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新型鹅细小病毒SD15株的分离鉴定及其增殖特性的研究

2020-12-02阅读(547)

新型鹅细小病毒SD15株的分离鉴定及其增殖特性的研究

论文摘要

本实验室对山东送检病的病鸭进行病原鉴定与病毒分离。通过PCR鉴定与基因测序,送检病料诊断为新型鹅细小病毒（Novel goose parvovirus,NGPV）感染,分离的病毒并命名为NGPV SD15株。以NS1和VP1基因构建分子遗传进化树,结果显示NGPV SD15株与鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）在同一进化簇。以NGPV SD15株为接种物,肌注40只1日龄樱桃谷鸭,饲养6周,监控实验动物的体重、喙长。同时,收集心、肝、脾、肺、肾、十二指肠和直肠等组织,进行病毒拷贝数检测,并检测病理变化及病原的组织分布情况。从第3周后NGPV SD15株病毒感染的实验组鸭开始出现生长迟缓、腿部易骨折等症状,但没有明显的大舌症状。在感染6周后,感染组鸭的体重为1.80±0.22 kg,喙长为5.65±0.35 cm,对照组鸭的体重为2.21±0.26 kg,喙长为6.33±0.35 cm,感染组鸭的体重和喙长均极显著低于同时间的对照组鸭的体重和喙长。剖解并未发现组织内脏明显病变,用实时荧光定量（Real-time quality PCR,qPCR）方法对组织内病毒拷贝数进行检测,发现病毒含量在以上组织之间无明显差异。基于鼠抗NGPV多克隆抗体为一抗的免疫组织化学检测法（Immnohistochemistry,IHC）对病毒的组织分布进行观察,发现病原阳性信号均匀分布于以上组织中。组织病理观察发现感染组鸭的部分肝细胞轻度水肿,出现空泡变性,脾脏髓质区的脾小体减少甚至消失,淋巴细胞减少。将NGPV SD15接种9日龄鸭胚,盲传3代后NGPV SD15株病毒能在感染后48h-60 h致60%鸭胚死亡。尿囊液中病毒的拷贝数为105.0-106.5 copies/mL。将第4代NGPV SD15感染的鸭胚尿囊液接种50%汇合的鸭胚成纤维细胞（Duck embryo fibroblast cells,DEFs）并盲传。盲传4代后NGPV能导致DEFs出现细胞病变（Cytopathic effect,CPE）,细胞样品的病毒拷贝数为104.5-106.0 copies/mL。同样的方法接种鹅胚成纤维细胞（Goose embryo fibroblast cells,GEFs）,发现NGPV SD15株病毒不能导致GEFs出现CPE,并且病毒拷贝数从105.3copies/mL下降到103.8copies/mL。同时检测NGPV SD15株对DEFs的细胞毒性,发现感染96 h后NGPV对DEFs有明显的细胞毒性。以鼠抗NGPV多克隆抗体为一抗进行间接免疫荧光实验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）,检测NGPV SD15株第10代的病毒生长曲线。结果显示:在DEFs上,病毒阳性信号从72 h开始大量增加,96 h为最高峰。病毒增殖对数期在72-96 h,平台期在为96-120 h。同时,用PE Annexin V和7-Amino-Actinomycin双色染色法来观察NGPV SD15株致DEFs凋亡情况,发现NGPV主要引起感染细胞死亡,不诱导细胞凋亡。综上,本实验对临床分离的NGPV SD15株进行动物回归实验,初步研究了NGPV SD15株的在鸭体内分布情况及其临床病理变化。初步明确了NGPV体外增殖特性。本为NGPV的致病与增殖机制研究奠定基础。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 英文缩写词汇
  • 第一章 文献综述
  •   1 水禽细小病毒病
  •   2 水禽细小病毒分类
  •   3 水禽细小病毒的体外培养特性
  •   4 新型鹅细小病毒
  •     4.1 基因组特征
  •     4.2 流行病学特征
  •   5 本研究的目的及意义
  • 第二章 新型鹅细小病毒的分离、鉴定及序列特征
  •   1 实验材料
  •     1.1 主要试剂
  •     1.2 主要溶液及配置
  •     1.3 主要仪器设备
  •   2 实验方法与操作
  •     2.1 病料采集
  •     2.2 PCR鉴定并测序
  •     2.3 新型鹅细小病毒NS1和VP1 序列分析
  •     2.4 新型鹅细小病毒SD15株分离
  •   3 实验结果
  •     3.1 圆环病毒鉴定
  •     3.2 新型鹅细小病毒SD15株NS1 基因扩增
  •     3.3 新型鹅细小病毒SD15株VP1 基因扩增
  •     3.4 基于NGPV NS1 核酸及氨基酸的分子遗传进化树构建
  •     3.5 基于NGPV VP1 核酸及氨基酸的分子遗传进化树构建
  •     3.6 NS1 氨基酸序列分析
  •     3.7 VP1 氨基酸序列分析
  •     3.8 新型鹅细小病毒SD15 株分离
  •   4 讨论
  • 第三章 雏鸭人工感染新型鹅细小病毒实验
  •   1 实验材料
  •     1.1 实验动物及病毒
  •     1.2 主要试剂
  •     1.3 主要试剂配制
  •     1.4 主要仪器
  •   2 实验方法与操作
  •     2.1动物感染实验
  •     2.2 体重与喙长测定
  •     2.3 新型鹅细小病毒基因组拷贝数的qPCR方法建立
  •     2.4 组织内拷贝数检测
  •     2.5 石蜡包埋组织与病理切片的制作
  •     2.6 免疫组化染色实验
  •   3 实验结果
  •     3.1 人工感染NGPV樱桃谷鸭的临床症状
  •     3.2 喙长与体重变化
  •     3.3 荧光定量方法建立
  •     3.4 新型鹅细小病毒在雏鸭体内分布情况
  •     3.5 HE染色检测组织病理变化
  •     3.6 免疫组织化学染色检测病毒的组织分布
  •   4 讨论
  • 第四章 新型鹅细小病毒SD15 株的体外增殖特性
  •   1 实验材料
  •     1.1 鸭胚和病毒
  •     1.2 主要试剂
  •     1.3 主要试剂配制
  •     1.4 主要仪器
  •   2 实验方法与操作
  •     2.1 新型鹅细小病毒SD15株在鸭胚中的培养
  •     2.2 新型鹅细小病毒SD15 株在DEFs和 GEFs的培养
  •     2.3 新型鹅细小病毒对DEFs的细胞毒性检测
  •     2.4 新型鹅细小病毒致DEFs的细胞凋亡检测
  •     2.5 新型鹅细小病毒SD15 株在细胞上的增殖规律
  •   3 实验结果
  •     3.1 新型鹅细小病毒在鸭胚适应
  •     3.2 新型鹅细小病毒在成纤维细胞上的适应过程
  •     3.3 新型鹅细小病毒SD15 株对DEFs的细胞毒性
  •     3.4 新型鹅细小病毒致DEFs的凋亡情况
  •     3.5 新型鹅细小病毒SD15 株在DEFs增殖的间接免疫荧光观察
  •   4 讨论
  • 全文总结
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简介

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 张锦玥

    导师: 陈舜

    关键词: 新型鹅细小病毒,分离鉴定,增殖特性

    来源: 四川农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 四川农业大学

    分类号: S852.65

    DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000785

    总页数: 70

    文件大小: 5400k

    下载量: 11

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