导读:本文包含了转录抑制活性论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:细胞,转录,抗体,噬菌体,腺苷,姜黄,心绞痛。
转录抑制活性论文文献综述
丁笑[1]（2019）在《库页红景天化学成分及其抑制HIF-1α转录活性研究》一文中研究指出在此项研究中,使用正、反相硅胶柱色谱、大孔吸附树脂、Sephadex LH-20凝胶柱和半制备高效液相等技术对库页红景天根茎的乙酸乙酯和正丁醇萃取部位 进 行 分 离 纯 化,共 得 到 22 种 化 合 物。利用核磁共振波谱、质谱等方法对所得化合物进行结构解析,结果分别鉴定为苏丹叁(1)、叁十五烷(2)、十一烷(3)、邻苯二甲酸二丁酯(4)、2,6-二甲氧基-4-羟基苯乙酮(5)、2,4-二羟基-6-甲氧基苯乙酮(6)、大黄素(7)、2(R)-26-[(2E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1-oxo-2-propen-1-yl]oxy]-2,3-dihydr oxypropyl ester(8)、没食子酸甲酯(9)、酪醇(10)、咖啡酸(11)、没食子酸(12)、β-熊果苷(13)、2-甲氧基对苯二酚(14)、山奈酚(15)、对羟基苯甲酸(16)、原儿茶酸(17)、4,6-二羟基-2-O-0β-D-吡喃葡萄糖苷)-苯乙酮(18)、2,6-二甲氧基-4-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)-苯乙酮(19)、芦丁(20)、3'-甲氧基木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(21)、木犀草苷(22)。其中,化合物1?3、5?9、14、18、19、21、22为首次从该植物中分离得到。在该实验中,利用荧光素酶报告基因法来检测22种化合物对HeP3B细胞中HIF-1α转录活性的抑制作用,同时用MTT法检测了所有化合物的细胞毒性。荧光素酶报告基因法和MTT测定的结果显示化合物6、12、15、17、18具有抑制HIF-1α转录活性的作用,并且在相应的作用浓度下无明显的细胞毒性。其中化合物12、15、18随着给药浓度的增加,HIF-1a转录活性呈现依次降低的趋势。(本文来源于《延边大学》期刊2019-05-30）
许慧[2]（2019）在《c-Myc转录抑制活性在白血病发生发展中的作用》一文中研究指出c-Myc是一种经典的原癌蛋白,它主要参与调控细胞的增殖、分化、凋亡、生存和粘附以及细胞大小等多种重要的细胞生物学功能。大量研究表明,c-Myc是大多数白血病融合基因的共同靶基因,在大多数患者的白血病细胞中高表达,对白血病的发生发展必不可少。c-Myc蛋白主要通过转录激活作用和转录抑制作用参与调节造血干/祖细胞的自我更新,增殖和分化。研究表明,c-Myc的转录活化作用主要通过促进细胞周期,刺激细胞生长和代谢,在组织修复重建和肿瘤的发生发展中起到关键性作用。c-Myc的转录抑制作用主要通过与Miz1结合调控下游靶基因,而对于它的的生物学意义所知甚少。研究发现,c-Myc蛋白的第394位氨基酸突变即c-Myc ~(V394D)(缬氨酸突变为天冬氨酸),由于不能与Miz1结合,其转录抑制活性失活,但转录活化功能仍然正常。因此,c-Myc ~(V394D)这种突变型为我们特异性研究c-Myc转录抑制功能在白血病发生发展中的生物学效应提供有效的实验工具。在本课题中,我们利用逆转录病毒感染造血干/祖细胞,构建了MSCV-c-Myc-GFP和MSCV-c-Myc ~(V394D)-GFP过表达的细胞系,通过体内和体外一系列实验,研究了c-Myc转录抑制活性在白血病发生发展中的作用。首先,我们通过尾静脉移植的方法,构建c-Myc和c-Myc ~(V394D)过表达的动物模型,观察它们的生存情况,分析外周血细胞变化和细胞浸润等,研究了c-Myc和c-Myc ~(V394D)过表达在白血病发生发展中的作用。另外,在体外培养条件下,我们通过细胞克隆形成实验,探究了c-Myc和c-Myc ~(V394D)过表达对造血干/祖细胞增殖能力的影响;并使用流式细胞仪分析c-Myc和c-Myc ~(V394D)过表达对造血干/祖细胞的周期、凋亡和分化的影响;同时利用qRT-PCR技术检测了c-Myc和c-Myc ~(V394D)对下游靶基因的转录调控作用,探究了c-Myc转录抑制活性在白血病发生发展中的分子调控机制。体内实验结果表明,c-Myc过表达能够诱导急性粒细胞白血病的发生发展,而c-Myc ~(V394D)过表达不能诱导小鼠发生白血病。c-Myc过表达的小鼠在第2个月开始发病,直至第4个月全部死亡;而c-Myc ~(V394D)过表达和对照组的小鼠能够正常存活。同时c-Myc过表达的小鼠与对照组相比,GFP~+细胞的比例明显增加,白细胞和血小板数量减少,粒细胞数量异常增加,肝脏和脾脏肿大,白血病细胞浸润,证明c-Myc过表达促进白血病的发生发展。体外实验结果表明,c-Myc过表达能够使造血干/祖细胞的增殖能力增强,向粒细胞分化的能力出现障碍,从而使细胞能够持续增殖;而c-Myc ~(V394D)不能维持造血干/祖细胞的持续增殖能力。细胞克隆形成实验发现,c-Myc和c-Myc ~(V394D)过表达的造血干/祖细胞克隆形成能力明显增强;从第二代克隆形成开始,c-Myc过表达的造血干/祖细胞的克隆形成能力明显高于c-Myc ~(V394D)过表达组和对照组,直至第四代克隆形成中对照组和c-Myc ~(V394D)过表达的造血干/祖细胞几乎丧失克隆形成能力。流式分析细胞凋亡发现,c-Myc和c-Myc ~(V394D)过表达对细胞凋亡没有明显的影响。然而,在细胞周期进程和细胞分化的研究中发现,c-Myc过表达能够诱导细胞从G1期进入S/G2期,促进细胞周期进程,使细胞维持表达c-Kit抗原,向粒细胞分化的途径障碍;c-Myc ~(V394D)过表达不能促进细胞周期进程,增殖和分化功能正常。另外,研究发现,c-Myc过表达抑制C/EBPα的表达,而c-Myc ~(V394D)过表达能够上调C/EBPα的表达,并且两者均能抑制p15和p21的表达。因此,c-Myc的转录抑制活性主要通过促进细胞周期进程,刺激造血干/祖细胞的持续增殖能力,粒细胞分化功能障碍,从而诱导急性粒细胞白血病的发生发展。(本文来源于《上海师范大学》期刊2019-05-01）
宋瑜婷[3]（2019）在《抑制MD2或HSP90对受雷公藤红素调控的若干转录因子活性的影响》一文中研究指出目的雷公藤红素是中药雷公藤的重要生物活性成分,发挥着多种药理作用,在临床上具有广阔的应用前景。明确雷公藤红素作用机制,是其临床转化的基础。目前已发现雷公藤红素作用具有多分子靶点特性,但其如何影响这些靶点存在两种观点:一是雷公藤红素作用于少数共同上游靶点,继而影响多个下游靶点;二是无共同上游靶点,雷公藤红素直接作用于所有靶点。本项目通过检验雷公藤红素影响4种转录因子是否存在共同上游靶点,探索上述观点一是否合理。项目中所涉及的4种转录因子分别为:NF-κB、HSF-1(及受其调控的HSP70)、Nrf2(及受其调控的HO-1)和HIF-1,因为这4种因子前人研究较多,且它们基本能解释雷公藤红素的各种药理作用。本项目所研究的上游靶分子为MD2和HSP90,因为已有研究证明雷公藤红素能结合这两种分子,且其他研究提示这两种分子可能调节前述4种转录因子。本研究旨在进一步揭示雷公藤红素发挥治疗作用的分子机制,为下一步研究提供基础。方法本课题用HepG2细胞作为研究模型,首先筛选雷公藤红素对该细胞的安全有效剂量;其次,研究雷公藤红素对HepG2细胞NF-κB、HSF-1(及所调控的HSP70)、Nrf2(及所调控的HO-1)和HIF-1的影响;再次,使用NF-κB抑制剂PDTC或直接下调MD2表达,检测其对上述4种转录因子的影响,并与雷公藤红素作用相比较;最后,进一步探索使用HSP90抑制剂17-AAG或直接干扰HSP90表达,观察对上述4种转录因子的影响。结果雷公藤红素对HepG2细胞的半抑制浓度(IC_(50))为3.32μM。雷公藤红素能抑制NF-κB磷酸化,并诱导HSF-1(HSP70)、HO-1和HIF-1表达,且存在时间剂量依赖效应。使用PDTC对NF-κB、HSF-1(HSP70)和HO-1的影响,与雷公藤红素相同,但HIF-1变化与使用雷公藤红素不同;下调MD2后,只有NF-κB变化与雷公藤红素作用一致,说明MD2不是其调控上述4种转录因子的共同上游靶点。而使用17-AAG对NF-κB和HSF-1(HSP70)的影响,与雷公藤红素相同;下调HSP90后,只有NF-κB变化与雷公藤红素作用一致,说明HSP90也不是其调控上述4种转录因子的共同上游靶点。此外,我们还发现抑制NF-κB和抑制HSP90可能存在正反馈关系,具体机制尚不清楚。结论本课题再次证实了雷公藤红素能调控NF-κB、HSF-1(及所调控的HSP70)、Nrf2(及所调控的HO-1)和HIF-1表达,但MD2和HSP90均不是雷公藤红素发挥这些作用的共同上游靶点。本项目支持雷公藤红素药理作用是通过多靶点、多通路实现的,但不支持存在一个共同上游靶点。因此,对雷公藤红素调控这4种转录因子靶点的机制应该分别研究。此外,雷公藤红素两个主要作用,即抑制NF-κB和抑制HSP90之间可能存在正反馈关系,具体机制需要进一步研究。(本文来源于《宁夏医科大学》期刊2019-03-01）
李鹏,胡强,张颖,王娟,徐洁[4]（2019）在《miR-19b通过抑制STAT3的转录活性抑制不稳定斑块形成》一文中研究指出目的探讨miR-19b对不稳定斑块的影响及潜在机制。方法回顾性选取2015年3月至2016年3月新疆医科大学第五附属医院收治的80例不稳定型心绞痛(UA)患者为UA组,同期收集80例健康体检者为对照组。检测和比较两组研究对象血miR-19b的表达。将miR-19b模拟物或抑制物转染到人脐静脉细胞融合细胞EA. hy926;采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法、微管形成实验检测过表达miR-19b对细胞增殖、迁移、血管新生的影响;蛋白印迹检测过表达miR-19b对信号转导子和转录激活子3(STAT3)表达的影响。结果 UA组miR-19b水平(1. 24±0. 36)△△CT显着高于对照组(0. 50±0. 12)△△CT(P <0. 05);过表达miR-19b后,EA. hy926细胞抑制率升高,愈合率、微管形成均显着下降(P <0. 05);蛋白印迹表明过表达miR-19b抑制STAT3的活性。结论过表达miR-19b可影响STAT3的转录活性,抑制内皮细胞增殖、迁移和血管新生,进而延缓不稳定型心绞痛患者不稳定斑块进展。(本文来源于《临床和实验医学杂志》期刊2019年02期）
潘翔[5]（2018）在《GRHL2通过调节RhoG的转录活性抑制非小细胞肺癌的迁移》一文中研究指出背景及目的:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,对人类的生命安全造成了极大的威胁。肺癌包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌,而其中非小细胞肺癌占据了肺癌的80%-85%,所以寻找新型的非小细胞肺癌靶点刻不容缓。转录因子GRHL2是GRHL基因家族中的成员之一,现已知与各类生物学过程有关,例如:损伤修复,上皮的完整性和上皮间质转换等;然而,GRHL2在肿瘤中的具体机制还不清楚,并且在不同的肿瘤中发挥不同的作用,甚至作用相反。方法:在肺癌组织及癌旁组织标本中、正常人支气管上皮细胞及肺癌细胞系运用Western Blotting、real-time PCR、IHC技术,分析其中GRHL2的蛋白及mRNA表达水平;通过转染GRHL2治理构建过表达及干扰稳定细胞株,运用Western Blotting技术验证其表达水平;采用细胞生长、克隆集落形成Transwell、Wound Healing实验,检测GRHL2过表达和干扰后,细胞生长、转移能力是否发生变化;生物信息学分析,检测其可能调控的靶向基因位点,运用Western Blotting验证靶点基因及通路相关基因的蛋白表达水平是否随GRHL2过表达和干扰而发生变化;使用双荧光素酶报告实验检测GRHL2对RhoG的调控作用。结果:在肺癌细胞和组织中,GRHL2的表达水平显着高于正常人支气管上皮细胞和癌旁组织;细胞生长实验和克隆集落形成实验显示敲低GRHL2可以抑制肺癌细胞的生长;Transwell、Wound Healing实验显示敲低GRHL2具有促进肺癌细胞侵袭和转移的能力;GRHL2可能通过靶向结合下游基因RhoG从而抑制非小细胞肺癌细胞的转移。结论:GRHL2在非小细胞肺癌及组织中高表达,并通过调节RhoG的转录活性而抑制肿瘤细胞的转移。(本文来源于《南昌大学》期刊2018-06-01）
山翀[6]（2018）在《抑制YAP-TEAD转录活性的抗肝癌药物筛选模型建立及化合物筛选》一文中研究指出肝癌一种是常见的恶性肿瘤,致死率高。因而,急需寻找新靶点,进行创新药物的开发。癌症的发生发病与人体细胞内多个信号通路的异常密切相关。而Hippo信号通路在个体发育,器官生长中发挥重要作用,尤其与肝癌的发生有着密切联系。该通路通过上游信号级联系统调控YAP蛋白不同位点的磷酸化过程,调控YAP蛋白进入细胞核,然后与TEAD等转录因子结合,进而激活受其调控的基因。其中Hippo通路下游转录因子中的CTGF的过表达会明显引发器官的过度生长,引发癌症。因此,CTGF的表达水平可以反映YAP/TEAD的转录活性。于是我们首先,构建靶向YAP/TEAD转录活性的高通量筛选模型,并进行化合物的筛选。将CTGF基因的启动子区域插进pGL4.17[Luc2/Neo]的多克隆位点,构建pCTGF-Luc质粒。将该质粒转染进HepG2细胞后,通过G418筛选可以稳定表达萤火虫荧光素酶的细胞株,构建稳转细胞系。并对750个不同来源的植物提取物以及海洋菌群次生代谢产物进行了筛选,并从中筛选出了有明显抑制作用的化合物C2071和N60以及具有明显促进作用的化合物C10,为后续开展功能实验奠定了基础。其次,筛选化合物的功能实验。在所筛选出的化合物中,化合物C10可以提高荧光值,即可促进CTGF表达,虽然不能作为抗癌症药物,但可以作为潜在的促进组织再生的药物先导物;而化合物C2071,N60可以明显减低荧光值,可降低CTGF的表达。再通过WB找出最适合的肝癌细胞系。之后对这些化合物检测了其抗癌症细胞增殖,迁移,侵袭的能力,初步证明了化合物对Hippo通路异常活化的肝癌细胞具有选择性细胞毒性,而对正常细胞没有明显细胞毒性。最后,化合物的抗肿瘤作用机制研究。通过WB,qPCR确定了化合物可以抑制Hippo通路下游重要的转录因子CTGF表达,流式细胞仪进一步检测了其对细胞凋亡和细胞周期的影响。推测化合物可以通过作用于Hippo通路来产生抗癌的效果。(本文来源于《厦门大学》期刊2018-04-01）
陈洁,刘一然[7]（2017）在《姜黄素通过减少CREB转录活性抑制前脂肪细胞分化》一文中研究指出目的探讨姜黄素对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响及其作用机制。方法选取3T3-L1前脂肪细胞为研究对象,姜黄素(10、20、40μmol·L~(-1))处理3T3-L1前脂肪细胞并同步诱导细胞分化,采用MTT法检测3T3-L1前脂肪细胞增殖情况,油红O染色方法检测胞质脂质堆积情况,实时荧光定量PCR法及蛋白印迹法检测3T3-L1脂肪细胞环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)、CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)、过氧化物体增殖剂活化受体γ(PPARγ)的mRNA及蛋白表达水平。结果 MTT结果显示,姜黄素对3T3-L1前脂肪细胞增殖具有明显抑制作用,且呈现一定剂量、时间依赖性;油红O染色显示,姜黄素可抑制3T3-L1前脂肪细胞分化,且呈现一定剂量依赖性;0、20、40μmol·L-1姜黄素处理3T3-L1前脂肪细胞,p-CREB、C/EBPβ、C/EBPα、PPARγmRNA水平及蛋白水平随姜黄素剂量升高均呈现明显下降趋势(P<0.05)。结论姜黄素可有效抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖分化,其机制可能为姜黄素抑制CREB转录活性,从而抑制C/EBPβ、C/EBPα、PPARγ表达。(本文来源于《中国药理学通报》期刊2017年11期）
胡耀中[8]（2017）在《HIF-1α特异性胞内抗体的筛选及肿瘤细胞内转录抑制活性的研究》一文中研究指出肿瘤的诊断和靶向治疗是临床研究所面临的严峻挑战,单克隆抗体的发现和研究为肿瘤的诊断和靶向治疗提供了新的治疗手段。对于肿瘤治疗,单抗药物具有明确的靶向性,具有起效快、疗效好、副作用小等优点。能克服化疗药物不能有效区分正常细胞和肿瘤细胞、副作用大等缺点。但传统单克隆抗体因其分子量较大,肿瘤组织与血管的渗透与转运受到阻碍,无法作为胞内抗体,或与肿瘤细胞内靶标特异性结合而发挥抗肿瘤作用。此外,因单克隆抗体存在较强的免疫原性,使其在临床应用受到一定程度的限制,这也促进了小型化抗体的研究与发展。新型基因工程抗体,如嵌合抗体、人源化抗体和单域抗体,因其在稳定性、表达产量和抗体亲和力方面的天然缺陷而阻碍了临床的进一步应用。纳米抗体(Nanobodies,Nbs)来源于天然存在于骆驼科动物体内的重链抗体,是目前可以得到的具有完整抗原结合功能的最小抗体分子片段。作为一种小分子抗体片段,纳米抗体具有诸多优点,如较高的组织穿透性,较高的亲和力和水溶性,以及较高的特异性和亲和力。另外由于其小分子特性,使其保持较低的免疫原性,并且易于表达和纯化。因其特殊的物理学和生物学特性,纳米抗体被广泛的应用于肿瘤的诊断与治疗相关的研究。然而,纳米抗体在肿瘤诊断与治疗领域的的研究主要集中于肿瘤胞外靶标,如细胞因子,信号受体以及跨膜蛋白胞外结构域。然而,与肿瘤生长和细胞增殖相关的信号通路与信号传导机制主要发生在细胞内,针对肿瘤胞内抗原的抗体能够更有效的干扰与抑制肿瘤细胞生长与增殖相关的信号通路,从而达到抑制肿瘤生长的目的。此外,针对肿瘤胞内抗原的纳米抗体的开发,也能应用于肿瘤细胞内信号通路的研究从而有助于发现肿瘤发生与生长相关的信号通路和信号因子。因此,肿瘤胞内靶标的研究以及肿瘤胞内抗体的开发对于理解肿瘤的发展和诊断治疗有重要的意义。因肿瘤细胞的快速增殖会消耗大量的氧气,以及肿瘤对周围组织血管的浸润和破坏,从而导致肿瘤细胞中的普遍存在的缺氧状态。肿瘤组织中的乏氧可导致肿瘤细胞侵袭性增强,同时可诱导肿瘤对化放疗产生抗拒。肿瘤细胞的供血、供氧越好,代谢越旺盛,对放射线越敏感;反之,供血、供氧差的细胞对放射线的敏感性较差。肿瘤细胞缺氧会导致乏氧诱导因子-1(HIF-1)的表达水平显着高于正常组织,是肿瘤细胞中一系列基因改变的关键调控因子,起着中枢纽带作用。HIF-1是由氧浓度依赖性调节的HIF-1α亚基和组成性表达的HIF-1β亚基构成的异源二聚体。HIF-1α和β亚基都具有bHLH(basic helix-loop-helix)和PAS(Per-ARNT-Sim)结构,属于bHLH-PAS蛋白超家族。PAS蛋白结构域包括A、B两个亚结构域,是其形成异源二聚体并与DNA结合所必需的结构,是HIF-1发挥转录活性的关键结构域。PAS结构域的删除,甚至在二级结构域的数个氨基酸的突变会导致HIF-1转录活性的显着降低。HIF-1的转录活性主要取决于HIF-1α亚基的表达水平及其活性。在常氧条件下,细胞内HIF-1α极不稳定(半衰期<5 min),在脯氨酰羟化酶(prolyl hydroxylase,PHDs)的作用下,HIF-1αODD区的第402位、第564位的脯氨酸残基被羟基化后可与肿瘤抑制因子(von hippel-lindau,VHL)结合,在肿瘤抑制蛋白(pVHL)协同作用下,经泛素化蛋白酶途径而发生降解。在乏氧条件下,HIF-1α因不能被正常羟基化而不能与pVHL结合而发生降解,使细胞内HIF-1α水平显著增加。HIF-1α与β亚基的二聚化形成具有转录活性的HIF-1因子,从而促进靶向基因的转录激活。迄今为止已经发现的HIF-1相关的靶向基因超过100多种,这些基因的启动子或增强子内含有一个或多个具有5’-TACGTG-3’核苷酸序列的缺氧反应元件(hypoxia response elements,HREs),HIF-1通过与HREs的结合而启动下游靶向基因的转录作用。这些基因表达后参与,如红细胞生成,血管形成,核苷、氨基酸、糖的能量代谢,细胞存活、凋亡和活动以及药物抵抗等生物学效应,以维持组织、细胞在缺氧条件下内环境稳定,以适应缺氧。同时HIF-1及其诱导表达的基因还在生理性缺氧如干细胞微环境、胎盘发育、胚胎发育过程中组织细胞分化,以及多种病理情况如肿瘤的发展、转移中发挥着重要作用。低氧状态下,肿瘤细胞对化疗药物的耐药指数是常氧状态下的数倍,HIF-1的转录活性与多种耐药性相关的蛋白的表达相关,从而降低传统治疗手段的抗肿瘤作用。HIF-1的活性与血管生成相关,也造成肿瘤的发生及恶化。当细胞乏氧时,HIF-1能够促进血管内皮生长因子(VEGF)的转录并增加VEGF mRNA的稳定性,从而增加VEGF的表达。高浓度的VEGF可通过PI3K、MAPK、Ras、PLC等信号传导途径促进肿瘤血管内皮细胞生长,使肿瘤血管生成增加,促进肿瘤细胞的生长和增殖。HIF-1靶基因编码的蛋白中包含诸多与糖酵解及葡萄糖代谢相关的酶,肿瘤细胞处于乏氧条件下,HIF-1可以转录激活与糖酵解作用相关的代谢酶,增加肿瘤细胞摄取及利用葡萄糖代谢的能力,保证了肿瘤细胞生长的能量需求。肿瘤的侵袭和转移与多种酶类和细胞因子的表达及活性有关。HIF-1α可通过诱导多种蛋白酶及细胞因子,如基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinases,MMP)、尿激酶受体(urokinase receptor),上皮型钙粘素(epithelial cadherin,E-cad)与β-链接素(β-catenin),使细胞与基质间之间、细胞与细胞之间的粘附性降低,导致细胞分离、侵袭及其转移。此外,乏氧条件下肿瘤的侵袭转移还与肿瘤细胞趋化因子受体CXCR4有关。HIF-1α可使CXCR4水平增加,不仅促进肿瘤细胞的转移,而且使其定位于特定器官。通过抑制HIF-1α而达到抑制肿瘤生长的作用机理大体上可以分为阻断相关信号转导通路和抑制HIF-1α的表达活性两类。本课题选择HIF-1α亚基的PAS B结构域蛋白为靶向抗原,旨在通过筛选针对PAS B结构域的特异性纳米抗体,并表达为胞内抗体,以期干扰HIF-1α与β亚基的结合,从而降低胞内HIF-1的水平,从而降低HIF-1相关靶基因的转录水平,以达到抑制HIF-1的转录活性的目的。本研究构建了纳米抗体免疫库,并设计与构建了特异性针对胞内抗原靶标(RNA,蛋白质等)的合成库,通过噬菌体展示技术富集筛选了抗原特异性纳米抗体,并对纳米抗体的物理学和生物学性质进行了评价。首先,表达和纯化了重组PAS B结构蛋白rPasB。基于PAS B蛋白的基因序列,并针对大肠杆菌表达载体的密码子偏好进行了密码子优化,然后进行基因序列的人工合成。之后将人工合成的基因克隆入pET21b载体构建了重组表达载体,并将其转化进入BL21(DE3)大肠杆菌表达细胞进行重组蛋白的表达。通过设立不同诱导时间,不同诱导温度及不同IPTG诱导浓度的实验组确定重组蛋白的最优表达条件。rPasB蛋白在BL21(DE3)胞内表达,通过超声细胞破碎将重组蛋白释放。镍离子金属亲和层析色谱用于从裂解液中纯化rPasB蛋白,尺寸排阻色谱用于去除rPasB中的游离咪唑并去除潜在的杂蛋白。rPasB的纯度与正确表达通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹实验进行确证。圆二色谱用于确认rPasB蛋白的二级结构及其热稳定性。纯化得到的rPasB蛋白用于免疫单峰驼。100μg rPasB蛋白通过静脉注射进入单峰驼体内以产生免疫反应,为引起足够的免疫反应免疫注射进行六周,免疫周期结束后收集血液并提取淋巴细胞。总RNA从淋巴细胞中提取并用作模板进行反转录PCR以获得cDNA,在接下来的PCR中以cDNA为模板,以特定引物进行PCR以获得包含重链抗体单域结构的基因集合。将所得到的基因集合通过酶切连接克隆至pMECS噬菌粒载体以构建纳米抗体表达载体,重组载体通过电转化进入TG1细胞构建了纳米抗体免疫库。本研究基于针对胞内抗原的纳米抗体的序列分析,基于纳米抗体BCII10的读码框结构设计了针对胞内抗原的人工合成库。抗体序列通过特定氨基酸的随机合成来制备纳米抗体基因集合。通过酶切连接进入pMECS噬菌粒载体以构建纳米抗体表达载体,重组载体通过电转化进入TG1细胞构建了纳米抗体合成库。免疫库及人工合成库的容量及多样性通过克隆PCR及序列测定进行了确证。通过随机挑取单克隆进行克隆PCR来确定抗体库中正确插入序列的比例。通过序列测定来分析合成库中特定氨基酸的分布并与设计时确认的比例进行比较来确认抗体库的质量。本研究证实了大容量免疫库与合成库的制备,免疫库及合成库的多样性进行了确认。基于纳米抗体免疫库及合成库的成功构建,以rPasB重组蛋白为抗原进行了特异性纳米抗体的富集筛选。通过四轮富集筛选,获得了针对rPasB蛋白的特异性纳米抗体。经过序列分析和酶联免疫吸附实验,确证了特异性纳米抗体的DNA序列和抗原结合能力。从TG1细胞中提取包含特异性纳米抗体DNA序列的pMECS噬菌粒载体,并转化进入大肠杆菌WK6细胞中用于纳米抗体的表达。特异性纳米抗体在WK6细胞周质空间表达,通过渗透压休克提取包含纳米抗体的提取液。镍离子金属亲和层析色谱用于从提取液中纯化抗体蛋白,尺寸排阻色谱用于去除抗体中的游离咪唑并去除潜在的杂蛋白,纳米抗体的纯度通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹实验进行确证。纯化的纳米抗体与rPasB蛋白的结合通过Western blot和ELISA进行了验证。本研究基于HeLa细胞构建了乏氧诱导模型,对特异性纳米抗体与HeLa细胞内天然HIF-1α蛋白的结合活性进行验证。去铁胺(Deferoxamine,DFO)及氯化钴(CoCl_2)能够在常氧状态下通过不同机理干扰HIF-1α蛋白的氧依赖降解,从而升高细胞内HIF-1α水平。DFO是一种铁离子螯合剂,主要与叁价铁离子络合形成复合物。由于其螯合的特性,无论是游离的或者铁蛋白结合的铁离子均能与之络合,形成铁胺复合物。因此,DFO通过与铁离子络合而影响与HIF-1α蛋白降解相关的脯氨酰羟化酶的活性,从而抑制HIF-1α蛋白在常氧条件下的降解。CoCl_2通过多种机理来抑制HIF-1α蛋白在常氧条件下的降解。首先,CoCl_2能够与HIF-1α蛋白降解相关的脯氨酰羟化酶结合,影响其对HIF-1α蛋白的羟基化而抑制常氧状态下的降解,升高胞内HIF-1α水平;其次,CoCl_2还能够与已经羟基化的HIF-1α蛋白结合,从而干扰羟基化HIF-1α蛋白与pVHL的结合而抑制HIF-1α蛋白的降解。本研究对不同浓度的DFO及CoCl_2的蛋白降解抑制作用进行研究,分别用0.1和0.2 mM的DFO及0.2和0.3 mM的CoCl_2诱导HeLa细胞,收集诱导的细胞并冻融提取裂解液,通过Western blot检测诱导后细胞中HIF-1α蛋白的水平,不同条件下HIF-1α蛋白的水平通过Flow cytometry进行确证,并确定最优的诱导条件为0.3 mM CoCl_2。筛选的特异性纳米抗体与天然HIF-1α蛋白的结合通过免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)及Flow cytometry进行研究。0.3 mM CoCl_2过夜诱导HeLa细胞并通过冻融收集细胞裂解液,特异性纳米抗体与裂解液孵育以俘获裂解液中天然HIF-1α蛋白,Protein A/G包被的琼脂糖凝胶载体与鼠抗-HA标签单抗结合以捕获Nb-HIF-1α复合物,通过Western blot以检测筛选的抗体是否可以特异性的俘获天然HIF-1α蛋白。特异性纳米抗体与HIF-1α蛋白的结合通过Flow cytometry进行了验证,并与IP结果相符。基于成功筛选的能够与天然HIF-1α蛋白结合的特异性纳米抗体,构建了能够稳定表达胞内抗体的HeLa细胞株,并对胞内抗体的表达与结合活性进行研究。基于乏氧诱导模型,通过实时定量PCR对特异性纳米抗体的转录抑制活性进行了研究。在筛选的能够与天然HIF-1α蛋白结合的纳米抗体中选择sNb44及Nb747,基于哺乳动物细胞表达质粒pCI-neo构建了胞内抗体表达载体Ib-sNb44及Ib-Nb747。针对大肠杆菌SlyD蛋白的Nb3用作构建胞内表达载体Ib-IRNb3,并作为阴性对照以研究胞内抗体的转录抑制活性。将构建的胞内表达载体转染进入对数生长期的HeLa细胞,G-418用以筛选能够稳定表达胞内抗体的HeLa细胞株。当稳定生长的细胞汇合度达到60%的时候,收集细胞并扩大培养,以获得足够的细胞。胞内抗体的表达通过Western blot进行验证,稳定生长的HeLa细胞通过冻融提取细胞裂解液,并用鼠抗-His标签单抗检测裂解液中胞内抗体的表达。Ni~(2+)藕合的磁珠用以将裂解液中的胞内抗体纯化,并用纯化的胞内抗体进行IP,以验证胞内抗体对天然HIF-1α蛋白的结合活性。Western blot验证了胞内抗体的成功表达,IP实验证实了胞内抗体的结合活性。本研究对胞内抗体的转录抑制活性进行了研究,胞内抗体的转录抑制活性通过实时定量HIF-1相关的靶向基因的表达水平来进行验证。本课题选择了HIF-1相关的靶基因BNIP3,CA9,GAPDH与PGK1作为目标基因与评价指标,B2M,GUSB与ACTB用作内参基因,设计了qRT-PCR所需引物并对引物质量进行验证。基于乏氧诱导模型,构建了用于评价转录抑制活性的细胞模型。通过0.3 mM CoCl_2诱导胞内抗体表达的HeLa细胞株,提取诱导后细胞总RNA并进行qRT-PCR。对诱导后HIF-1相关的靶基因水平进行了定量研究以确证HIF-1α蛋白水平的升高能显著增加靶基因的转录水平。研究结果表明HIF-1α蛋白的胞内水平能显著影响靶基因的转录水平,并将此模型用以评价胞内抗体的转录抑制活性。HIF-1α蛋白的化学抑制剂CAY10585用作阳性对照,本实验证实CAY10585能显着抑制HIF-1α的转录活性,从而降低乏氧诱导模型中HIF-1靶基因的转录水平。从稳定表达胞内抗体的HeLa细胞提取总RNA,并进行qRT-PCR以定量不同实验组中靶基因的转录水平。本课题实验结果证明胞内抗体Ib-sNb44及Ib-Nb747能不同程度的抑制HIF-1的转录活性。本研究筛选了针对E.coli内源性蛋白的特异性纳米抗体。在rPasB蛋白的纯化过程中,E.coli内源性蛋白作为杂蛋白与rPasB同时纯化出来,并随rPasB蛋白注射进入单峰驼体内产生免疫反应。在后续筛选针对rPasB蛋白的特异性纳米抗体的过程中,筛选得到了针对此E.coli内源性蛋白的纳米抗体。经免疫共沉淀捕获此杂蛋白并用质谱进行了鉴定,鉴定结果显示此杂蛋白为E.coli SlyD蛋白。SlyD蛋白作为潜在的杂蛋白被多次报道,因其氨基酸组成序列中包含近10%的组氨酸,对镍离子亲和柱有很高的亲和力,能够与包含His标签的重组蛋白同时纯化而成为潜在的杂蛋白。尤其当重组蛋白与SlyD蛋白分子量相近时,常用的尺寸排阻色谱将难以去除SlyD蛋白,从而对后续研究产生不利影响。基于筛选得到的针对E.coli SlyD蛋白的特异性纳米抗体Nb5,本课题开发了两套方案用于从rPasB重组蛋白中去除SlyD蛋白。在第一套方案中,基于免疫俘获技术利用Nb5从重组蛋白中捕获并去除E.coli SlyD蛋白,从而制备高纯度重组蛋白。纳米抗体Nb5与重组蛋白孵育以俘获重组蛋白中的SlyD蛋白,从而形成Nb5-SlyD复合物,过量Protein A/G包被的琼脂糖凝胶载体与鼠抗-HA单克隆抗体结合用以捕获重组蛋白中的Nb5-SlyD复合物,沉淀后的上清中即包括纯化的重组蛋白。纯化结果通过SDS-PAGE和Western blot进行验证,结果显示Nb5能够高效去除重组蛋白中的SlyD蛋白从而制备高纯度重组蛋白。在第二套方案中,纳米抗体Nb5进行了生物素标记并去除了C-端His标签,表达了生物素化的Nb5(Bi-Nb5)。过量Bi-Nb5与重组蛋白孵育,以俘获重组蛋白中的SlyD蛋白形成Bi-Nb5::SlyD复合物,显着增加复合物的分子大小。利用尺寸排阻色谱将重组蛋白rPasB与Bi-Nb5::SlyD复合物分离,结果显示rPasB能够与复合物完全分离。分离后的rPasB中含有过量的Bi-Nb5,因Bi-Nb5不含有His标签,可以利用镍离子亲和层析将rPasB纯化。实验结果用SDS-PAGE和Western blot分析,证实Bi-Nb5能够有效用于纯化rPasB中的E.coli SlyD蛋白。在第一套纯化方案中,由于鼠抗-HA单克隆抗体与Protein A/G包被的琼脂糖凝胶载体的成本较高,适用于快速制备小量重组蛋白。相反,第二种方案成本较低,Bi-Nb5能够很容易的制备并大量表达,更适用于大批量制备重组蛋白。另外,Nb5可以表达为二价抗体,从而可以进一步增加复合物的分子大小,有利于分离与E.coli SlyD蛋白分子大小相近的重组蛋白。纳米抗体Nb5可以与固相载体进行共价偶联,从而制备亲和吸附载体用于大批量的重组蛋白制备,如CNBr activated Sepharose or agarose,carboxyl-modified microspheres或latex beads。总而言之,本研究制备了大容量驼源纳米抗体免疫库及针对胞内抗原的合成库,筛选了针对HIF-1α亚基的特异性纳米抗体,并对抗体与HIF-1α蛋白的结合作用进行了研究。构建了特异性纳米抗体的胞内表达载体,并转染进入HeLa细胞,筛选了能够稳定表达胞内抗体的细胞株。胞内抗体的表达及结合活性进行了验证。基于HeLa细胞制备了乏氧诱导模型,并针对HIF-1相关靶基因构建了纳米抗体转录抑制活性的评价模型,并对胞内抗体对HIF-1的转录活性的抑制作用进行了评价。本研究筛选了针对E.coli SlyD蛋白的特异性纳米抗体,并基于纳米抗体Nb5开发了两套方案用于纯化重组蛋白中的E.coli SlyD蛋白。针对E.coli SlyD蛋白的特异性纳米抗体的筛选进一步拓展了纳米抗体在蛋白纯化领域的研究与应用。(本文来源于《天津大学》期刊2017-10-01）
尚丹,李美红,许馨,曹山虎,孙绍光[9]（2016）在《miR-342-3p抑制SM22α启动子的转录活性》一文中研究指出目的探究miR-342-3p是否通过作用于SM22α启动子,从转录水平调控SM22α的表达。方法通过软件RNAhybrid分析发现,大鼠SM22α启动子中存在一个miR-342-3p的识别位点。将miR-342-3p mimics与报告基因载体p GL3-SM22α-Promoter共转染293A细胞,通过检测荧光素酶活性来分析miR-342-3p对SM22α启动子转录活性的影响。将miR-342-3p mimics转染血管平滑肌细胞,采用q RT-PCR和Western blot分别检测SM22αm RNA和蛋白质水平,分析miR-342-3p对血管平滑肌细胞中SM22α表达的影响。结果与miR-control相比,miR-342-3p能够使SM22α启动子转录活性降低(0.54±0.03)倍,差异有统计学意义(P<0.05);与miR-control相比,miR-342-3p能够使血管平滑肌细胞中SM22αm RNA水平降低(0.45±0.04)倍,SM22α蛋白质水平下降(0.41±0.05)倍,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-342-3p通过抑制SM22α启动子活性,从转录水平降低SM22α的表达,为miRNA调控血管平滑肌细胞表型转化研究提供了新角度。(本文来源于《中国医药导报》期刊2016年24期）
左晨[10]（2016）在《PIASy抑制ISGs转录活性的分子机制》一文中研究指出背景干扰素是机体细胞应对病毒及其他生物刺激分泌的一类小分子糖蛋白。其中,I型干扰素可通过激活胞内JAK-STAT通路启动众多ISGs的转录,如MX蛋白、IFIT蛋白等。但当ISGs过度激活时,可能导致机体出现免疫过度,甚至会导致自身免疫性疾病的发生。PIAS蛋白是一类能抑制活化的STATs转录活性的蛋白,从而参与ISGs的负调控过程。此外有研究发现,PIASy还可通过结合HDAC1及HDAC2降低目的基因启动子区域的组蛋白乙酰化修饰,从而抑制Smad和AR基因的转录活性。因此,本课题尝试寻找在ISGs的负调控作用中,PIASy可能互相作用的组蛋白修饰酶,并从表观遗传学角度研究PIASy抑制ISGs转录活性的分子机制。方法通过蛋白质免疫共沉淀技术(Co-IP)和质谱技术,寻找与PIASy相互作用的组蛋白修饰酶,并使用荧光定量PCR(RT-PCR)及染色质免疫共沉淀技术(Ch-IP)研究PIASy对ISGs基因转录及启动子区域组蛋白修饰的影响;通过分子克隆方法构建包含不同结构域的PIASy和RBP2重组质粒,并应用Co-IP技术寻找两者相互结合的结构域;构建稳定表达不同结构域PIASy的细胞,并通过RT-PCR和Ch-IP研究不同结构域对ISGs基因转录及启动子区域组蛋白修饰的影响。结果PIASy可与RBP2相互作用,且在PIASy+/+的MEF细胞中,其MX1、IFIT1启动子区域的组蛋白H3K4me3水平显着低于PIASy-/-细胞,从而抑制其转录活性,转录水平较低;PIASy主要通过其N端的1-218AA的区域与RBP2的JmjC结构域相互结合;与此一致的是,在稳定表达包含有PIASy蛋白1-218AA区域的PIASy-/-细胞中,其MX1启动子区域的组蛋白H3K4me3水平较PIASy-/-细胞明显下调,从而可抑制其转录活性。结论结果表明PIASy可通过其N端1-218AA的区域招募RBP2蛋白,下调ISGs(MX1、IFIT1)启动子区域的组蛋白H3K4me3水平,从而抑制ISGs的转录活性。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2016-05-01）
转录抑制活性论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
c-Myc是一种经典的原癌蛋白,它主要参与调控细胞的增殖、分化、凋亡、生存和粘附以及细胞大小等多种重要的细胞生物学功能。大量研究表明,c-Myc是大多数白血病融合基因的共同靶基因,在大多数患者的白血病细胞中高表达,对白血病的发生发展必不可少。c-Myc蛋白主要通过转录激活作用和转录抑制作用参与调节造血干/祖细胞的自我更新,增殖和分化。研究表明,c-Myc的转录活化作用主要通过促进细胞周期,刺激细胞生长和代谢,在组织修复重建和肿瘤的发生发展中起到关键性作用。c-Myc的转录抑制作用主要通过与Miz1结合调控下游靶基因,而对于它的的生物学意义所知甚少。研究发现,c-Myc蛋白的第394位氨基酸突变即c-Myc ~(V394D)(缬氨酸突变为天冬氨酸),由于不能与Miz1结合,其转录抑制活性失活,但转录活化功能仍然正常。因此,c-Myc ~(V394D)这种突变型为我们特异性研究c-Myc转录抑制功能在白血病发生发展中的生物学效应提供有效的实验工具。在本课题中,我们利用逆转录病毒感染造血干/祖细胞,构建了MSCV-c-Myc-GFP和MSCV-c-Myc ~(V394D)-GFP过表达的细胞系,通过体内和体外一系列实验,研究了c-Myc转录抑制活性在白血病发生发展中的作用。首先,我们通过尾静脉移植的方法,构建c-Myc和c-Myc ~(V394D)过表达的动物模型,观察它们的生存情况,分析外周血细胞变化和细胞浸润等,研究了c-Myc和c-Myc ~(V394D)过表达在白血病发生发展中的作用。另外,在体外培养条件下,我们通过细胞克隆形成实验,探究了c-Myc和c-Myc ~(V394D)过表达对造血干/祖细胞增殖能力的影响;并使用流式细胞仪分析c-Myc和c-Myc ~(V394D)过表达对造血干/祖细胞的周期、凋亡和分化的影响;同时利用qRT-PCR技术检测了c-Myc和c-Myc ~(V394D)对下游靶基因的转录调控作用,探究了c-Myc转录抑制活性在白血病发生发展中的分子调控机制。体内实验结果表明,c-Myc过表达能够诱导急性粒细胞白血病的发生发展,而c-Myc ~(V394D)过表达不能诱导小鼠发生白血病。c-Myc过表达的小鼠在第2个月开始发病,直至第4个月全部死亡;而c-Myc ~(V394D)过表达和对照组的小鼠能够正常存活。同时c-Myc过表达的小鼠与对照组相比,GFP~+细胞的比例明显增加,白细胞和血小板数量减少,粒细胞数量异常增加,肝脏和脾脏肿大,白血病细胞浸润,证明c-Myc过表达促进白血病的发生发展。体外实验结果表明,c-Myc过表达能够使造血干/祖细胞的增殖能力增强,向粒细胞分化的能力出现障碍,从而使细胞能够持续增殖;而c-Myc ~(V394D)不能维持造血干/祖细胞的持续增殖能力。细胞克隆形成实验发现,c-Myc和c-Myc ~(V394D)过表达的造血干/祖细胞克隆形成能力明显增强;从第二代克隆形成开始,c-Myc过表达的造血干/祖细胞的克隆形成能力明显高于c-Myc ~(V394D)过表达组和对照组,直至第四代克隆形成中对照组和c-Myc ~(V394D)过表达的造血干/祖细胞几乎丧失克隆形成能力。流式分析细胞凋亡发现,c-Myc和c-Myc ~(V394D)过表达对细胞凋亡没有明显的影响。然而,在细胞周期进程和细胞分化的研究中发现,c-Myc过表达能够诱导细胞从G1期进入S/G2期,促进细胞周期进程,使细胞维持表达c-Kit抗原,向粒细胞分化的途径障碍;c-Myc ~(V394D)过表达不能促进细胞周期进程,增殖和分化功能正常。另外,研究发现,c-Myc过表达抑制C/EBPα的表达,而c-Myc ~(V394D)过表达能够上调C/EBPα的表达,并且两者均能抑制p15和p21的表达。因此,c-Myc的转录抑制活性主要通过促进细胞周期进程,刺激造血干/祖细胞的持续增殖能力,粒细胞分化功能障碍,从而诱导急性粒细胞白血病的发生发展。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
转录抑制活性论文参考文献
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