嗜虫耶尔森氏菌HlyA及HasA外分泌表达系统的构建

论文摘要

【目的】构建一株具备外分泌蛋白功能的工程菌,解决杀虫毒素无法由胞内分泌至胞外,无法直接作用于虫体等问题,为松墨天牛防治提供新思路。【方法】本研究先测定从松墨天牛肠道及其生境中分离出的嗜虫耶尔森氏菌（CSLH88）的生长特性及抗性,进而对其进行分子改造。构建HlyA （pGHKW2）以及HasA （pGHKW4）外分泌表达载体,利用电穿孔法将其转入CSLH88菌株,获得能够表达绿色荧光蛋白的工程菌。利用稀释涂板及荧光体式镜检测技术对两个质粒进行遗传稳定性检测,并采用SDS-PAGE及Western blotting技术验证蛋白外分泌功能。【结果】CSLH88菌株培养2–4 h能够进入对数生长期,并对卡那霉素（Kan）敏感。成功构建了含有Kan抗性基因的pGHKW2（GenBank:MK562405）和pGHKW4（GenBank:MK562404）两个外分泌表达载体的CSLH88工程菌株。其中,发现pGHKW4质粒更加适合在嗜虫耶尔森氏菌中稳定遗传。SDS-PAGE及Western blotting检测结果表明HlyA系统无法在CSLH88菌株中将目的蛋白分泌到胞外,而HasA系统则可以有效地发挥外分泌表达功能。【结论】通过对HlyA及HasA两个外分泌表达系统进行研究,从中筛选出HasA型血红素转运系统作为CSLH88菌株的外分泌表达系统,为后续外分泌杀虫毒素蛋白菌株构建以及CSLH88菌株的致病性研究奠定基础。

论文目录

1 材料和方法

1.1 菌株与试验材料

1.2 菌株生长曲线及抗性测定

1.2.1 菌株生长曲线测定：

1.2.2 菌株抗性测定：

1.3 重组菌株的构建

1.3.1 含Kan抗性标记的外分泌重组质粒构建：

1.3.2 电穿孔感受态制备：

1.3.3 电转化：

1.3.4 阳性转化子的验证：

1.4 遗传稳定性检测

1.5 外分泌蛋白提取及验证

1.5.1 胞外蛋白超滤浓缩：

1.5.2胞内蛋白提取：

1.5.3 外分泌蛋白验证：

2 结果和分析

2.1 菌株生长曲线及抗性分析

2.2 抗性标记的重组质粒鉴定

2.3 重组外分泌菌株荧光检测

2.4 质粒遗传稳定性检测

2.5 外分泌绿色荧光蛋白表达与验证

3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 黄晨燕,郑茹萍,黎钟秀,余云钦,罗雨琦,周建双,张飞萍,吴松青

关键词: 松墨天牛,嗜虫耶尔森氏菌,外分泌表达系统,绿色荧光蛋白

来源: 微生物学报 2019年08期

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,植物保护,林业

单位: 福建农林大学林学院生态公益林重大有害生物防控福建省高校重点实验室,厦门大学环境与生态学院

基金: 国家重点研发计划课题(2017YFD0600105),国家自然科学基金(31601905),福建省科技厅自然科学基金(2016J01097),福建省科技计划项目(2018N5002),福建农林大学科研基金(xjq201614),福建农林大学林学院林学高峰学科项目(71201800720,71201800753,71201800779),福建省大学生创新创业训练计划项目(201810389102),福建省林业科学研究项目[Minlinke(2017)03]~~

分类号: Q78;S763.18

DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20190076

页码: 1612-1623

总页数: 12

文件大小: 627K

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嗜虫耶尔森氏菌HlyA及HasA外分泌表达系统的构建

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