Cbl-b蛋白的重组表达、纯化和活性检测方法的建立

论文摘要

Cbl-b是一种重要的泛素连接酶E3酶,负责与多种底物蛋白的特异识别,并因此介导特定蛋白的降解。研究表明,Cbl-b缺失可激活自然杀伤细胞,从而阻止肿瘤的扩散转移,因此Cbl-b被认为是一种肿瘤免疫治疗的新靶点。但目前针对Cbl-b蛋白的生化性质以及体外活力测定方法研究较少。本研究构建了Cbl-b不同结构域的重组表达载体。通过对其表达和纯化条件进行优化,确定了Cbl-b的底物结合功能域的最优表达条件,即使用感受态BL21（DE3）,在IPTG浓度为0.5 mmol/L、温度25℃下诱导10 h。利用亲和柱和分子筛层析联用纯化方法,提纯得到大小为65 kD的GST-Cbl-b （39～368）重组蛋白,其纯度可达95%。进一步,通过药物设计方法,设计并合成带有荧光素标记的Cbl-b底物Cblin-FAM,并利用配体结合实验验证了Cbl-b （39～368）结合底物的活力。本研究得到了具有活力的Cbl-b底物结合功能域并建立了其体外表达纯化方法,为后续发展基于Cbl-b纯酶的体外泛素化检测方法,以及发展新型、特异靶向Cbl-bE3酶的调控物提供了物质基础。

论文目录

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 张彤晖,胡有天,吴方

关键词: 活性检测,蛋白质纯化

来源: 基因组学与应用生物学 2019年07期

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学

单位: 上海交通大学系统生物医学研究院系统生物医学教育部重点实验室

基金: 国家自然科学基金-青年科学基金(No.31500635)资助

分类号: Q78

DOI: 10.13417/j.gab.038.002981

页码: 2981-2989

总页数: 9

文件大小: 1336K

下载量: 92

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标签：活性检测论文;  蛋白质纯化论文;