王雪梅李晋蜀李晓辉李晓静徐鸣杨炼沈伟李惠李丹（成都市妇女儿童中心医院检验科610091）
【中图分类号】R318.12【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）27-0085-03
【摘要】目的比较流式细胞术及手工制片显微镜观察两种方法测定传单患儿异型淋巴细胞有无差异，同时探讨传单患儿T细胞亚群的变化及异型淋巴细胞表面抗原表达的变化。方法通过用流式细胞术及手工制片显微镜观察两种方法测定2009-2010年间36例传染性单核细胞增多症(IM)及40例对照组患儿异型淋巴细胞的百分比，用流式细胞仪对两组患儿T细胞亚群免疫测定、异型淋巴细胞免疫表型测定，然后对测定结果进行比较分析。结果两种方法在测定异型淋巴百分比上没有显著差异，传单患儿T淋巴细胞亚群与对照相比CD3.CD8增高，CD4降低，CD4/CD8比值降低；传单患儿异型淋巴细胞与对照组相比CD28表达增加。结论流式细胞术检测传单患儿异型淋巴细胞百分比较形态学快速、准确、易标准化，同时还能分析异型淋巴细胞的表型。
【关键词】传染性单核细胞增多症异型淋巴细胞免疫表型
传染性单核细胞增多症传染性单核细胞增多症（IM）是由EB病毒（EBV）感染引起的疾病，是儿童期常见、多发的疾病。EBV引起T细胞的强烈反应,形成周围血中可见到的异型淋巴细胞,也就是活化的抑制性T细胞[1]。我们采用流式细胞术及传统的手工制片光学显微镜对患儿外周血异型淋巴细胞进行测定，对结果进行比较分析，提出运用流式细胞术进行异型淋巴细胞测定的优越性及快速、准确性，同时分析传单患儿T细胞亚群的变化及传单患儿异型淋巴细胞表面抗原表达的改变。
1资料与方法
1.1一般资料共76例，其中实验组选择2009年6月-2010年7月，在我院血液科内科住院病例36例，纳入标准：年龄4岁-15岁，严格按照诊断标准临床诊断为IM患儿；对照组40例，为门诊及部分住院患儿，门诊20例包括体检，上感患儿，住院20例为肺炎及上感患儿，年龄4岁-15岁。
1.2实验方法对实验组入院治疗前及出院时分别进行静脉采取外周血，肝素抗凝，用流式细胞术进行T细胞亚群分析，同时在流式细胞图上测出异型淋巴细胞百分比；同时采末梢血制造血片由有经验主管检验技师进行手工分类计数异型淋巴细胞百分比。对对照组同样进行上述处理。
1.3统计学方法使用t检验比较传单患儿入出院时两种方法测定异型淋巴细胞百分比差异（组内自身比较），比较两组T细胞亚群表达的差异，检验水准设为0.05。
2结果
2.11IM患儿入出院时两种测定方法测得的异型淋巴细胞百分比比较（%）
表1
由表1可以看出入出院时两种方法测得异型淋巴细胞百分比无差异。
2.2IM患儿两种测定方法测得的异型淋巴细胞入出院时百分比比较（%）
表2
由表2可以看出传单患儿入院与出院时候异型淋巴细胞百分比存在较大差异。
表3传单患儿与对照组两种方法测定异型淋巴细胞百分比比较（%）
表3
由表3可以看出传单患儿与对照组相比异型淋巴细胞百分比存在较大差异。
2.4两组T细胞亚群表达百分比比较(%)
表4
由表4可以看出传单患儿与对照组相比T细胞亚群CD3，CD8表达增高，CD4表达减低，CD4/CD8比值减低。
2.5传单患儿异型淋巴细胞与对照组CD28表达百分比比较(%)
表5
由此表可以看出传单患儿异型淋巴细胞CD28表达增高。
3讨论
传染性单核细胞增多症传染性单核细胞增多症（IM）是由EB病毒（EBV）感染引起的疾病.IM的病理改变是淋巴组织的良性增生,肝、脾、心肌、肾、肾上腺、肺及中枢神经均可受累,表现为异常的淋巴细胞浸润[6]。儿童对EBV易感，感染后可导致多种血液系统疾病，并与多种肿瘤的发生、发展有关，如儿童急性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤等。对于儿童身体健康危害极大。有研究认为：外周血变异淋巴细胞多数是细胞毒性T淋巴细胞,受EBV感染性后，机体T淋巴细胞产生抗感染的B细胞的免疫反应是各种临床症状产生的基础[3-5]。因此，观察变异淋巴细胞的变化，对于IM疾病演变和转归都有临床意义。目前IM的诊断主要依靠临床症状与体征的综合判断，结合实验室诊断指标确定诊断。外周血象中出现异型淋巴细胞增高是一关键指标。而临床上异型淋巴细胞检测都是通过制备血涂片、染色，显微镜下观察得出其百分比。不同的检验者对异型淋巴细胞的判断不同，形态学的识别存在很大主观差异，尚未用客观定量的方法加以检测。我们研究通过流式细胞术测定异型淋巴细胞表型及其变化规律，作为判断异型淋巴细胞的标准，则可以弥补形态学上的不足，同时简化实验操作，使异型淋巴细胞的识别实现标准化操作。
流式细胞术是一项快速对单个细胞进行定量分析的新技术，利用激光及单克隆抗体，可从同一个细胞中同时测得细胞大小、细胞内部结构及细胞表面分子CD表达等多种参数。成熟淋巴细胞的形态特点是体积小，胞质颗粒少；而异型淋巴细胞由于受病毒等的刺激，在形态学上表现为体积大，胞质丰富而颗粒少，二者在流式细胞术的二维散点图上表现应不同。利用流式细胞术的这一特性，可以为区分异型淋巴细胞提供一个较为客观的指标.
查阅了相关国外文献,目前，国外文献资料没有明确的异型淋巴细胞的免疫标记，而是侧重于CD3,CD4,CD8及相关标记变化规律的研究[8-10]。有针对EBV病毒感染后淋巴细胞活化后单一表面抗原的表达增加的相关文献。该文献是针对整个淋巴细胞群作为研究对象的。主要探究淋巴细胞活化后表面抗原的表达情况。目前在国外文献上尚未发现异型淋巴细胞特有的免疫标记物。国内相关文献胜少，多与国外趋势相同，即侧重淋巴细胞表面标记物变化规律的研究。国内的文献中多以整个淋巴细胞群为研究对象，对其表面抗原的量的变化进行观察分析。仅有一篇文献题为《传染性单核细胞增多症异型淋巴细胞的免疫表型研究》。仔细研读该文献，该文献作者把圈定的异型淋巴细胞群作为研究对象，在对其表面抗原的变化进行分析研究[2]。作者在选定异型淋巴群时存在一问题，因为作者只是运用了异型淋巴细胞体积增大这一特点，在流式细胞仪的散点图上在正常细胞群的右侧，单核细胞群也存在这一区域。因此，作者所选定的分析对象除了变异淋巴细胞外，还有部分单核细胞。鉴于此，做了本试验，希望通过此试验建立起运用流式细胞术识别异型淋巴细胞的方法，成为临床IM诊断的一种新的实验方法。异型淋巴细胞具有胞体增大颗粒不增多的特点在FFS和SSC的散点图上分布靠右，部分会与单核细胞群发生重叠，用CD14可把单核细胞排除在外如图2。
图1图中选中部分为T淋巴细胞群
图2R2区为排除了单核细胞群的T淋巴细胞群
图3选中区域为传单患儿异型淋巴细胞与单核细胞混合群
图4左上角为排除了单核细胞的异型淋巴细胞群
图5右上角异型淋巴细胞群高表达CD28和CD8
通过本次实验可得出以下结论1.流式细胞术与手工显微镜记数在传单患儿异型淋巴细胞百分比检测结果无显著性差异,用流式细胞术还可加速实验时间,更方便,准确,客观,不会因为检验员的更换及熟练程度影响结果,而且更易标准化。2.传单患儿T细胞亚群会出现明显改变,CD3,CD8表达增加,CD4表达降低,CD4/CD8比值降低3.传单患儿异型淋巴细胞CD28,CD8高表达。由此可以看出用流式细胞检测传单患儿异型淋巴细胞不仅可以快速准确确定其百分比，还可以看其抗原表达量的变化，及T细胞活化程度，为临床及时做出相应的诊疗提供了帮助，是实用的好方法。
参考文献
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