地钱遗传转化体系的建立及芥子油苷代谢工程的初探

论文摘要

地钱(Marchantia polymorpha L.)属于苔藓植物,在世界各地均有所分布,常见于我国的北部及西北部地区。地钱具有基因组低冗余、遗传转化简便、可无性繁殖及细胞悬浮培养增殖速度快等特点,因此地钱作为生物反应器在理论和技术上均具有很大的潜力。由于地钱具有和高等植物一致的真核表达系统,因此在生产来源于高等植物的次生代谢产物或蛋白质时具有一定的优势。芥子油苷是一种含硫的次生代谢产物,在植物受到外界病原菌或者机械性损伤时,体内的组织被破坏,使得芥子油苷和黑芥子酶充分接触,然后芥子油苷被水解,这些水解产物具有许多的生物活性。对于植物来说,这些水解产物可以作为信号分子促使植物进行防御反应抵抗病原菌和害虫;对人类来说,可用于预防及治疗癌症,也可用于生产生物杀虫剂和杀菌剂。吲哚族芥子油苷是一类来源于色氨酸的芥子油苷,其降解产物具有抑制肿瘤活性及治疗结肠癌等功效。尽管吲哚族芥子油苷及其降解产物对人类非常有益,但是在植物中含量却很少,因此利用代谢工程方法生产芥子油苷具有重要的研究意义。本研究拟利用地钱作为生物反应器,进行芥子油苷代谢工程的初探。建立并优化了地钱的组织培养及遗传转化体系,并对吲哚族芥子油苷代谢工程策略进行了初步设计,探讨了地钱作为生物反应器的优势和可行性,为开发新的高效生物反应器及芥子油苷的生物合成提供理论和技术参考。本论文主要研究结果如下:成功的对野生地钱进行驯化,建立并优化了地钱的组织培养体系。对地钱遗传转化效率的影响因素进行优化,确定最佳的遗传转化体系为:在含有1%蔗糖的1/2B5培养基上,对地钱胞芽进行1 d的预培养,用添加0.01%Tween 20的农杆菌转化缓冲液浸泡10 min,在黑暗环境下与农杆菌共培养3 d,用50 mg/mL的卡那霉素进行2周的筛选,待存活的叶状体长出胞芽后,用10 mg/mL的卡那霉素进行筛选,获得抗性胞芽。利用报告基因比较了外源启动子CaMV35S和地钱内源启动子MpEF1α的驱动效率。完成了吲哚族芥子油苷代谢途径基因的克隆及植物表达载体的构建。设计了以地钱为生物反应器进行芥子油苷代谢工程的初步策略。

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摘要

英文摘要

1 前言

1.1 芥子油苷的研究进展

1.1.1 芥子油苷简介

1.1.2 吲哚族芥子油苷研究进展

1.1.3 人工合成吲哚族芥子油苷的意义

1.2 生物反应器

1.3 地钱

1.3.1 地钱的简介

1.3.2 地钱的生活史

1.3.3 地钱作为生物反应器的优势

1.4 地钱的研究进展

1.4.1 愈伤组织的诱导

1.4.2 叶状体的再生

1.4.3 胞芽的获得

1.4.4 孢子的获得

1.5 地钱的遗传转化

1.5.1 地钱悬浮细胞的转化

1.5.2 地钱孢子囊及孢子的转化

1.5.3 地钱叶状体和胞芽的转化

1.6 植物表达载体的构建

1.7 细胞悬浮培养

1.8 研究内容与目的意义

1.9 研究内容与技术路线

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌种与质粒

2.1.3 生化试剂

2.1.4 培养基

2.1.5 实验仪器和设备

2.2 实验方法

2.2.1 地钱的组织培养

2.2.2 35 S::GUS原核表达载体

2.2.3 35 S::GUS根癌农杆菌介导的地钱的遗传转化

2.2.4 35 S::GUS转基因株系的染色观察

2.2.5 MpEF1α启动子的克隆

2.2.6 MpEF1α::GUS植物表达载体的构建

2.2.7 根癌农杆菌介导的地钱的遗传转化MpEF1α::GUS

2.2.8 MpEF1α转基因株系的染色观察

2.2.9 农杆菌介导地钱的遗传转化体系因素的确定

2.2.10 吲哚族芥子油苷代谢途径基因克隆

3 结果与分析

3.1 地钱组织培养

3.1.1 地钱外植体消毒与再生

3.2 植物表达载体的构建

3.2.1 35 S::GUS载体鉴定

3.2.2 MpEF1α::GUS表达载体的构建

3.3 地钱遗传转化体系的优化

3.3.1 卡那霉素浓度的筛选

3.3.2 外植体的选择

3.3.3 共培养光照环境的优化

3.3.4 预培养时间的优化

3.3.5 表面活性剂的优化

3.3.6 培养基和蔗糖的优化

3.3.7 侵染时间的优化

3.3.8 优化后的地钱的遗传转化过程

3.4 启动子驱动效率的比较

3.5 吲哚族芥子油苷代谢工程

3.5.1 拟南芥吲哚族芥子油苷代谢途径基因克隆

3.5.2 吲哚族芥子油苷代谢途径基因表达载体构建策略

3.6 吲哚族芥子油苷体外合成实验整体设计思路

4 讨论

4.1 转化受体的选择对地钱转化效率的影响

4.2 预培养对地钱遗传转化的影响

4.3 共培养光照环境对地钱遗传转化的影响

4.4 表面活性剂对地钱遗传转化的影响

4.5 培养基和蔗糖对地钱遗传转化的影响

4.6 侵染时间对地钱遗传转化的影响

4.7 筛选压力和方法对地钱遗传转化的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王晶莹

导师: 李晶,魏琪

关键词: 地钱,组织培养,芥子油苷,根癌农杆菌,生物反应器

来源: 东北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 东北农业大学

分类号: Q943.2

总页数: 73

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