沙利度胺对体外培养的人红系细胞γ-珠蛋白基因表达的作用及调控机制的研究

论文摘要

目的:研究沙利度胺对体外定向分化培养的正常人红系细胞γ-珠蛋白基因的诱导作用及调控机制,以进一步了解沙利度胺对红系细胞γ-珠蛋白基因的相关作用。方法:1.采集经粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）动员后的正常人骨髓液10mL,用淋巴细胞分离液密度梯度离心法获得单个核细胞后,再经磁珠分选CD34+造血干祖细胞,接种于本实验室已建立的二阶段体外液体红系定向分化培养体系,促进CD34+造血干祖细胞定向向成熟红细胞方向分化。用倒置显微镜观察培养细胞的基本状态。用Giemsa染色,显微镜下观察细胞形态。诱导分化期间用流式细胞仪定期检测红细胞分化特异性标志物CD235a和CD71的表达情况,以此来确定红系细胞体外培养的顺利进行。2.将终浓度设为50?mol/L、100?mol/L、200?mol/L、300?mol/L的沙利度胺（Thd）为实验组,0?mol/L为阴性对照组（NC）,100?mol/L的羟基脲（HU）为阳性对照组,分别以不同药物浓度作用于红系细胞24h、48h、72h、96h后,采用CCK-8试剂盒检测不同浓度以及不同时间作用条件下红系细胞的存活率;采用实时荧光定量PCR（Real time-PCR）检测红系细胞γ-珠蛋白基因mRNA的表达水平;通过以上两步筛选出对红系细胞最佳的药物作用浓度及时间。根据上述结果选取最佳药物作用浓度及时间后,再次采用实时荧光定量PCR进一步检测γ-珠蛋白基因及转录因子BCL11A、KLF1、KLF2、GATA1、SOX6、TAL1的表达情况,Western-Bloting检测γ珠蛋白的生成量。结果:1.红系细胞体外培养与定向分化在体外诱导正常人红系细胞分化的过程中,通过磁珠分选获得的CD34+造血干祖细胞,使用流式检测其纯度可达98%以上。在接种于红系培养体系后,随着培养时间的延长,在倒置显微镜下可见观察到较多的具有红系分化特征的橘黄色的集落形成。通过Giemsa染色镜下观察,从细胞形态学的角度也证实了CD34+造血干祖细胞逐渐由原始红细胞向早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、成熟红细胞分化。随着分化时间的延长,红系细胞表面特异性标志物CD235a与CD71双阳性表达最高可达80%以上。2.CCK-8检测沙利度胺和羟基脲对细胞存活率的影响各药物作用的浓度和时间对红系细胞存活率存在交互作用（F=10.725,P=0.000）,其时间（F=92.092,P=0.000）,浓度（F=309.847,P=0.000）随着沙利度胺作用细胞时间的延长,红系细胞的存活率逐渐下降。在羟基脲的作用下红系细胞的存活率下降更加明显。3.沙利度胺和羟基脲的最佳作用浓度和时间的筛选通过筛选沙利度胺和羟基脲的最佳药物作用时间和浓度,结果显示γ-珠蛋白基因的表达水平同时受时间和浓度的双重影响,在不同时间（F=15.087,P=0.000）和不同浓度（F=7.035,P=0.003）的影响下,通过多重比较,γ-珠蛋白基因表达水平升高,有统计学意义,两者之间存在交互作用（F=5.906,P=0.000）。其中以72h后γ-珠蛋白基因mRNA表达升高明显,其中各组与阴性对照组比较,（F=63.76,P=0.000）,其中沙利度胺100?mol/L（P=0.001）、200?mol/L（P=0.002）、300?mol/L（P=0.004）,羟基脲100?mol/L（P=0.000）。差异有统计学意义。4.沙利度胺和羟基脲作用红系细胞72h后γ珠蛋白基因和蛋白结果再次作用红系细胞72h后,各个组与阴性对照组比较（F=73.670,P=0.000）,其中100?mol/L、200?mol/L、300?mol/L浓度的沙利度胺诱导红系细胞γ-珠蛋白基因mRNA均出现了增高,分别为（P=0.000、P=0.000、P=0.005）差异有统计学意义,羟基脲组增高明显（P=0.000）,差异有统计学意义。γ珠蛋白的生成量,以200?mol/L的沙利度胺和羟基脲的作用最明显,与阴性对照组相比（F=8.559,P=0.001）,其中200?mol/L的沙利度胺组（P=0.004）,羟基脲组（P=0.001）,差异有统计学意义。5.沙利度胺与羟基脲对转录因子BCL11A、KLF1、KLF2、GATA1、SOX6、TAL1、GATA1基因的影响终浓度为200?mol/L的沙利度胺和100?mol/L的羟基脲诱导红系细胞72小时后与阴性对照组比较,转录因子BCL11A均出现了下调,（F=6.278,P=0.034）,其中沙利度胺组（P=0.014）,羟基脲组（P=0.048）,差异均有统计学意义。与阴性对照组比较,转录因子KLF1出现了不同程度的下降,（F=5.278,P=0.048）,其中沙利度胺组（P=0.043）,差异有统计学意义。与阴性对照组比较,转录因子KLF2出现了不同程度的下调（F=9.767,P=0.013）,沙利度胺组（P=0.550）,其中羟基脲组（P=0.013）差异有统计学意义。与阴性对照组比较,转录因子SOX6（F=0.446,P=0.66）,沙利度胺组（P=0.954）,羟基脲组（P=0.430）差异均没有统计学意义。与阴性对照组比较,转录因子TAL1（F=0.26,P=0.779）,沙利度胺组（P=0.541）,羟基脲组（P=0.962）差异均没有统计学意义。与阴性对照组比较,转录因子GATA1（F=0.325,P=0.375）,沙利度胺组（P=0.409）,羟基脲组（P=0.801）差异均没有统计学意义。结论:1.本研究表明沙利度胺可诱导体外培养的人红系细胞γ-珠蛋白基因表达升高和γ-珠蛋白生成量增加,与羟基脲诱导γ-珠蛋白基因升高的效应类似。2.转录因子BCL11A、KLF1的下调可能是沙利度胺诱导红系细胞γ-珠蛋白基因表达的调控机制之一。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 方栋

导师: 赖永榕

关键词: 沙利度胺,红系细胞,珠蛋白基因,转录因子

来源: 广西医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 广西医科大学

分类号: R329.2

总页数: 82

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