戴芸[1]2004年在《青霉D-1菌株壳聚糖酶的酶学性质及基因片段的克隆》文中提出从自然界中筛选获得一株高产壳聚糖酶的D-1菌株，经鉴定属于青霉属(Penicillium)，是目前所见报道中唯一能够产两种壳聚糖酶的青霉。通过研究，确定了Penicillium sp．D-1产酶的最适发酵条件：培养温度32℃，底物壳聚糖浓度2.5％，装量为500ml叁角瓶装100ml培养基，培养基pH5.0。在上述培养条件下，第108h时摇瓶中发酵液的最高酶活力达4.696U／ml。Penicillium sp．D-1能产生诱导型的胞外壳聚糖酶。采用(NH_4)_2SO_4盐析法和凝胶过滤层析对Penicillium sp．D-1的壳聚糖酶进行分离提纯，得到两种壳聚糖酶(酶A和酶B)，酶A经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，结果显示该酶的分子量约为93 kD；酶B经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native PAGE)和SDS-PAGE分析，得出分子量约为21 kD。两种壳聚糖酶最适反应pH值均为pH4.0，在pH 3.0—5.0的酸性环境中保持稳定。酶A和酶B的最适反应温度分别为52℃和48℃；酶A在52℃保温60min，酶活为80％，酶B在40℃以上易失活。酶A的活性能够被Mn~(2+)激活，酶B的活性则能够被Ca~(2+)激活，Cu~(2+)，Fe~(3+)和Ag~+则对两种酶的活性都有抑制作用。酶A的米氏常数K_m及最大反应速度V_(max)分别为7.35 mg／ml、0.206 μmol／min·mg，酶B的米氏常数K_m及最大反应速度V_(max)分别是30.42 mg／ml、0.376μmol／min·mg。通过PCR反应扩增出一段长度为270bp的壳聚糖酶基因片段；与NCBI数据库中已知的真菌壳聚糖酶氨基酸序列进行序列比对，结果显示它们彼此之间的同源性比较高。
王彪[2]2013年在《海洋微生物产壳聚糖酶基因的克隆和表达载体构建》文中研究指明壳聚糖酶(Chitosanase EC 3.2.1.132)能催化壳聚糖中糖苷键的水解生成壳寡糖,壳寡糖被广泛应用在医药、保健品、食品、生物控制剂等方面,利用基因工程构建高产壳聚糖酶的工程菌对相关工业具有深远的意义。本实验从大连周边海域的海泥中筛选出两株壳聚糖酶产生菌,通过对其进行分子生物学鉴定,从中克隆壳聚糖酶基因,构建了其大肠杆菌表达载体,为其高效表达奠定了基础。主要结论包括：1.从大连周边海域的海泥中筛选出两株壳聚糖酶产生菌,16S rDNA比对确定一株细菌为芽孢杆菌属,且与炭疽杆菌亲缘关系较近。2.设计一对特异引物,从炭疽杆菌W-2 (Bacillus authracis strain W-2)的基因组中克隆得到了一段约500bp的片段,将该片段与pMD20-T载体连接后转化至大肠杆菌DH5a中,经对重组质粒进行鉴定及测序,该片段为一486bp的壳聚糖酶基因片段chiW。并与NCBI上已发布的芽孢杆菌属壳聚糖酶编码区序列进行比对分析。结果表明,该片段与来自糖苷水解酶46家族中的Bacillus subtilis和Bacillus sp. KFB-CO4的壳聚糖酶编码区序列一致性分别为41.75%和45.93%；与糖苷水解酶8家族中的Bacillus sp.No.S-1的壳聚糖酶编码区序列一致性为52.91%。因而初步推断该片段为类似壳聚糖酶基因片段。将chiW克隆到pET28a载体中,构建重组表达质粒,转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导其表达。利用SDS-PAGE电泳分析表达的蛋白质的分子量约为66.4KD与43.3KD之间的表达蛋白。3.对chiW的生物信息学分析表明,其拟表达蛋白质的分子式为C809H1181N201O209S13,分子量计算值为17,483.2Da,理论等电点为8.63,其N-末端为Met是疏水性稳定蛋白,α-螺旋占21.48%、p-折迭占38.93%、无规则卷曲占39.06%
参考文献：
[1]. 青霉D-1菌株壳聚糖酶的酶学性质及基因片段的克隆[D]. 戴芸. 浙江大学. 2004
[2]. 海洋微生物产壳聚糖酶基因的克隆和表达载体构建[D]. 王彪. 大连工业大学. 2013
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