李莲瑞[1]2003年在《嗜水气单胞菌Aer毒素的表达与抗原性分析》文中指出嗜水气单胞菌是革兰氏阴性杆菌，弧菌科气单胞菌属，可引起软体动物、淡水鱼类、两栖类、爬行类、鸟类及哺乳动物等多种动物全身性败血症或局部感染，并常致动物死亡。嗜水气单胞菌对人也有致病性，可引起人的急性胃肠炎、败血症及伤口感染、中耳炎、腹膜炎等。目前，嗜水气单胞菌作为致病微生物的地位已得到确定，并且成为当代公共卫生关注的对象。嗜水气单胞菌的菌株所产生的外毒素是重要的致病因子。已确定的外毒素有气溶素(aerolysin)、溶血素(hemolysin)、溶血毒素(hemolytic toxin)和细胞毒性肠毒素(cytolytic enterotoxin)等。外毒素虽名称各异，但其基因结构有较高的同源性，被认为是一类毒素基因，关于嗜水气单胞菌的外毒素，国际逐渐公认其名称为气溶素(Aer毒素)。鉴于嗜水气单胞菌Aer毒素的致病性，因而毒素的检测在嗜水气单胞菌的快速诊断、流行病学调查及公共卫生检测、检疫等方面具有重要作用。 本研究选择嗜水单胞菌Aer毒素为研究对象，分析国内致病株该基因的结构，构建原核表达载体，并在E.coli BL21(DE3)中进行表达。研究重组Aer毒素和天然Aer毒素的抗原特性，为建立基于重组Aer毒素的免疫检测方法和Aer毒素的进一步研究奠定基础。 该领域国外研究热点在嗜水气单胞菌毒素的基因组结构、相关毒力因子基因克隆和序列比较以及毒素蛋白的表达和致病机理等方面。国内，针对鱼类暴发性流行病，对嗜水气单胞菌的表型分析、毒素原性和疫苗制备等方面做了许多工作。在嗜水气单胞菌的检测分型上，除了常规分离培养、血清学检测外，基因探针、PCR、RAPD等技术已应用到外毒素的检测和分型上，但对有关毒力因子的基因结构特征及其重组毒素的表达、纯化及抗原性分析的研究还很少。 本研究选择国内嗜水单胞菌分离株AHCS02产生的Aer毒素为研究对象，分析其基因的结构，构建原核表达载体，并在E.coli BL21(DE3)中进行表达，并研究重组Aer毒素和天然Aer毒素的抗原特性。旨在建立嗜水气单胞菌基于重组Aer毒素的免疫检测方法。 Aer毒素基因的克隆和序列分析 根据Genbank中嗜水气单胞菌Aer毒素基因的序列(注册号为M16495)，设计扩增编码Aer毒素成熟蛋白基因的引物，以国内嗜水气单胞菌分离株AHCS02(分离自吉林省四家子水库的病鱼)为模板，PCR扩增Aer毒素编码成熟蛋白的基因序列，PCR产物与pMD18-T载体连接，构建重组质粒pMD18-T-aer，进行酶切鉴定和序列测定。酶切鉴定及测序结果表明：所得片段大小为1332bp。用DNA TOOLS和BLAST分析表明：该序列与M16495比较，二者的同源性为92％，有108个碱基不同。在108个碱基中，有76个碱基变异未引起编码氨基酸的变异，32个碱基变异引起了19个氨基酸的变异，氨基酸的变异主要集中在422～436个氨基酸之间，其间有8个氨基酸发生改变，其中435～437个氨基酸残基之间丢失一个密码子，所得序列共编码443个氨基酸，氨基酸序列与M16495的同源性为95．5％。 原核表达载体的构建及表达 经酶切鉴定和序列测定分析后，将pMD—18T—tier质粒DNA经EcaR I和妇』I双酶切后获得Aer‘毒素基因片段，与经过相同酶切的pET28b连接后，转化克隆菌DH5 Q，提取重组质粒DNA，经酶切鉴定和测序后，将重组质粒pET28b—aer转化表达宿主菌E cD』j BL21(DE3)中．用终浓度为llllmOl／L的IPTG诱导培养重组表达菌。取诱导培养的重组表达菌和对照菌做菌体裂解物外源基因表达产物的SDS—PAGE和薄层凝胶扫描分析。结果显示：经IPTG诱导后表达菌DE3的裂解产物与对照菌相比出现了一条新的表达条带，其大小与经DNA。?001。S分析的外源核苷酸融合蛋白的理论推导值53．9kDa相符。而且嗜水气单胞菌Aer‘毒素能在大肠杆菌中高效表达，经1mmol／L IPTG诱导1、2、3、4h的表达量分别占菌体蛋白总量的31．74％、42．41％和47．83％、48．57％。 重组Aer。毒素的纯化及天然Aer毒素和重组Aer毒素的抗原性分析 将原核表达系统表达的重组Aer毒素经SDS—PAGE后，切下目的蛋白，利用电洗脱法将蛋白洗脱出来，后经透析、PEG8000浓缩、定量，对獭兔进行免疫。首次免疫用弗氏完全佐剂乳化，弗氏不完全佐剂乳化进行叁次加强免疫，免疫的抗原量每只兔子每次100gg。免疫结束10天后，獭兔心脏采血，分离血清后。收集免疫后的血清，提取血清IgG。以饱和硫酸铵法提取具B一溶血圈的嗜水气单胞菌株,4ffCS02的天然Aer毒素。甲醛脱毒后以同样免疫程序免疫獭兔制备免疫血清并分离IgG，然后做Wes‘tern blotting检测。Western blotting结果显示，利用纯化的重组Aer毒素制备的兔抗血清可以很好地识别嗜水气单胞菌株．／fftCS02产生的天然Aer’毒素，而且抗天然Am’毒索的抗体也能识别初步纯化的重组Aer毒素。由此说明，体外表达的重组Aer-毒素保留了天然Aer。毒素的抗原性，而且重组Aer毒素和天然Aex。毒素具有相似的抗原性。
李莲瑞, 卢强, 刘明远, 付宝权, 韩文瑜[2]2005年在《嗜水气单胞菌重组Aer毒素的纯化和抗原性分析》文中研究指明对原核表达的重组嗜水气单胞菌Aer毒素进行初步纯化,比较了它与天然Aer毒素的抗原性,为建立检测该毒素的免疫学方法奠定了基础。将原核表达的重组Aer毒素经SDS-PAGE后,切下目的蛋白,利用电洗脱法将蛋白洗脱出来,后经透析、PEG8000浓缩、定量,对獭兔进行免疫,采集血清,提纯IgG,在W estern b lotting试验中可与天然Aer毒素起反应,说明,体外表达的重组Aer毒素保留了天然Aer毒素所具有的抗原性。同时,将嗜水气单胞菌AHCS02菌接种于兔鲜血平板,30℃、培养15 h后,将具有β-溶血的单菌落于LB液体培养基中培养后,用饱和硫酸铵法提取上清液中的天然Aer毒素,用甲醛脱毒后,以同样免疫方法免疫獭兔,免疫结束后,采集血清提取IgG,在W estern b lotting试验中,可以检测到重组Aer毒素。试验说明:原核表达的重组Aer毒素和天然Aer毒素诱导獭兔产生的血清IgG抗体可以互相识别重组Aer毒素和天然Aer毒素,重组Aer毒素和天然Aer毒素有相似的抗原性。
杜娜[3]2013年在《嗜水气单胞菌耐药性分析及气溶素抗血清的免疫保护性研究》文中研究表明本研究选取实验室分离、鉴定并保存的5株嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) Ah638、Ah640、 Ah563、Ah541和Ah465,并以A.hydrophila标准菌株ATCC7966作为对照,采用次抑菌浓度传代培养方法,分别人工诱导获得耐左氧氟沙星的A.hydrophila菌株,以此分析A.hydrophila的氟喹诺酮类药物耐药机制及氟喹诺酮类药物之间的交叉耐药性。克隆一株A.hydrophila的气溶素基因ORF序列,原核表达并免疫新西兰大白兔得多克隆抗体,对异育银鲫腹腔注射免疫,探讨气溶素多克隆抗体的被动免疫效果,为鱼类疾病的防治丰富资料积累。研究结果如下：1.参照日本化学疗法学会制定的标准法测定左氧氟沙星对菌株的最小抑菌浓度(MIC),除Ah465对左氧氟沙星为中等耐药菌外,其余5株A.hydrophila菌株对左氧氟沙星均敏感。在28℃条件下分别对5株A.hydrophila敏感菌株在含有左氧氟沙星的培养基中连续传代培养,72h为1代,共传9代,其MIC上升倍数为500～3906倍。对野生型A.hydrophila、标准菌株A.hydrophila ATCC7966和诱导得到的耐药菌株分别扩增GyrA和ParC,发现耐药菌株在GyrA的抗性决定区内存在突变(Ser-83→lle,Leu-92→Met),在抗性决定区外的50、116、165和168位点也存在突变,而ParC无突变。对耐药菌进行回复突变使其MIC下降,发现83、116和165位点与野生型一致,因此我们认为此叁个位点与氟喹诺酮类药物耐药性密切相关。通过外排泵机制的研究发现除Ah541外,其余诱导得到的耐药菌株的MIC下降2～4倍。耐左氧氟沙星菌株对其他氟喹诺酮类药物产生交叉耐药性。2.根据GenBank中致病性A.hydrophila气溶素(Aer)基因的序列设计引物,以鱼源A.hydrophila分离株(Ah15)为模板扩增出Aer基因的ORF序列,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定,并以Aer为分子标记构建系统进化树,结果表明,国内菌株聚为一支,国外菌株聚为一支。通过pET-32a (+)载体构建Ah15株Aer基因的表达载体pET32a-15,转化大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约72.2kD相吻合的融合蛋白带,且以包涵体形式存在。用浓缩后的包涵体蛋白免疫新西兰大白兔获得了重组蛋白的抗血清,Western-blotting结果显示,兔抗血清可以识别嗜水气单胞菌的重组毒素,说明该基因的重组蛋白具有很好地免疫原性,可作为基因工程疫苗的候选基因。3.异育银鲫(Carrassius auratus)经腹腔注射免疫接种多克隆抗体,并在24h后攻毒。免疫组的累计死亡率为40%,对照组的累计死亡率为87%,对照组的累计死亡率显着高于免疫组,免疫组的相对保护率(RPS)为54.02%。免疫组与对照组存活鱼的血清凝集抗体效价均为1：32,说明免疫组的保护性由多克隆抗体的被动免疫产生,而非由A.hydrophila攻毒后产生抗体的差异性造成。
赵秀敏[4]2007年在《嗜水气单胞菌溶血素A片段基因的克隆、表达及其产物的免疫学特性》文中指出嗜水气单胞菌是目前引起淡水鱼类暴发性流行病的主要病原,是一种条件性病原菌。近年来有关该菌感染的报道日益增多,引起了水产学界、兽医学界和医学界的广泛重视,被公认为是一种人-畜-鱼共患的致病微生物。一般认为本菌的致病与相关的毒力因子密切相关,特别是溶血素,研究证明溶血素本身就具有溶血性、肠毒性和细胞毒性作用,并对鳗鲡、鲫鱼、小白鼠等受试动物具有独立的致病作用,是重要的保护性抗原。T-Chakraborty等建议,将编码Aer毒素的基因(结构基因)称为AerA,而将具有调控表达和活性的AerA的上位和下位基因区域分别称为AerC和AerB。本研究通过从分子生物学水平对嗜水气单胞菌的结构基因(hlyA)进行分析,并在原核生物大肠杆菌中进行融合表达,成功构建了嗜水气单胞菌溶血素基因A片段的克隆载体pGEMtTHA和重组表达载体pETTHA。体外表达产物经8次免疫小白鼠后,制备了溶血素抗血清。Western-blot试剂盒检测纯化蛋白结果表明:重组溶血素作为抗原免疫能使小鼠产生特异性的抗体,为溶血素C片段的研究奠定了良好的基础。重组溶血素的大量纯化和抗体的大量制备有利于嗜水气单胞菌溶血素的深入研究。1嗜水气单胞菌溶血素A片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达以嗜水气单胞菌TPS30的基因组DNA为模板,以Genbank中已报道的嗜水气单胞菌AHTPS30HEM(accession NO. AB021152)的基因序列设计引物,应用PCR技术扩增出国内分离株AhTPS30的溶血素1482bp的结构基因片段序列,将其克隆到pGEM-T easy载体上,成功构建了嗜水气单胞菌溶血素基因A片段的克隆载体pGEMtTHA,经过比对其序列结果显示:与Genbank中报道的基因序列同源性达到了98%。将此基因片段克隆入pET32a(+)载体上,成功构建成重组表达质粒pETTHA,并在大肠杆菌BL21(DE3)中,经终浓度0.1mM的IPTG诱导培养重组表达菌,30℃诱导前培养2h,诱导培养3h,经菌体裂解外源基因表达产物的SDS-PAGE分析。结果显示:重组表达菌的裂解产物与对照菌相比出现了一条新的表达带,大小与经DNA TOOLS分析的外源核苷酸融合蛋白的理论推导值68 kD相符。且超声裂解后的产物电泳结果显示:嗜水气单胞菌能在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,且均是以非天然的包涵体形式出现。2嗜水气单胞菌溶血素A片段体外重组表达蛋白的纯化及其免疫学特性确定了重组表达菌表达的包涵体样品用2M的尿素洗涤,再经8M尿素进行溶解处理效果较好。按照His·Bind蛋白纯化试剂盒纯化融合蛋白,取得了满意的效果。Western-blot试剂盒检测纯化蛋白结果说明:经外源表达的重组溶血素能被鼠抗溶血素血清抗体识别,重组菌表达的溶血素能作为抗原刺激小鼠产生特异性的抗体,为溶血素C片段的研究奠定了良好的基础,重组溶血素的大量纯化和抗体的大量制备有利于嗜水气单胞菌溶血素的深入研究。
白雪梅[5]2011年在《林蛙嗜水气单胞菌气溶素基因原核表达及免疫原性的初步分析》文中进行了进一步梳理林蛙“红腿病”是危害林蛙养殖业的主要疾病之一,该病传播快、死亡率高,对林蛙的养殖业的危害严重。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila, AH)是林蛙“红腿病”的主要致病菌。该菌的致病力与毒力因子关系密切,尤其是气溶素(Aer)。气溶素由463个氨基酸组成,分子质量为51.5 ku,是嗜水气单胞菌主要的毒力因子之一,具有溶血性、细胞毒性和肠毒性。该菌的血清型多,在不同的地区、不同的宿主都有所差异,这对灭活苗的使用造成了很大的限制。找出不同血清型菌株共同的保护性抗原,研制出新型亚单位疫苗是现在研究的迫切需求。本试验根据GenBank上报道的嗜水气单胞菌气溶素基因序列(NCBI登录号：DQ186611),针对该基因的保守区,设计了一对扩增气溶素基因的特异性引物,以从林蛙体内分离的嗜水气单胞菌基因组DNA为模版,用PCR方法扩增目的片段,将该基因克隆pMD18-T载体上,经PCR、酶切及序列测定的鉴定和分析,结果表明成功地克隆了1163 bp的林蛙嗜水气单胞菌气溶素基因,对所克隆的气溶素基因序列与基因库中已发表的DQ186611进行比较分析同源性高达99%。再将该基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,经PCR鉴定及酶切鉴定,证明成功地构建了原核表达载体pGEX-Aer。将构建好的原核表达载体,经1 mmol/L的IPTG诱导,在大肠杆菌BL21中进行表达,经过8 h表达量达到最高。该融合蛋白pGEX-Aer的分子量约为69 ku,表达蛋白主要以包涵体形式存在。经Western blotting免疫印记分析,该融合蛋白具有较好的反应原性。将表达蛋白经亲和层析纯化后免疫小鼠,.应用间接ELISA和淋巴细胞增殖试验(MTr)来检测体液免疫和细胞免疫水平。结果表明,表达蛋白能够刺激机体产生较好的体液免疫及细胞免疫水平。证明该融合蛋白具有较好的抗原性,为林蛙嗜水气单胞菌疫苗的研制提供了前期工作。
饶静静[6]2007年在《嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌多重PCR检测方法的建立与应用》文中提出嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是多种水产动物的主要致病菌，还是引发食源性疾病的重要病原菌。研究表明，嗜水气单胞菌可引起人的急性胃肠炎、败血症及伤口感染、中耳炎、腹膜炎等。目前，在国外已将嗜水气单胞菌纳入腹泻病原菌的检测范围，是食品卫生检验的对象；迟钝爱德华氏菌是人鱼共患的条件致病菌。因此，嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌不仅对养殖生产是一种威胁，对人的健康也是一种潜在危险，检测水产动物及食品中嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌具有重要的实际意义。研究资料表明，嗜水气单胞菌的致病性与气溶素基因(aerA)、溶血素基因(hlyA)密切相关，这也是用于鉴别致病株与非致病株的关键因素；谷氨酸脱羧酶基因(gadB)是迟钝爱德华菌七个毒力基因(orfA、citC、fimA、gadB、katB、mukF和ssrB)之一，只存在于致病菌株中而不存在于非致病菌株中。本文在扩增上述毒力基因的基础上，建立了鉴定致病性嗜水气单胞菌的多重PCR方法和能同时检测致病性嗜水气单胞菌与迟钝爱德华氏菌的多重PCR方法，并用该方法及常规的微生物学方法对送检样品和水产养殖场水样进行了检测。试验Ⅰ根据GenBank中登录的相应基因序列设计并合成叁对特异性引物，扩增嗜水气单胞菌aerA、hlyA基因和迟钝爱德华氏菌gadB基因，克隆后送交TaKaRa公司测序，与GcnBank中提交的相应核苷酸序列进行同源性比较。结果发现aerA、hlyA和gadB这叁个基因与GenBank中提交的相应核苷酸序列都有较高的同源性，其中aerA基因的核苷酸序列与AF539467参考株的同源性最高，达到99．8％；hlyA基因的核苷酸序列与AF146599参考株的同源性最高，达到97．9％；gadB基因的核苷酸序列与AY078505参考株的同源性最高，达到87．1％．说明所设计的引物具有较高的特异性和可靠性，为建立多重PCR方法奠定了基础。试验Ⅱ根据试验Ⅰ设计的引物扩增aerA、hlyA基因，再辅以气单胞菌属所特有的内参照基因16s rRNA，进行多重PCR反应体系优化、多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性试验，试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测，结果显示非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA，而致病性分离株则至少含有hlyA基因；对40份送检的水产动物病料进行多重PCR检测，结果与常规微生物学检测符合率为97．5％。该方法具有较高的敏感性与特异性，可检测最低10 ng的模板。该试验建立的方法可快速检测水产动物及食品中的致病性嗜水气单胞菌。试验Ⅲ根据试验Ⅰ设计的引物扩增aerA、hlyA和gadB基因，进行多重PCR反应体系优化、特异性和敏感性试验，试图建立一种可同时用于嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌检测的多重PCR方法。对7株嗜水气单胞菌分离株和3株迟钝爱德华氏菌分离株进行多重PCR检测，结果显示非致病性分离株均未扩增出相关毒力基因，而致病性嗜水气单胞菌分离株则至少含有hlyA基因，致病性迟钝爱德华氏菌含有gadB基因；对40份送检的水产品样品及12份养鳗场取的样品进行多重PCR检测，结果与常规微生物学检测符合率分别为100％(爱德华氏菌)和98．1％(嗜水气单胞菌)。该方法具有较高的敏感性与特异性，最低可检测到10~(-9)g(ng)级。该方法的建立对水产动物感染致病性嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌的快速诊断和分子流行病学的调查有重要意义。试验Ⅳ从福建省某养鳗厂的养殖池水体中分离出一株病原菌，该菌为革兰氏阴性短杆菌，运动力阳性，氧化酶阳性，产生吲哚，葡萄糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、阿拉伯糖、七叶灵、V-P阳性，根据菌落形态、生化特性及试验Ⅱ建立的多重PCR方法，最后鉴定为嗜水气单胞菌。致病性试验结果显示该分离菌具有较强的致病性，均能致死小白鼠和鳗鱼。药敏试验结果表明，该菌对卡那霉素、氯霉素和呋喃唑酮、氧氟沙星、环丙沙星等喹诺酮类药物极为敏感。试验Ⅴ进行了对喹诺酮类药物敏感的嗜水气单胞菌DNA旋转酶A亚单位(gyrA)基因的原核表达。喹诺酮类药物是通过影响gyrA所催化的DNA超螺旋反应过程中DNA裂解和重新组合步骤，从而阻断细菌DNA复制，达到抑菌和杀菌目的，当gyrA基因发生突变后往往意味着细菌对喹诺酮类药物抗性的产生。本试验根据GenBank中登录的gyrA基因序列设计引物，运用PCR扩增出与预期大小相符的基因片段。将此基因片段克隆至质粒pET30a(+)的EcoRI和XhoI位点，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导获得高效表达，用Ni-NTA纯化目的蛋白，SDS-PAGE蛋白电泳表明在约28．0 kD处出现特异带，与理论推断值相符。经扫描定量分析，纯化后的融合蛋白纯度达到79．2％。gyrA基因蛋白的高效表达为其耐药性的分子机理研究奠定了基础。
王帅兵, 熊良伟, 朱善元, 于生兰, 徐建生[7]2012年在《嗜水气单胞菌Aer毒素和胞外蛋白酶卵黄抗体的制备》文中认为为克服嗜水气单胞菌不同血清型对卵黄抗体免疫保护效果的影响,从嗜水气单胞菌中提取其主要致病因子Aer毒素和胞外蛋白酶(ECPase),验证其生物学活性,分别免疫蛋鸡。用辛酸-硫酸铵法粗提卵黄抗体,用间接ELISA法测其效价、鉴定抗体与不同来源嗜水气单胞菌主要致病因子的交叉反应。结果表明,抗Aer毒素和抗ECPase卵黄抗体效价最高分别可达1∶213和1∶212,与其他来源嗜水气单胞菌交叉反应性强。
庄培德[8]2007年在《嗜水气单胞菌主要粘附素基因克隆表达及其产物特性分析》文中提出从鳗源嗜水气单胞菌ZN1克隆到其主要粘附素基因(maior adhesin gene，Mah)。该基因开放阅读框为1074bp，编码357个氨基酸，推导的蛋白分子量为39.606kDa，前22个氨基酸残基构成一明显疏水信号肽。DNA序列分析比较表明ZN1主要粘附素基因与其它嗜水气单胞菌主要粘附素基因同源率约为70％，在系统进化树中，属于嗜水气单胞菌主要粘附素基因的一个新亚群。将Mah重组到pET-32a表达载体中并转化E．coliDE3(BL21)，获得高效表达。表达产物验证与功能分析结果表明：(1)ELISA结果显示鼠抗ZN1主要外膜蛋白血清能识别表达产物Mah-TrxA(硫氧还蛋白与主要粘附素形成的融合蛋白)及野生型菌株ZN1表达的主要外膜蛋白(含主要粘附素)，抗体滴度分别达到1∶3200和1∶12800；鼠抗Mah-TrxA融合蛋白血清可识别Mah-TrxA及野生型菌株ZN1表达的主要外膜蛋白，抗体滴度分别到达1∶12800和1∶1600；(2)免疫印迹显示鼠抗ZN1主要外膜蛋白血清能识别Mah-TrxA和野生菌主要外膜蛋白的相关条带；鼠抗Mah-TrxA血清可识别Mah-TrxA和其它5种不同血清型野生型嗜水气单胞菌主要外膜蛋白的相关条带；(3)Mah-TrxA的功能分析表明ZN1主要外膜蛋白、Mah-TrxA和兔抗Mah-TrxA血清能显着抑制或阻断菌ZN1粘附于EPC细胞的能力，但都不能完全抑制或阻断ZN1对EPC细胞的粘附；(4)以Mah-TrxA经腹腔免疫欧洲鳗鲡，接种30天后，免疫欧洲鳗鲡可抵抗1×10~7cfu野生型ZN1的攻击，免疫保护率达87.5％。以上结果表明：通过基因工程技术以融合蛋白形式表达的嗜水气单胞菌主要粘附素与野生菌株ZN1表达的主要粘附素生物学活性相类似，且具有良好的免疫原性，可诱导动物产生特异性抗体和免疫保护力；免疫印迹试验结果提示不同血清型嗜水气单胞菌主要粘附素的抗原性高度相关，主要粘附素可能是不同菌株之间的共同抗原成份。本研究成功地克隆、表达了嗜水气单胞菌Mah基因，较为系统地分析了表达产物的生物学特性和功能，进一步揭示了嗜水气单胞菌产生粘附作用的本质因素，以及主要粘附素在侵入宿主和诱导宿主产生免疫保护过程中的功能和作用，为嗜水气单胞菌病的有效防治提供有价值的研究资料。
肖丹[9]2011年在《射阳盐场地区鲫源嗜水气单胞菌分子流行病学研究》文中认为细菌性败血症是银鲫的主要病害之一,此病流行时间长、流行地域广、危害性大,给银鲫养殖户带来了巨大的经济损失。本研究于2009年5月至2010年10月间对射阳盐场地区银鲫细菌性败血症的流行情况进行了调查,并对病原菌进行了分离鉴定,通过分子生物学方法对其进行基因分型,研究其与菌株致病能力及抗原性的关系,以期为银鲫细菌性败血症防控措施的制定奠定基础。本研究主要分为以下4个部分。1射阳盐场地区银鲫细菌性败血症流行病学调查及病原菌分离鉴定2009年5月-2010年10月对射阳地区银鲫细菌性败血症于20℃-34℃开始流行,29℃-33℃为发病高峰,主要危害0.2-0.4kg的当年鱼种及成鱼,分慢性型与急性型两种发病类型,水体中水温、溶氧的变化及较高的亚硝酸盐含量会使疾病病情恶化;从自然患病鱼体上共分离了17株病原菌,鉴定均为致病性嗜水气单胞菌; 17株病原菌生化表型、致病性间存在差异。17株病原菌耐药性严重,对阿莫西林、多西环素、氟苯尼考、土霉素等药物完全耐药;对左氟沙星、恩诺沙星、罗红霉素、新霉素、庆大霉素、复方新诺明、磺胺二甲嘧啶、多粘菌素等药物不同程度耐药。2鲫源嗜水气单胞菌的ERIC-PCR分型方法建立及应用本实验建立了一套嗜水气单胞菌ERIC-PCR分子分型方法,并对PCR体系、反应条件等关键点进行了优化,该方法稳定性好、可有效区分菌株遗传学背景的差异,适用于嗜水气单胞菌分子流行病学研究;用所建立的方法对2009-2010年射阳地区分离的17株致病性嗜水气单胞菌分离株及7株本实验室保藏的分离与其他地区的嗜水气单胞菌进行检测发现,24株鲫源嗜水气单胞菌可聚为3类,分别用A、B、C型表示。其中14株射阳地区分离株与江西株S2、浙江株BSK-10、广东株S3及80916同为B型,其余3株分离株基因型与浙江株H-1同为A型,说明射阳地区与这些地区可能存有致病性嗜水气单胞菌输出或输入现象;本研究还发现,从同一病例中分离的多株致病性嗜水气单胞菌株基因型存在差异,从同一发病池塘不同时间发病病例中分离的致病性嗜水气单胞菌株基因型间存在差异。3鲫源嗜水气单胞菌毒力因子分布及其与基因型的关系本实验建立了一套致病性嗜水气单胞菌5个主要毒力基因多重PCR检测方法,并对PCR体系、反应条件等关键点进行了优化,该方法特异性强、敏感性高、反应结果清晰且易判断,适用于大量样本的快速检测。用所建立的方法对2009-2010年射阳地区分离的17株致病性嗜水气单胞菌进行检测发现,不同菌株间5种毒力基因的携带情况存有差异,毒力基因型为aer+hly+alt+ahp+act+的菌株最多。此外,本研究发现菌株致病力与菌株毒力基因携带情况存在联系,毒力基因组成为aer + hly + alt +ahp +act+菌株毒力高于毒力基因缺失株,可能是急性型细菌性败血症的致病株,而毒力缺失株可能会导致慢性型的细菌性败血症;17株鲫源致病性嗜水气单胞菌分离株的致病力及毒力基因携带情况与ERIC-PCR基因型存有一定的关系,毒力基因型aer+hly+alt+ahp+act+的嗜水气单胞菌分离株ERIC-PCR基因型均为B型具有急性毒性,ERIC-PCR基因型为A型的嗜水气单胞菌分离株的5个毒力基因均有不同程度的缺失,毒性较弱。这表明B型嗜水气单胞菌多可能为强毒株,有必要加强对此类菌株的监测及防控,避免此类强毒株在大范围内流行。4鲫源嗜水气单胞菌抗原性及其与基因型的关系本实验通过研究17株鲫源嗜水气单胞菌的ERIC-PCR基因型与免疫原性进行研究,发现各菌株对同种基因型菌株交叉凝集效价显着高于对不同基因型间菌株的交叉凝集效价,说明ERIC-PCR基因型与菌株免疫原性间存一定关系,ERIC-PCR方法经标准化后可以传统克服血清分型法受到标准菌株限制、存在大量不可分型株、实验室间难以比较等缺点,成为嗜水气单胞菌疫苗株的筛选分析的新途径,为嗜水气单胞菌多价疫苗、亚单位疫苗的开发及疫苗预期效果评价奠定基础。
吴海波[10]2008年在《防治鱼类细菌性疾病复合型蛋黄粉的研制》文中进行了进一步梳理伴随着渔业的迅猛发展,鱼类细菌性疾病成为鱼类最严重的一大类传染性疾病,造成了巨大的危害和经济损失,防治策略主要有药物防治、免疫防治和抗病育种。与畜禽传染病的防治相比,我国鱼病防治研究明显落后。在理论上,鱼的抗病育种具有一劳永逸的效果,但这是一个漫长的过程,也难以获得对多种疾病具有抗性的品种。既无行之有效的水体环境控制策略和措施,也无效果显着和易于推广的疫苗,因此形成对化学药物和抗菌素的过分依赖,它们的长期、大量和盲目使用,不仅导致病原体耐药性的产生、防治效果日益降低,而且已形成严重的水环境污染和水产品中有害物质的大量残留,严重威胁着人类健康。因此,只有大力开发和合理使用水产专用药物,才能更有效地防治水产动物疾病,保护人类自身的健康和安全。鸡卵黄抗体(IgY)作为一种免疫球蛋白,和血清抗体(IgG)的功能相似,且生产成本较低,易大量生产,不会带来耐药和药物残留等一系列问题,有望开发为一类可替代抗生素的高效生物防治制剂。本研究对若干鱼类主要病原菌及其致病性进行验证后,对各抗原之间的交叉反应性进行了研究,还比较了IgY的四种提取方法以及酶联免疫吸附试验(ELISA)与微量凝集反应(MA)两种检测方法。结果表明,各菌株之间几乎不能交叉反应,通过比较,IgY的最佳提取方法被确定,并决定采用微量凝集反应作为检测IgY的方法。在此基础上用微量凝集法定期检测由不同免疫程序获得的IgY效价并制定效价曲线,结果显示,有的抗原之间有免疫竞争或抑制现象,用叁联苗免疫产蛋鸡四次比较好。为了研究蛋黄粉的生物学活性,用喷雾干燥法把多免后的高效价蛋黄液制成蛋黄粉,由蛋黄粉IgY的凝集效价以及抑菌试验结果表明,喷雾干燥对IgY的效价和生物学活性基本不造成影响,凝集效价是24的含特异性抗体的卵黄水溶性组分(WSF)做625倍稀释后仍产生50%的相应抑菌效果,可见,蛋黄粉能有效地抑制相应细菌的生长与繁殖;对喷雾干燥工艺进行了非指定性细菌灭活试验,结果显示,该工艺能有效的灭活细菌;动物试验方面,用制备的高价蛋黄粉定期适量地投喂鲫鱼,确定了其安全性、可口性,并能增强鱼的抵抗力和产生一定特异性保护力,凝集效价是26的卵黄粉对1倍和2倍最小致死剂量的相应致病菌可分别产生90%和75%的保护效果,证实了高效价卵黄粉防治鱼类细菌性疾病的临床应用前景。另外,从各嗜水气单胞菌菌株提取了Aer毒素和ECPase,对他们及其生物学活性进行了验证。然后,设计不同的试验组,并用溶血抑制、溶蛋白抑制试验和微量凝集试验来检测并制备IgY效价曲线,结果显示,不同菌株的Aer毒素和ECPase能分别交叉抑制溶血和溶蛋白反应,可弥补菌株之间几乎不能交叉反应的缺陷,并进一步增强IgY的作用,而且叁者之间之间不会相互抑制抗体的产生,都能产生较高水平抗体。为复合强化型全蛋粉的研制与应用奠定了基础。
参考文献：
[1]. 嗜水气单胞菌Aer毒素的表达与抗原性分析[D]. 李莲瑞. 中国人民解放军军需大学. 2003
[2]. 嗜水气单胞菌重组Aer毒素的纯化和抗原性分析[J]. 李莲瑞, 卢强, 刘明远, 付宝权, 韩文瑜. 云南农业大学学报. 2005
[3]. 嗜水气单胞菌耐药性分析及气溶素抗血清的免疫保护性研究[D]. 杜娜. 华中农业大学. 2013
[4]. 嗜水气单胞菌溶血素A片段基因的克隆、表达及其产物的免疫学特性[D]. 赵秀敏. 扬州大学. 2007
[5]. 林蛙嗜水气单胞菌气溶素基因原核表达及免疫原性的初步分析[D]. 白雪梅. 延边大学. 2011
[6]. 嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌多重PCR检测方法的建立与应用[D]. 饶静静. 南京农业大学. 2007
[7]. 嗜水气单胞菌Aer毒素和胞外蛋白酶卵黄抗体的制备[J]. 王帅兵, 熊良伟, 朱善元, 于生兰, 徐建生. 江苏农业学报. 2012
[8]. 嗜水气单胞菌主要粘附素基因克隆表达及其产物特性分析[D]. 庄培德. 福建农林大学. 2007
[9]. 射阳盐场地区鲫源嗜水气单胞菌分子流行病学研究[D]. 肖丹. 上海海洋大学. 2011
[10]. 防治鱼类细菌性疾病复合型蛋黄粉的研制[D]. 吴海波. 扬州大学. 2008
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