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小反刍兽疫病毒双抗原夹心时间分辨荧光免疫测定方法的建立

2020-12-02阅读(960)

小反刍兽疫病毒双抗原夹心时间分辨荧光免疫测定方法的建立

论文摘要

通过优化大肠埃希菌密码子、优化表达条件等方法,在大肠埃希菌表达系统中成功获得了可溶性的N蛋白与NH融合蛋白。进一步基于纯化的可溶性N蛋白与NH融合蛋白建立了小反刍兽疫病毒双抗原夹心时间分辨荧光免疫测定方法。该方法敏感性高,特异性强,能够特异性的检测羊血清中的小反刍兽疫病毒抗体,与其他相关疫病病原无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均小于10%。对292份临床血清样品进行检测,与法国IDVET竞争ELISA试剂盒比较,阳性样品符合率为92.47%,阴性样品符合率为97.26%,总的符合率为94.86%。该方法与传统的ELISA方法相比,具有敏感性、特异性相当,操作简单、快速,具有较高的推广应用价值。

论文目录

  • 1 材料与方法
  •   1.1 材料
  •   1.2 方法
  •     1.2.1 目的基因片段的获得
  •     1.2.2 目的基因扩增与融合
  •     1.2.3 重组质粒的构建与鉴定
  •     1.2.4 重组大肠埃希菌pET-30a- （N） -BL21 （DE3） 株与pET-30a- （NH） -BL21 （DE3） 株的构建
  •     1.2.5 重组蛋白可溶性诱导表达条件的建立
  •     1.2.6 重组蛋白N与NH的表达与纯化
  •       1.2.6. 1 树脂的预处理
  •       1.2.6. 2 挂柱
  •       1.2.6. 3 重组蛋白的洗杂和洗脱
  •       1.2.6. 4 蛋白的收获
  •     1.2.7 纯化后蛋白的抗原性分析
  •     1.2.8 铕标记抗原结合物的制备
  •       1.2.8. 1 抗原的预处理
  •       1.2.8. 2 抗原的标记
  •       1.2.8. 3 铕标记抗原的纯化
  •       1.2.8. 4 铕标稀释液的配制
  •       1.2.8. 5 铕标结合物的配制
  •       1.2.8. 6 标记物的保存
  •     1.2.9 N抗原的包被和封闭
  •     1.2.1 0 铕标记抗原最适工作浓度的确定
  •     1.2.1 1 样品稀释度的确定
  •     1.2.1 2 抗原最佳反应时间选择
  •     1.2.1 3 铕标记结合物最佳反应时间选择
  •     1.2.1 4 阴阳性临界值的确定
  •     1.2.15特异性试验
  •     1.2.16敏感性试验
  •     1.2.17重复性试验
  •     1.2.18符合性试验
  • 2 结果
  •   2.1 目的基因的PCR扩增
  •   2.2 重组质粒的构建与鉴定
  •   2.3 SDS-PAGE分析结果
  •   2.4 纯化后蛋白的抗原性分析
  •   2.5 N抗原最佳包被浓度与铕标NH抗原最佳稀释浓度的选择
  •   2.6 样品稀释度
  •   2.7 待检抗体反应时间选择
  •   2.8 铕标记抗原反应时间选择
  •   2.9 特异性试验
  •   2.1 0 敏感性试验
  •   2.1 1 时间分辨荧光免疫测定方法阴阳性临界值确定
  •   2.1 2 重复性试验
  •   2.1 3 符合性试验
  • 3 讨论

    • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 孙雨,宋晓晖,董浩,赵柏林,曲萍,蒋菲,杨天意,张晨,杨林,王传彬

    关键词: 小反刍兽疫病毒,活性蛋白,融合蛋白,可溶性表达与纯化,时间分辨荧光免疫测定方法

    来源: 动物医学进展 2019年04期

    年度: 2019

    分类: 农业科技,基础科学

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 中国动物疫病预防控制中心

    基金: 科技部十三五重点研发项目(2016YFD0500901)

    分类号: S852.65

    DOI: 10.16437/j.cnki.1007-5038.2019.04.001

    页码: 1-8

    总页数: 8

    文件大小: 2176K

    下载量: 129

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