导读:本文包含了皮蝇素论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:酵母,免疫,质粒,补体,小鼠,转基因,疫苗。
皮蝇素论文文献综述
胡安康[1]（2015）在《皮蝇素转基因小鼠的制备及其抑制皮肤移植排斥的研究》一文中研究指出器官移植作为治疗终末期器官衰竭患者的一种较有效的方法,在临床上得到了越来越广泛的应用,这也使人类器官供体相对缺乏的状况越来严重,激起人们对异种移植的强烈兴趣。然而,异种移植后将出现比同种异体移植更复杂的排斥反应。如何解决是保证异种器官移植成功关键因素。移植器官“寄生虫化”,及移植器官表达寄生虫某些分泌蛋白,使移植物能模拟寄生虫产生“免疫逃避”,从而长时间在受体内成活,这一策略为解决异种器官移植排斥反应提供了新思路。皮蝇素是一种可降解补体的丝氨酸蛋白酶,它们在寄生虫和宿主相互关系之间起着重要作用。帮助寄生虫应对宿主组织的侵袭,帮助逃避宿主的免疫系统。本研究通过转基因动物方式,使移植器官分泌皮蝇素A、C蛋白酶,建立移植器官“寄生虫化”动物模型,应用此模型进一步研究皮蝇素与补体系统作用机制。移植器官分泌皮蝇素抑制受体补体激活,调节各种异种移植排斥反应,延长移植物存活时间,为解决异种器官移植排斥反应提供新途径。1.皮蝇素分泌型真核表达载体的构建构建分泌型真核表达载体pEF1-CD-HA-AcGFP和pEF1-CD-HC-AcGFP,该载体以EF1为启动子,牛皮蝇一期幼虫RT-PCR扩增出HA、HC基因cDNA为目的基因,序列上游融合IgK-chain secretion signal信号肽序列。将融合基因序列插入PEFla-IRES-AcGFP多克隆位点,应用核酸内切酶EcoR I和BamH I双酶切,构建pEFl-CD-HA-AcGFP和pEF1-CD-HC-AcGFP重组分泌型真核表达载体。将构建好的质粒测序,正向反向测序结果与预期符合,用于下一步体外转染实验和转基因实验。2.皮蝇素A抗体的制备及鉴定皮蝇素A(Hypodermin A HA)具有很好的免疫原性,以其作为免疫抗原,可以使被免疫的动物产生对牛皮蝇幼虫的感染具有保护性的抗体。利用生物信息学对HA的抗原性及其亲水性进行分析,提示该氨基酸具有较好的抗原性。并发现抗原表位主要分布在氨基酸的C端101-116,161-173,37-50的叁个区域。通过RP-HPLC方法测定人工合成的多肽发现其纯度达到91.2%,并通过质谱鉴定分子量与预计的分子量吻合为28 kD。然后与KLH连接,免疫新西兰大白兔,得到了HA的多肽抗体。采用ELISA和western blotting方法验证了抗体的特异性。ELISA结果显示制备的HA多肽抗体特异性识别多肽,且滴度较高。并同时从牛皮蝇一期幼虫中提取蛋白,对制备抗体、阴性血清和阳性血清进行western blotting检测,结果发现制备抗体和阳性血清分别在28KD处有目的条带,而阴性血清没有目的条带。制备得到的HA多克隆抗体。为进一步研究HA的分子功能,提供了有用的工具。3.皮蝇素转基因表达载体体外转染实验pEF1--CD-HA-AcGFP和pEF1--CD-HC-AcGFP体外转染及抗补体损伤研究,应用脂质体法转染Cos7细胞,RT-PCR与western blot检测HA、HC是否成功表达；并用G418筛选得到了HA和HC的稳定表达细胞株。免疫共沉淀实验检测HA与C3是否相互作用。HA稳转细胞分别与10%、40%的豚鼠血清37℃孵育100 min,western blot与ELISA方法结果显示,占比为10%的豚鼠血清与HA稳转细胞孵育后,HA组较阴性对照达到了极显着水平。免疫共沉淀实验发现HA与C3相互作用。通过EMSA实验发现,HA通过主链底物结合位点(S225,T226,G227)与C3相互作用。同样将HC稳转细胞分别与10%、30%、50%的豚鼠血清37℃孵育100 min,western blot与ELISA方法结果显示,占比为10%及30%的豚鼠血清组中,HC组较阴性对照达到了显着水平。EMSA实验发现,HC通过结合位点(S229,G230,A231)与C3相互作用。4.皮蝇素转基因模型鼠的制备显微注射法制备转基因小鼠,Apal I, StuI内切酶双酶切pEF1-CD-HA-AcGFP, pEF1--CD-HC-AcGFP,回收序列为基因构件,显微注射入FVB小鼠和C57BL/6J小鼠受精卵雄性原核内,移植至假孕母鼠输卵管,小鼠出生后剪尾提DNA,分别设计引物PCR检测目的基因HA、HC。结果显示,HA获得4只阳性首建鼠,HC获得9只首建鼠,阳性鼠分别与正常FVB小鼠和C57BL/6J小鼠杂交扩群。5.模型鼠器官异种移植、抑制移植排斥反应研究皮肤通常是高度敏感的,皮肤移植通常被认为是会引起非常强的排斥反应,本研究中,将HA转基因小鼠来进行小鼠皮肤移植实验,来研究HA的免疫抑制作用及对补体成分的影响。结果发现,HA转基因小鼠皮肤移植存活的时间与对照组相比明显延长,表明在体内HA也具有较好的免疫抑制作用。研究发现HA通过裂解补体C3,延长补体活化,从而降低同种异体移植物的排斥,降低潜在的有害影响。本研究结果中清楚地表明,在HA转基因小鼠皮肤移植中C3,C9,CD4和B7-2等含量与对照组相比显着降低。延长了HA转基因小鼠皮肤移植物的存活。在一些炎症过程中,补体成分也是一个关键的因素。根据本研究中移植皮肤炎症期的记录和HE染色结果表明,皮肤移植后炎症期峰值是出现在1-4d之间,各组间的炎性细胞浸润有比较显着的差异。综上所述,HA与HC均具有免疫抑制的特性,HA与HC在体外均可以抑制补体的活性,降低细胞介导的抑制。体内实验结果表明,HA在转基因皮肤移植小鼠模型的实验中体现了比较重要的作用。与对照组相比,HA转基因小鼠的皮肤移植存活时间明显延长,表明HA在应用于提高移植物的存活时间上可能是个不错的选择。今后我们将进一步深入的研究HA、HC作为可延长供体器官生存的基因治疗或药物的潜力。(本文来源于《扬州大学》期刊2015-04-01）
白红岩[2]（2012）在《皮蝇素基因真核表达质粒的构建及其免疫特性的研究》一文中研究指出牛皮蝇蛆病主要是牛皮蝇和纹皮蝇的幼虫寄生在牛体内引起的一种寄生虫病。该病危害很严重,对养牛业和皮革加工业有着非常大的影响,而且妨碍公共卫生引发人畜共患病,现行的药物防治方法存在副作用,畜产品药物残留等缺点。因此人们越来越重视该病的免疫防治研究。本研究以重组克隆载体pTHA和pTHC为模板,利用PCR技术和重迭延伸剪接技术,扩增HA-HC融合基因,连接到克隆载体pMD19-T simple vector中,构建重组克隆质粒pMD19-T-HAC(简称pTHAC)。将HA、HC、HA-HC基因亚克隆到真核表达载体pVAX1中,构建重组真核表达质粒pVAXl-HA(简称pVHA)、pVAX1-HC(简称pVHC)和pVAXl-HAC简称pVHAC)c将各重组质粒体外转染小鼠胎儿成纤维细胞和牛胎儿成纤维细胞,检测目的基因的瞬时表达情况。在体内将各重组表达质粒和空载体pVAXl及PBS免疫昆明小鼠,共免疫3次,每次间隔2周,采8次血清,应用间接ELISA方法检测血清抗体效价。第3次免疫2周后,以纹皮蝇重组蛋白为刺激原,MTT法检测小鼠脾脏淋巴细胞增殖情况；再以Y干扰素酶联免疫分析试剂盒检测小鼠脾脏淋巴细胞分泌的IFN-γ含量。结果表明：与空载体pVAXl和PBS对照组相比,各重组表达质粒免疫组小鼠的抗体水平逐渐上升,差异极显着(P<0.01)。第3次免疫2周后,DNA疫苗免疫组的淋巴细胞增殖试验刺激值(SI)高于对照组,差异极显着(P<0.01)；双价DNA疫苗组的刺激值高于单价DNA疫苗pVHC组,低于单价DNA疫苗pVHA组,差异极显着(P<0.01)。DNA疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ高于两个对照组,差异极显着(P<0.01)。不论是单价DNA疫苗,还是双价DNA疫苗,在小鼠体内均能诱导体液免疫和细胞免疫应答,本实验为牛皮蝇蛆病新型疫苗的研究奠定了基础。(本文来源于《内蒙古农业大学》期刊2012-05-01）
王文龙,娜仁高娃,刘春霞,白红岩,初一鑫[3]（2012）在《皮蝇素A基因DNA疫苗的构建及其免疫特性研究》一文中研究指出本研究以实验室保存的原核表达载体pET-HA为模板,PCR扩增皮蝇素A(HA)基因,将克隆基因插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中构建DNA疫苗pcDNA-HA。构建的DNA疫苗pcDNA-HA和空载体pcDNA3.1(+)体外转染小鼠胎儿成纤维细胞,间接免疫荧光试验检测细胞内目的基因的表达。将pcDNA-HA、空载体pcDNA3.1(+)和PBS免疫BALB/c小鼠后,对免疫小鼠的体液免疫水平进行了检测。结果表明,构建的DNA疫苗能在小鼠胎儿成纤维细胞中表达,能被抗HA抗体识别,可诱导小鼠产生特异性体液免疫反应,说明HA可作为牛皮蝇蛆病的候选疫苗抗原。本研究为牛皮蝇蛆病的DNA疫苗研究奠定了基础。(本文来源于《畜牧与兽医》期刊2012年03期）
王艳华,殷宏,罗建勋,蒋锡仕,张德林[4]（2007）在《皮蝇素A基因的克隆与序列分析》一文中研究指出首先提取采自甘肃玛曲的皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出Hypodermin A(HA)基因片段,将此片段与PGEM-T Easy载体连接,构建克隆载体PGEM-HA,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,进行测序与分析。结果表明,扩增的HA基因长678bp,编码229氨基酸。克隆到的基因序列与NCBI GenBank上登陆的皮蝇HA基因序列核甘酸同源性为96.6%,推导氨基酸同源性达97.8%。该基因的成功克隆为其进一步表达打下了坚实的基础。(本文来源于《畜牧兽医杂志》期刊2007年06期）
王艳华,殷宏,罗建勋,蒋锡仕[5]（2007）在《皮蝇素A基因的克隆及其毕赤酵母表达载体的构建》一文中研究指出提取采自甘肃玛曲皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出皮蝇素A(Hypodermin A,HA)基因片段,用XhoⅠ、XbaⅠ消化,将消化后的目的基因HA纯化并回收,与经同样的酶消化后并纯化回收的载体pPICZa连接并转化,获得重组表达质粒pPICZa-HA,经PCR、酶切、测序表明,目的基因插入位置、方向和阅读框正确。(本文来源于《动物医学进展》期刊2007年09期）
高兴春,徐梅倩,何国声[6]（2007）在《皮蝇素C蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化》一文中研究指出利用PCR技术从重组质粒pGEM-T/HC中扩增HCcDNA片段,克隆到pPIC9k毕赤酵母表达载体中,获得重组质粒pPIC9k-HC,重组质粒线性化后电激转化入毕赤酵母GS115菌株中,重组子经G418筛选、PCR鉴定得到含外源基因的重组子,然后在含0.5%甲醇的培养基中诱导产生目的蛋白,经SDS-PAGE检测发现表达蛋白质的相对分子量约为28kD,表达量约为121mg/L,表达上清经超滤浓缩和阴离子交换层析初步纯化,所得纯化产物经Western-blot表明具有与兔抗HC血清特异性结合的能力;明胶电泳检测显示具有水解酶活性,为今后进行大规模的牛皮蝇蛆病的调查提供了一种生产大量廉价抗原的方法。(本文来源于《生物工程学报》期刊2007年03期）
高兴春[7]（2007）在《毕赤酵母表达皮蝇素C蛋白及牛皮蝇蛆病诊断技术的研究》一文中研究指出皮蝇素C(Hypodermin C，HC)是皮蝇第一期幼虫在宿主体内移行过程中分泌的一种丝氨酸蛋白酶，对皮蝇有很高的抗原性和特异性，是一种理想的检测抗原。本文首次建立了用毕赤酵母表达系统表达重组HC蛋白的技术，对表达产物进行了生物特性的鉴定，对表达条件进行了优化研究。将经PCR扩增出的HC基因连接到毕赤酵母一大肠杆菌穿梭质粒pPIC9k上，构建重组转移质粒pPIC9k-HC，测序鉴定插入序列。重组质粒线性化后，通过电激转化入酵母细胞GS115中，用组氨酸缺陷培养基筛选含重组质粒的克隆，用含1.0mg／mlG418的YPD培养基筛选含多拷贝质粒的克隆。重组酵母细胞在含甲醇的培养基中分泌产生目的蛋白，培养60小时后收取上清，用阴离子交换层析柱分离纯化。经SDS—PAGE检测发现表达蛋白质的相对分子量约为28 KD，表达上清经超滤浓缩和阴离子交换层析初步纯化，所得纯化产物经Western-blot表明具有与兔抗HC血清特异性结合的能力；明胶电泳检测显示具有水解酶活性。单因素改变表达条件的优化试验结果表明，当甲醇浓度为1.0％，甘油浓度为0.25％，pH值为6.0，诱导60h的情况下表达产量最高，表达量约为121 mg／L，显着高于其他表达方法。用表达纯化的蛋白作为检测抗原，进行了牛皮蝇蛆病ELISA诊断方法的研究：通过对ELISA反应条件的系列摸索，确定了各组分的最适工作条件：抗原的最适浓度为1μg／ml，最佳封闭条件是5％脱脂乳37℃封闭3h，血清的稀释度为1：50，作用时间是37℃2h，二抗的最佳稀释度为1：2000，作用时间是37℃1h，底物在37℃显色10min，根据己经建立的ELISA方法及反应条件，确定阴阳性临界值为0.21。初步研究表明纯化的蛋白具有很好的抗原性，建立的ELISA方法具有较高的特异性，为试剂盒的研制打下了良好的基础。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2007-05-01）
高兴春,郭敏,徐梅倩,何国声[8]（2006）在《用毕赤酵母表达皮蝇素C蛋白的研究》一文中研究指出牛皮蝇蛆病(Hypodermosis)是由双翅目皮蝇科皮蝇属的皮蝇幼虫引起的一种寄生虫病,通过在家畜体内移行和背部穿孔带来危害。皮蝇素C(Hypodermin C,HC)一种后生动物起源的昆虫胶原酶,分子量是 25．223 Da,成熟的HC含有230个氨基酸,比其前体少了30个氨基酸,整个氨基酸序列和胰蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列具有高度的同源性。HC只在一期幼虫中表达,能在牛背上形成瘤包的二期和叁期幼虫不表达HC。HC对皮蝇属有很高的抗原性和特异性。巴斯德毕赤酵母表达系统是一种价廉高产的表达系统,可能会成为获得足够的重组HC蛋白的方法。(本文来源于《中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术研讨会论文摘要集》期刊2006-08-01）
孙怡,徐梅倩,高兴春,何国声[9]（2006）在《毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白》一文中研究指出建立了用毕赤酵母表达系统表达皮蝇素A(HypodermotinA,HA)的技术,并对表达条件进行了优化筛选。将皮蝇素A基因连接到质粒pPIC9k上,构建了重组转移质粒pPIC9k-HA。重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115后,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选。重组酵母细胞在含0.5%甲醇的培养基中诱导产生目的蛋白,培养3d后收取上清,用阴离子交换层析柱分离纯化。经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白相对分子质量约为30000。Western-blotting表明,该蛋白能与兔抗HA血清特异性结合。明胶电泳检测显示,该蛋白具有酶活性。单因素改变表达条件的结果表明,甲醇浓度在0.5%~1%、溶氧量在70%以上、诱导2~3d的情况下表达产量最高,达1500mg/L左右。该研究结果对防治牛皮蝇蛆病疫苗的深入研究及毕赤酵母在寄生虫领域的应用有一定价值。(本文来源于《中国兽医学报》期刊2006年03期）
孙怡[10]（2005）在《用毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白的研究》一文中研究指出皮蝇素A(Hypodermin A,HA)是皮蝇第一期幼虫在宿主体内移行过程中分泌的一种丝氨酸蛋白酶,具有抗炎、抑制补体反应和延缓免疫反应等功能,很可能成为控制牛皮蝇蛆病的候选疫苗之一。 本文首次建立了用毕赤酵母表达系统表达HA的技术,对表达条件进行了优化研究,并用纯化HA蛋白进行了免疫保护试验。将HA基因连接到质粒pPIC9k上,构建重组转移质粒pPIC9k-HA。重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115中,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选。重组酵母细胞在含甲醇的培养基中分泌产生目的蛋白,培养3天后收取上清,用阴离子交换层析柱分离纯化。经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白约为30KD。Western-blotting表明该蛋白能与兔抗HA血清特异性结合。明胶电泳检测显示具有酶活性。对诱导3天后逐渐出现的50KD蛋白的糖基化显色反应表明该蛋白为超糖基化蛋白,氨基酸含量分析表明该蛋白氨基酸组份与30KD重组HA蛋白一致。单因素改变表达条件试验结果表明,甲醇浓度0.5%,溶氧量70%以上,诱导56小时的情况下表达产量最高,可达1500mg/L,显着高于其他表达方法。 用30KD蛋白及3天后出现的50KD蛋白免疫家兔,叁周后抗体水平达到峰值,后缓慢下降。50KD蛋白免疫效果较30KD蛋白好,差异非常显着(P<0.01)。用50KD蛋白免疫自然感染牦牛,七月免疫组与九月免疫组感染率分别为83.3%和36.3%(对照组为55.5%);平均感染强度分别为6.5和4.2(对照组为13.0),差异不显着(P>0.05)。免疫后,抗体水平上升,叁个月后缓慢下降。九月免疫组免疫效果较七月免疫组好,叁组抗体水平差异非常显着(P<0.01)。上述研究结果深入了防治牛皮蝇蛆病疫苗的研究及毕赤酵母在寄生虫领域的应用,可为田间试验提供所需抗原。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2005-06-01）
皮蝇素论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
牛皮蝇蛆病主要是牛皮蝇和纹皮蝇的幼虫寄生在牛体内引起的一种寄生虫病。该病危害很严重,对养牛业和皮革加工业有着非常大的影响,而且妨碍公共卫生引发人畜共患病,现行的药物防治方法存在副作用,畜产品药物残留等缺点。因此人们越来越重视该病的免疫防治研究。本研究以重组克隆载体pTHA和pTHC为模板,利用PCR技术和重迭延伸剪接技术,扩增HA-HC融合基因,连接到克隆载体pMD19-T simple vector中,构建重组克隆质粒pMD19-T-HAC(简称pTHAC)。将HA、HC、HA-HC基因亚克隆到真核表达载体pVAX1中,构建重组真核表达质粒pVAXl-HA(简称pVHA)、pVAX1-HC(简称pVHC)和pVAXl-HAC简称pVHAC)c将各重组质粒体外转染小鼠胎儿成纤维细胞和牛胎儿成纤维细胞,检测目的基因的瞬时表达情况。在体内将各重组表达质粒和空载体pVAXl及PBS免疫昆明小鼠,共免疫3次,每次间隔2周,采8次血清,应用间接ELISA方法检测血清抗体效价。第3次免疫2周后,以纹皮蝇重组蛋白为刺激原,MTT法检测小鼠脾脏淋巴细胞增殖情况；再以Y干扰素酶联免疫分析试剂盒检测小鼠脾脏淋巴细胞分泌的IFN-γ含量。结果表明：与空载体pVAXl和PBS对照组相比,各重组表达质粒免疫组小鼠的抗体水平逐渐上升,差异极显着(P<0.01)。第3次免疫2周后,DNA疫苗免疫组的淋巴细胞增殖试验刺激值(SI)高于对照组,差异极显着(P<0.01)；双价DNA疫苗组的刺激值高于单价DNA疫苗pVHC组,低于单价DNA疫苗pVHA组,差异极显着(P<0.01)。DNA疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ高于两个对照组,差异极显着(P<0.01)。不论是单价DNA疫苗,还是双价DNA疫苗,在小鼠体内均能诱导体液免疫和细胞免疫应答,本实验为牛皮蝇蛆病新型疫苗的研究奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
皮蝇素论文参考文献
[1].胡安康.皮蝇素转基因小鼠的制备及其抑制皮肤移植排斥的研究[D].扬州大学.2015
[2].白红岩.皮蝇素基因真核表达质粒的构建及其免疫特性的研究[D].内蒙古农业大学.2012
[3].王文龙,娜仁高娃,刘春霞,白红岩,初一鑫.皮蝇素A基因DNA疫苗的构建及其免疫特性研究[J].畜牧与兽医.2012
[4].王艳华,殷宏,罗建勋,蒋锡仕,张德林.皮蝇素A基因的克隆与序列分析[J].畜牧兽医杂志.2007
[5].王艳华,殷宏,罗建勋,蒋锡仕.皮蝇素A基因的克隆及其毕赤酵母表达载体的构建[J].动物医学进展.2007
[6].高兴春,徐梅倩,何国声.皮蝇素C蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化[J].生物工程学报.2007
[7].高兴春.毕赤酵母表达皮蝇素C蛋白及牛皮蝇蛆病诊断技术的研究[D].中国农业科学院.2007
[8].高兴春,郭敏,徐梅倩,何国声.用毕赤酵母表达皮蝇素C蛋白的研究[C].中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术研讨会论文摘要集.2006
[9].孙怡,徐梅倩,高兴春,何国声.毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白[J].中国兽医学报.2006
[10].孙怡.用毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白的研究[D].中国农业科学院.2005
论文知识图
