益引起人们的关注。研究表明，苦参碱对多种肿瘤细胞(如白血病细胞、人神经母细胞瘤、肺腺癌细胞、膀胱癌细胞等)均有明显的杀伤作用[14-19]。其抗肿瘤作用机制主要有抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞分化、凋亡，抑制肿瘤新生血管形成、抗肿瘤细胞黏附与浸润转移，逆转肿瘤细胞多重耐药以及增强化疗药物敏感性等。
本实验结果表明，苦参碱对人皮肤癌A431细胞有明显地生长抑制作用。采用流式细胞仪对细胞周期及凋亡率进行分析，结果表明苦参碱作用人皮肤癌A431细胞后，细胞在G0/G1期的数目增多，在S期的数目减少。提示苦参碱可通过诱导人皮肤癌细胞凋亡并将细胞阻滞在G0/G1期，使细胞不能进入S期进行DNA的合成，最终使瘤细胞的体外增殖受到抑制。
综上所述，苦参碱可能是通过将人皮肤癌细胞周期阻滞在G0/G1期，抑制其增殖；通过诱导人皮肤癌细胞发生凋亡等，发挥其抗皮肤癌作用。
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