与猪瘟病毒NS5B蛋白互作的宿主蛋白galectin-1对猪瘟病毒复制的影响

论文摘要

猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种猪的流行性疾病。该病的典型临床症状为高热,组织器官出血、阻塞和坏死,周身多发性小出血点,繁殖障碍等。CSFV是一种单股正链RNA病毒,NS5B蛋白是CSFV的非结构蛋白,它具有依赖于RNA的RNA聚合酶活性（RNA dependent RNA polymerase,RdRp）,在病毒复制的过程中发挥重要作用。研究NS5B蛋白和宿主细胞蛋白之间的相互作用,可以为了解CSFV的感染,认识NS5B蛋白在其感染过程中发挥的作用提供有效工具。在实验室前期的研究中,用含有CSFV NS5B基因构建的诱饵质粒与猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophages,PAM）cDNA文库进行酵母双杂交,成功筛选到了与CSFV NS5B蛋白相互作用的半乳糖凝集素-1（Lectin galactoside-binding soluble 1,LGALS 1/galectin-1）。galectin-1在细胞内和细胞外都具有很多功能,比如在机体内诱导细胞凋亡,通过调节炎症发生及免疫反应等来抵御外界病原微生物的入侵,还可以影响肿瘤的发生、细胞的黏附、细胞之间信号的转导等。galectin-1可以通过与蛋白或多糖之间相互影响来发挥其功能。本研究通过将CSFV NS5B基因片段克隆含有冷启动子的pCold-SUMO原核表达载体构建了重组质粒,转化Rosetta（DE3）大肠杆菌表达菌,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,成功地将重组蛋白在上清中表达。采用镍柱亲和层析法（NiNTA）进行纯化以获得纯度较高的蛋白,纯化得到的蛋白免疫小鼠以制备抗NS5B的多克隆抗体,通过蛋白免疫印迹（Western blot）验证所制备多克隆抗体的反应性和特异性。发现制备的多克隆抗体可以与原核表达及真核质粒转染瞬时表达的NS5B蛋白发生反应,即通过Western blot可以检测到特异性条带,但与CSFV感染PK-15细胞后裂解所得的天然构象的NS5B蛋白不能发生特异性反应。研究发现CSFV感染的宿主细胞中galectin-1在转录水平（mRNA）和蛋白水平均出现下调。通过分别构建了galectin-1过表达和干扰稳定转染细胞系,接种CSFV后利用实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative PCR,RT-qPCR）和间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）对CSFV的转录水平及释放到上清中的病毒滴度水平进行检测。发现干扰PK-15细胞中galectin-1基因的表达可以上调CSFV的转录,过表达galectin-1蛋白下调了CSFV的转录和上清中的病毒滴度,即galectin-1具有抑制CSFV复制的生物学活性,可以为以后研发抗CSFV药物提供新的理论依据。

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摘要

ABSTRACT

主要符号对照表

文献综述

第一章猪瘟病毒及galectin-1 蛋白的研究进展

1.1 猪瘟的病原学

1.2 CSFV的分子生物学特征

1.2.1 CSFV结构蛋白

1.2.2 CSFV非结构蛋白

1.3 NS5B蛋白的研究进展

1.4 galectin-1 蛋白的研究进展

1.4.1 galectin蛋白的分类

1.4.2 galectin-1 蛋白的结构特点

1.4.3 galectin-1 蛋白的分布及其功能

1.4.4 galectin-1 蛋白与病毒的相互作用

1.5 本研究的目的及意义

试验研究

第二章猪瘟病毒NS5B蛋白多克隆抗体的制备

2.1 材料

2.1.1 主要试剂

2.1.2 实验仪器和设备

2.2 方法

2.2.1 引物设计

2.2.2 基因的克隆

2.2.3 基因的亚克隆

2.2.4 NS5B基因原核表达载体的诱导表达及鉴定

2.2.5 NS5B蛋白的大量表达与纯化

2.2.6 动物免疫

2.2.7 ELISA检测抗体效价

2.2.8 Western blot鉴定多克隆抗体

2.2.9 真核细胞表达NS5B蛋白的Western blot

2.3 结果

2.3.1 NS5B基因的PCR扩增、克隆载体的构建及鉴定

2.3.2 pCold-SUMO-NS5B表达载体的构建及鉴定

2.3.3 pCold-SUMO-NS5B的诱导表达

2.3.4 pCold-SUMO-NS5B蛋白的表达及纯化

2.3.5 NS5B多克隆抗体效价测定

2.3.6 NS5B多克隆抗体的反应性和特异性鉴定

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 galectin-1 蛋白对猪瘟病毒复制的影响

3.1 材料

3.1.1 主要试剂

3.1.2 载体

3.2 方法

3.2.1 galectin-1 过表达、干扰载体的构建

3.2.2 真核重组质粒的转染及表达结果验证

3.2.3 重组慢病毒包装及滴度测定

3.2.4 稳定表达galectin-1 细胞系的筛选

3.2.5 猪瘟病毒的扩增及其感染复数的确定

3.2.6 PK-15 细胞中CSFV与 galectin-1 相互影响的研究

3.3 结果

3.3.1 宿主细胞galectin-1 基因的扩增及其过表达载体的鉴定

3.3.2 慢病毒干扰载体的鉴定

3.3.3 真核表达载体转染PK-15 细胞及表达蛋白的鉴定

3.3.4 galectin-1 过表达和干扰细胞系的产生和验证

3.3.5 CSFV在 PK-15 细胞中增殖检测

3.3.6 PK-15 细胞中CSFV与 galectin-1 的相互影响

3.4 讨论

3.5 小结

结论

参考文献

致谢

个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 冯茹

导师: 王承宝

关键词: 猪瘟病毒,蛋白,多克隆抗体

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: 博士后一等资助项目(编号:2017M610659),博士后特别资助项目(编号:2018T111113)

分类号: S852.651

总页数: 64

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与猪瘟病毒NS5B蛋白互作的宿主蛋白galectin-1对猪瘟病毒复制的影响

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