王旺田[1]2004年在《抗除草剂基因克隆、表达载体构建及油菜的遗传转化》文中指出由于杂草对环境的适应性及繁殖力都比作物强，以传统的人工除草方法已不能满足生产的需要。因此，应用化学药剂除草成为除草的一种最有效，最省工的办法。随着化学除草剂，特别是一些新型高效、残效期短、无残毒的除草剂在农业上的应用，一方面大大提高了农作物的产量，但是，另一方面，由于除草剂作用机理是影响植物生理生化过程，在杀灭杂草的同时也对作物具有伤害作用，这就限制了这类除草剂的应用。利用基因工程技术可以将抗除草剂基因导入作物品种中，赋予作物抗除草剂特性，通过筛选获得抗除草剂作物品种。其研究对提高作物产量和品质，减轻农事劳动强度，扩大新型高效、残效期短、无残毒的除草剂应用具有重要的作用和意义。 本研究利用PCR技术从豌豆(Pisum satium)基因组DNA中分离了1，5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶(ribulose-1，5-bisphosphatecaboxxylase／oxygenase, RuBisCo)小亚基(rbcS)基因启动子及叶绿体定位信号肽编码序列。序列分析表明，扩增片段(1306bp)与已报道序列的相应区域同源性达98.41％，含有启动子基本调控元件TATA box与CAAT box，同时含有一个具有组织特异的核心元件，起到增强子的作用。将其与绿色荧光蛋白基因(GFP)串连在一起，构建了植物表达载体pBIRB-GFP。通过对基因枪介导法转化的烟草叶片及洋葱表皮细胞中GFP基因的瞬时表达测定表明，这一表达系统在光照条件下可显着增强GFP基因的表达。说明rbcS启动子及其叶绿体定位信号肽可实现外源基因的组织特异和光诱导特异表达，这对实现外源基因在植物中的表达具有重要的理论研究和生产实践价值。 我们从肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种(klebsiella pneu moniae subspecies ozanae)中克隆了抗除草剂溴苯腈基因——腈水解酶基因(bxn)，并从质粒pBA亚克隆了抗草丁膦的乙酰转移酶基因(bar)。通过序列分析，两个基因与已报道基因具有高度的同源性。分别将其插入微生物表达载体pE：FT-28a(+)多克隆位点，导入宿主菌E. coli BL21，通过诱导表达、蛋白提取和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分别得到42kD和24kD的特异表达蛋白分子，与预期的蛋白分子大小相符，说明克隆的bxn和bar基因结构完整。 按照载体构建设计，分别将克隆载体上的rbcS启动子、bxn基因和bar基因用相应的酶进行酶切回收，采用分步连接构建了具有rbcS启动子驱动的bxn和CaMV35S启动子驱动的bar基因双价植物表达载体pBIBAH一CRBN。 应用基因枪法和农杆菌介导法对油菜4一6日龄无菌子叶及子叶柄进行转化，通过卡拉霉素的逐步筛选，得到油菜愈伤组织，但尚未获得油菜的转化苗。 关键词::bcs启动子bxn基因bar基因瞬时表达原核表达植物表达载体遗传转化油菜
檀琮萍[2]2003年在《抗除草剂bar基因表达载体的构建及农杆菌转化的研究》文中研究说明杂草与农作物竞争水分、养料和光照，影响农作物的产量、品质，还是许多病害的中间寄主或越冬场所，通过除草剂来控制杂草已成为现代化农业不可缺少的一部分。但除草剂在消灭杂草的同时也对作物产生了伤害作用。目前，利用基因工程手段培育抗除草剂的作物品种解决了这一矛盾。 广谱、非选择性除草剂Basta的活性成分是草丁膦(Phosphinothricin)。草丁膦除草作用机理是抑制植物的氨基酸生物合成酶—谷氨酰胺合成酶(GS)，使杂草产生氨中毒。bar基因编码草丁膦乙酰CoA转移酶(PAT)，可催化草丁膦的自由氨基乙酰化，从而使除草剂草丁膦失活。而且bar基因也是迄今为止应用最为广泛的一个抗除草剂选择标记基因，克隆出bar基因对植物的遗传转化，基因表达和生理学研究都有重要的作用。 本实验从抗除草剂转基因Bobwhite小麦中，利用PCR克隆的方法扩增出bar基因全长，并在原核表达系统中表达，鉴定表达蛋白的活性，将能够正确编码PPT乙酰转移酶的bar基因片段，经过适当的修饰构建入真核表达载体。并将此构建的真核表达载体转化农杆菌获得工程菌，为基因转化及农杆菌转化做了前提工作。并对农杆菌转化小麦体系作了初步的研究，为选育出适宜在安徽麦区种植的高产、优质、抗除草剂小麦新品种做了基础工作。本实验研究结果表明： 1．利用PCR方法对已知序列基因的克隆是简单有效的方法，但很多因素影响PCR的特异性，其中退火温度起着关键性作用。本实验采用了高保真pfu DNA聚合酶，在退火温度61℃条件下从转基因Bobwhite品种基因组DNA中扩增出特异性片段，将此片段插入克隆载体pGEM-7fz(+)，经测序和序列分析表明，所扩增得到的片段含有bar基因完整的读码框，并且序列与GenBank中发表的序列完全一致。 2．选用pET32a表达载体和BL21trxB(DE3)宿主菌的原核表达系统，对扩增得到的片段进行表达鉴定。经IPTG诱导表达的融合蛋白的分子量39.6kDa，目的片段表达蛋白分子量20.1kDa，与预计的分子量20.0kDa相符。并且表达的蛋白酶(PAT)经DTNB比色法鉴定，具有酶活性。 3．为了目的基因在真核生物中有效的翻译和表达，通过PCR方法对bar基因起始密码子ATG旁侧序列进行改造。改造后的目的基因克隆于真核表达载体pBI121，构建表达载体pBI121-bar，通过叁亲杂交法将真核表达载体pBI121-bar 转入农杆菌LBA4404，成功构建出工程菌。4．小麦离体培养中，基因型、培养基激素浓度与外植体类型是影响小麦胚性愈 伤组织诱导和再生频率的3个主要因素。基因型的影响主要影响到胚性愈伤组 织的发生频率，以幼胚为外植体杨麦87158可以达到sl．35％，而安农92484 只能达到 16．sl％。在所试的品种中对于成熟胚在 2，4D质量浓度为 4．omg／L 时出愈率和胚性愈伤组织诱导率达到最大值，而对于幼胚不同品种表现有所差 异，其中杨麦871 58和安农98005在2，4＊浓度为2．omg几时胚性愈伤组织诱 导率最高，而安农92484则是在4．omg几时效果较好。同时研究表明不同外植 体不仅影响到出愈率，更主要影响胚性愈伤组织的形成。5．在转化后抗性愈伤组织筛选中，适应的PPT筛选浓度为3刀mg几，Cef有效抑 菌浓度为 200pg／ml，乙酚丁香酮有效诱导浓度为 100pmol几，0．5％表面活性剂 Tween20，可以使GUS染色均匀，但并不是T－DNA转移所必需，盐的浓度对 T－DNA转移影响不大。
吴学莉[3]2013年在《抗除草剂基因DsALS转化拟南芥和甘蓝型油菜的研究》文中进行了进一步梳理油菜(Brassica napus)是我国继大豆之后的第二大油料作物,提高油菜的产量和品质具有十分重要的意义。杂草是制约油菜生产的主要因素之一,严重降低油菜的产量和品质。目前,利用化学除草剂是清除农田杂草的主要方法,但是它在杀死杂草的同时也对农作物的生长造成了一定的影响。为了改良油菜抗除草剂的遗传特性,本研究采用下胚轴作为外植体,通过农杆菌介导法将抗除草剂的乙酰乳酸合成酶基因转入甘蓝型油菜中双9号和甲572,获得了转基因植株,为选育抗除草剂的油菜品种提供了育种材料。本研究的结果如下：1.从播娘蒿野生型和两个抗苯磺隆除草剂的天然突变体中克隆了ALS基因(分别命名为DsALS-1、DsALS-97、DsALS-108),经测序分析后与拟南芥中ALS序列进行比对,发现DsALS-97和DsALS-108序列中的197位的脯氨酸被分别替换为丝氨酸和苏氨酸,这种突变会对ALS抑制剂产生抗性,而在DsALS-1序列中不存在相应的突变。2.将克隆的叁个DsALS基因构建植物表达载体转化拟南芥,利用T3代纯合转基因植株进行抗性鉴定。转DsALS-97和DsALS-108基因的植株对苯磺隆产生抗性,转DsALS-1基因的植株不具有抗性,抗性鉴定结果与测序结果相一致。3.选用抗苯磺隆除草剂的基因DsALS-108,以Bar基因作为筛选标记基因来构建植物表达载体,采用农杆菌介导的下胚轴转化法对甘蓝型油菜中双9号和甲572进行遗传转化。以中双9号为受体获得23棵转基因植株,阳性率为12.4%；以甲572为受体获得19棵转基因植株,阳性率为22.4%。4.对T1代转基因株系随机取样提取DNA进行PCR检测,结果表明外源基因在T1代发生分离,且在转基因后代中能够稳定遗传。用RT-PCR检测分析了T1代阳性植株,从转录水平上证实了外源基因在转基因后代中能够稳定表达。5.使未转化甘蓝型油菜致死的最低苯磺隆浓度为2.5×10-3g/L。用2.5×10-3g/L、5.0×10-3g/L和7.5×10-3g/L叁个浓度对T1代株系和对照进行喷洒,未转化的对照植株死亡,转基因植株生长正常,表明转基因油菜具有很强的抗性。
王开芳[4]2015年在《油菜BnGRF2和抗草甘膦EPSPs基因克隆及植物双价表达载体的构建》文中进行了进一步梳理我国是世界最大的油菜生产国,油菜发展取得了巨大的成就。随着国际竞争日趋激烈,我国油菜生产还面临许多挑战,提高种子产量、油分含量和节约生产劳动力成为油菜育种研究的重点。生长调节因子(growth-regulating factor,GRF)作为一种转录因子对植物生长发育起着重要的调节作用。已有研究证明,油菜生长调节因子BnGRF2可提高转化的拟南芥种子含油量,同时增加粒重,但BnGRF2调控油菜的研究尚未见报道。此外,杂草危害是限制油菜产业发展的因子之一,伴随着我国农村劳动力的日益紧缺,靠人工除草已不能满足油菜生产的需求,并且增加了生产成本。因此,通过转基因手段将BnGRF2和除草剂草甘膦抗性基因EPSPs应用于油菜,研究其在甘蓝型油菜种子发育和油脂合成中的作用,为创新抗除草剂和高含油率甘蓝型油菜种质建立基础。研究取得的主要结果如下:1.种子特异性启动子Napin基因、油菜生长调节因子BnGRF2的克隆。根据已知的Napin启动子序列(ID:EF627523.1)设计引物,克隆得到Napin启动子,经比对,与已知序列相应区段同源性达到99.03%。用PlantCARE和PLACE等在线软件分析表明,该启动子区域具有胚乳表达顺式作用元件GCN4 motif和Skn-1 motif,以及脱落酸ABA响应元件ABRE这些特有的调控元件。根据报道的GRF基因序列(ID:JN831660.1)设计引物,亚克隆得到BnGRF2,经比对,与已知序列同源性达到99.0%,说明已成功克隆得到种子特异性启动子Napin基因、油菜生长调节因子BnGRF2。2.BnGRF2和EPSPs植物双价载体构建。采用酶切连接方法,首先向含有除草剂抗性基因的载体pCEPSPS中插入种子特异性启动子Napin,获得重组质粒pCENP,然再将扩增得到的NOS终止子插入pCENP,获得重组质粒pCENN,最后插入油菜生长调节因子BnGRF2,最终得到含有EPSPs和BnGRF2双价基因的植物表达载体pCEGRF。该载体可应用于油菜作物的遗传改良。
王伏林[5]2012年在《油菜籽油脂合成途径上游ACCase和PEPCase基因的克隆及功能研究》文中研究表明植物油是日常生活中的必需品,是能量聚集的自然平台,与消费者的生活息息相关。种子是植物油的主要贮藏器官,改良植物种子脂肪酸组成和提高含油量是油料作物研究的热点之一。在脂肪酸生物合成途径中,乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl CoA Carboxylase, ACCase)是其中的关键酶之一,其主要作用是催化乙酰辅酶A羧化形成丙二酰辅酶A,为脂肪酸和许多次生代谢产物的合成提供底物。另外,脂肪酸和蛋白质的合成有关,两个代谢过程均需要利用糖酵解产物磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate, PEP)这一相同底物。PEP在丙酮酸激酶作用下转化为丙酮酸,丙酮酸生成乙酰辅酶A后在ACCase作用下进入脂肪酸合成途径,而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)催化PEP合成草酰乙酸最终进入蛋白质代谢。PEPC是植物中具有多种生理功能的细胞质酶,大量研究表明PEPC参与脂肪酸调控、碳／氮吸收并与盐和干旱胁迫反应有关,但对其功能认识仍很有限,尤其是细菌型PEPC。本研究分别利用正向遗传学和反向遗传学方法研究了脂肪酸代谢过程中相关酶ACCase和PEPC基因的调控机制。由于accD基因编码的β-CT亚基是ACCase基因表达的限制因子,本研究通过在油菜籽粒中超量表达大肠杆菌异质型ACCase基因,加速乙酰CoA羧化形成丙二酸单酰CoA这一关键进程,提高油菜籽脂肪酸的起始合成能力。本研究克隆了甘蓝型油菜及近缘种中异质型ACCase的β-CT亚基accD编码基因,采用生物信息学的方法分析了氨基酸序列,构建了受种子特异表达启动子驱动的异质型大肠杆菌ACCase β-CT亚基accD基因的植物表达载体以及大肠杆菌ACCase四个亚基基因分别受种子特异性表达启动子驱动的植物串联表达载体,将这两个载体分别用于转化甘蓝型油菜“超油2号”。通过转基因油菜的半定量PCR、蛋白质、脂肪酸含量变化,研究了异质型大肠杆菌基因accD与其它叁个细胞核基因的互作对油菜脂肪酸合成的影响,为定向遗传改良油菜种子含油量建立了有效的技术体系。本研究还利用人工小RNA (artifical mRNA, amiRNA)技术敲除拟南芥细菌型Atppc4基因进行功能分析,研究该基因在脂肪酸代谢以及耐盐胁迫等方面的作用,以探讨拟南芥中细菌型Atppc4基因敲除对植物型PEPC的影响,为今后改良油菜品质提供理论依据。主要结果如下：1.以甘蓝型油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oleracea)、芥菜型油菜(Brassica juncea)和白菜型油菜(Brassica rapa)幼嫩叶片的cDNA为模板,对异质型乙酰辅酶A羧化酶p-CT亚基(羧基转移酶)的accD编码基因进行扩增,得到长度分别为1470、1470、1464和1464bp的编码序列,分别可编码489、489、487和487个氨基酸的蛋白质。白菜型油菜、芥菜型油菜和甘蓝的accD序列登录号分别为EU410075、EU410076和EU410077。结果表明来自4个油菜近缘种的accD基因高度同源,编码的蛋白质都具有相似的锌指结构和C-末端5个相同的基元,其中基元I (GSMGSVVG)和基元Ⅱ(PLIIVCASGGARMQE)在所有植物及大肠杆菌(Escherichia coli)的β-CT亚基中普遍存在。Southern杂交显示该基因在甘蓝型油菜及其近缘种的基因组中呈单拷贝。2.本研究E. coli ACCase的β-CT亚基accD (eaccD)基因与拟南芥Rubisco小亚基(rbcS)转运肽基因融合,构建以油菜Napin启动子驱动的种子特异表达载体。利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法,将该表达载体转入“超油2号”,获得了7个阳性转基因株系。RT-PCR检测其中3株的结果证明eaccD基因可在转基因株系的种子中转录,但在叶片中不转录,说明该表达载体转入油菜中能引起植株种子eaccD基因的特异表达。通过转基因与对照植株种子的油脂和蛋白质含量的比较分析,发现对照种子的平均含油量为48.01%、蛋白质平均含量为25.10%；而7个转基因株系油菜种子的平均含油量为52.08%,比对照含油量相对增加8.45%；但转基因株系的蛋白质含量则有不同程度的降低,平均比对照植株下降约6.69%。转基因油菜千粒重比对照植株有所提高。因此大肠杆菌accD基因在油菜中的表达能够增加种子重量和含油量。3.采用同尾酶反复酶切的方法,构建了拟南芥Rubisco小亚基转运肽与ACCase各亚基基因的融合串联表达载体,用A. tumefaciens介导的下胚轴转化对照品种“超油2号”。经过筛选获得了11株转化再生植株。经PCR. Southern和GUS染色检测证明4个目的基因已整合到T0再生植株油菜基因组中。T2转基因株系平均含油量为49.59%,转基因株系的含油量比对照(48.01%)提高了3.30%。4.构建了人工小RNA表达载体Atppc4-amiRNA,利用农杆菌介导花絮浸染法(in floral dip)转化拟南芥,对转基因株系进行了分子检测。在拟南芥转基因株系内检测到成熟小RNA的表达,拟南芥转基因株系根中Atppc4的表达水平明显下降,然而其它3个植物型PEPC基因Atppc1、Atppc2和Atppc3在根中的表达明显得到上调。转基因株系根中的PEPC酶活性提高了5.1倍,表明植物中细菌型和植物型PEPC基因具有互作,细菌型PEPC基因Atppc4可以调控植物型PEPC基因的表达。分析拟南芥株系和对照植株的脂肪酸含量和组分的结果表明,转基因株系和对照的脂肪酸含量和脂肪酸组分未发生明显变化。5.atppc4的下调表达提高拟南芥的耐盐能力。在非盐处理培养基上,Atppc4-amiRNA转基因株系比野生型的根系生长更慢。发现7日龄转基因株系的长度比野生型株系短29.0%,将这些植株移到含有150mM NaCl的1/2MS培养基上培养7天,转基因株系长度比野生型株系要短16.3%。说明转基因株系的根系由于Atppc4基因表达被抑制；盐处理后转基因株系根的生长能得到部分缓解,从而缩短了与野生型根长的距离。该结果说明特异性敲除细菌型Atppc4基因提高了拟南芥的耐盐性。
涂世伟[6]2012年在《甘蓝型油菜γ生育酚甲基转移酶基因（BnVET4）克隆及其遗传转化的研究》文中进行了进一步梳理油菜,属十字花科芸苔属,主要包括白菜型油菜(Brassica campestris)、芥菜型油菜(B. juncea)和甘蓝型油菜(B. napus),是世界重要的油料作物之一,也是我国主要的经济作物。随着油菜用途的不断扩大,人民需求的增加,油菜的种植面积逐年扩增,其中甘蓝型油菜因产油量高,抗寒和抗病毒能力强且稳定性好等优点而广泛种植于世界各地。近年来,随着分子生物技术的快速发展,作物的转基因研究及应用已成为研究热点,其中,油料作物油菜的转基因育种研究是较为活跃的领域之一。目前,人们已成功建立了以油菜子叶柄、下胚轴、茎段、原生质体和小孢子培养等为受体的遗传转化体系,转化方法有农杆菌介导法、基因枪法、PEG介导法、电击穿孔法、激光微束穿刺法、显微注射法、花粉管介导法和花序浸泡法等。主要涉及油菜的品质改良、抗病、抗逆、不育基因等方面的应用。油菜含有丰富的维生素E,它是一种脂溶性抗氧化剂,维生素E在人的正常生长、生育过程中起重要作用,能降低人心血管疾病和癌症的发生、提高人体免疫力、延缓人体衰老；生育酚在信号传导途径及转录过程中也扮演重要的角色；α生育酚有助于保证叶绿体氧化还原能力,维持类囊体结构和功能以及响应逆境胁迫。α生育酚是维生素E中活性及价值最高的组分,但其含量非常低,人工合成α生育酚的活性只有天然的一半,且成本较高。因此,本实验通过从油菜中克隆BnVET4基因,其功能是合成γ生育酚甲基转移酶,催化α生育酚合成。构建BnVET4基因双元超表达载体,并转化油菜,实现油菜种子中α生育酚含量的提高。基于对α生育酚合成途径的了解,本研究设计以下实验路线,取得较理想的结果。1.BnVET4基因克隆。通过对数据库NCBI检索,获得γ生育酚甲基转移酶基因BnaA.VTE4.al CDS序列,设计引物,以甘蓝型油菜浙双72叶片cDNA为模板,克隆到BnVET4基因,编码序列全长1044bp,与Genebank中已发表的VTE4序列同源性达99%。2.双元超表达载体构建。利用限制性内切酶Xba Ⅰ和Sac I对载体pCAMBIA1300和基因BnVET4进行双酶切,连接后转化大肠杆菌感受态细胞,经筛选及验证,转化农杆菌LBA4404菌株,-80℃保存备用。3.油菜遗传转化体系建立。以油菜子叶柄和下胚轴为转化受体,对外植体苗龄、潮霉素筛选浓度、农杆菌使用浓度、愈伤诱导、芽分化、根的形成等进行探索。建立了一套油菜遗传转化体系。研究表明,4-5d的子叶柄和6-7d的下胚轴再生能力最好,经1.5mg/L2,4-D(子叶柄),1.5mg/L2,4-D+0.2mg/L6-BA(下胚轴)的诱导,在含4mg/L6-BA+0.02mg/L NAA+2.5mg/L AgNO3的抗筛选培养基中分化芽,壮苗1w后移到0.1mg/L NAA或IBA培养基中生根。4.转基因植株验证。得到的抗性再生植株,首先利用PCR验证,得到12株阳性苗；取7株进行RT-PCR和Real time-PCR分析,部分植株BnVET4基因的表达水平明显提高；经Southern blot检测,目的基因整合到油菜基因组DNA中。5.α生育酚含量的测定。取BnVET4基因表达量提高最明显的转基因株的叶片,用HPLC测定维生素E组分,生育酚总量降低且α生育酚含量较非转化株低。转基因油菜T1代种子还未收获,对种子维生素E组分测定无法完成,有待后续进行。
刘双青[7]2007年在《水稻苯达松和磺酰脲类除草剂抗性基因Bel的载体构建与转化》文中提出随着水稻基因组测序计划的完成，以功能基因组学研究为标志的后基因组时代已经到来，近几年来植物功能基因组学发展相当迅速。利用诱变技术获得的水稻苯达松敏感突变体bel，经过精细定位，确定了发生突变的原因是细胞色素P450家族中的CYP81A6起始密码子下游1332bp的地方发生了单碱基G的缺失，使该基因的编码区域发生了移码突变，产生了一个提前终止子。氨基酸序列的改变，造成了细胞色素P450亚铁血红素绑定模体的丢失，而这个模体是细胞色素P450所共有的最具特征性的结构，因此，推测发生了移码突变的基因CYP81A6就是水稻中的抗性基因Bel。本研究就是在此基础上，根据定位结果，克隆了Bel基因，构建植物表达载体，并将该基因分别导入拟南芥、油菜(Brassica napus)、烟草，验证基因功能，研究其表达情况、抗药特性和遗传规律，为培育出抗苯达松和磺酰脲类除草剂的油菜新品种和该基因应用于杂交制种打下基础。主要结果如下：1、提取水稻品种日本晴总RNA，通过RT-PCR，得到基因Bel的ORF片段，其长度为1542bp。将Bel基因克隆到pGEM-T Easy载体，经测序及同源序列比对，确定得到的Bel基因序列与GenBank中的AK104825序列一致。2、以质粒pCAMBIA3301为基础，构建了以bar基因为选择标记的植物表达载体pCAMBIA3301-BEL，其中目的基因Bel替换了原质粒中的GUS基因片段。表达载体经酶切鉴定正确。3、用蘸花的方法转化拟南芥，经Basta筛选得到转化植株32株，PCR检测初步确定目的片段已整合进拟南芥基因组中。4、取转基因拟南芥4株，提取RNA，经RT-PCR检测基因的表达情况，结果表明该基因能正常表达，表型与对照无明显差异。5、对生长3周左右的转基因拟南芥后代进行抗药性试验，对叁种除草剂分别设立了浓度梯度，得出了转化株对不同除草剂的有效使用范围，其中苯达松是48％的浓度稀释4000X-16000X，稻无草是0.1g／L-3g／L，Basta是18.5％的浓度稀释167X-10000X，为该基因的实际应用提供了依据。6、用蘸花的方法转化了油菜，通过除草剂筛选出16株转化体，PCR检测初步表明目的基因已整合到油菜基因组。7、用叶盘法转化了烟草，得到31株转化体，PCR检测初步表明目的基因已整合到烟草基因组，还有待进一步的研究。
张瑜[8]2014年在《抗草甘膦EPSPS基因克隆、表达载体构建及亚麻的遗传转化》文中研究表明本研究利用PCR技术从抗草甘膦转基因油菜中扩增出抗草甘膦5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）基因，然后通过Gateway技术分别将EPSPS构建入表达载体pEarlygate100和pMDC139中，将此两种表达载体转化农杆菌获得工程菌，并对亚麻农杆菌介导的遗传转化体系和检测体系进行了优化。为选育我国西北地区高产、优质、抗除草剂的亚麻新品种做基础工作。本研究结果如下：1.采用Q5超保真酶，从抗草甘膦转基因油菜基因组DNA中PCR扩增出EPSPS基因片段，利用Gateway技术将此片段插入pENTRTM/D-TOPO入门载体，经测序和序列分析结果显示，PCR所扩增得到的目的片段含有EPSPS基因完整序列，并且序列与美国Monsanto公司获得的专利（US5633435）中的CDS序列完全一致。再经过LR反应将入门载体TOPO-EPSPS上的目的基因分别构建入植物表达载体pEarlygate100和pMDC139中。利用限制性双酶切分析和菌液PCR鉴定，结果表明含有目的基因（EPSPS）植物表达载体pEarlygate100-EPSPS和pMDC139-EPSPS已构建成功。2.通过冻融法将重组的植物表达载体pEarlygate100-EPSPS和pMDC139-EPSPS成功导入农杆菌LBA4404中，以亚麻下胚轴为外植体，对亚麻的农杆菌介导的遗传转化法进行了优化，主要是脱菌剂和筛选剂浓度的确定，优化的参数有：最适亚麻脱菌剂为头孢霉素400mg/l；最佳下胚轴筛选剂：潮霉素浓度为20mg/l，筛选剂PPT浓度为10mg/l，草甘膦浓度为60mg/L。通过NAA、活性炭和多效唑优化亚麻再生苗生根培养基，得出最佳生根培养基是1/2MS+0.01mg/LNAA+0.01mg/L多效唑+0.5%活性炭。3.利用农杆菌介导遗传转化将重组的植物表达载体pEarlygate100-EPSPS和pMDC139-EPSPS转入亚麻“陇亚10号”，通过对抗性苗进行Gus染色和基因组PCR鉴定，最终得到了转基因的阳性亚麻苗，因此建立了亚麻遗传转化检测体系。
任佑华[9]2006年在《天麻抗真菌蛋白基因导入甘蓝型油菜的研究》文中认为油菜 (Brassica napus L．)在我国是一种十分重要的经济作物也是主要的油料作物之一。近年来优质高产的“双低”(菜籽油中芥酸含量低，菜籽饼中硫代葡萄糖甙含量低)油菜的育成，提高了油菜的经济价值，拓宽了油菜的用途。真菌病害是造成油菜产量和品质大幅度下降的主因，“双低”油菜品种由于硫苷含量低，致使植株对病原的感病性偏高，因而当病害发生时，“双低”油菜的产量和品质就会遭受巨大损失。 天麻 (Gastrodia elata B1．)是一种能与真菌共生的植物，因其球茎外层存在着一种能强烈抑制真菌生长的物质——天麻抗真菌蛋白(Gastrodia Antifungal Protein，GAFP)。2000年王义琴等从天麻次生块茎中成功地克隆了编码GAFP的基因，并且通过原核表达证明该基因所编码的产物具有抑菌活性。 本研究以甘蓝型油菜 (Brassica napus L．)“双低”品种westar为实验材料，以下胚轴为外植体，利用根癌农杆菌(LBA4404)介导的方法将天麻抗真菌蛋白(GAFP)基因导入其中。经共培养、抗生素筛选、生根获得了转化植株。对所获得的转化植株进行PCR、基因组Southern和RT-PCR检测结果表明，外源的GAFP基因已经整合入油菜基因组中。论文中还对影响农杆菌介导法转化效率的主要因素进行了分析讨论。
肖钢[10]2005年在《反义fad2基因与bar基因转化甘蓝型油菜和白菜型油菜的研究》文中提出高油酸油菜品种选育是目前油菜育种的一个重要内容。而培育抗除草剂作物又是解决目前农业劳动力成本增加和环境污染的有力手段。本研究利用根癌农杆菌介导法将bar基因(抗除草剂草丁膦基因)和反义fad2基因导入甘蓝型油菜和白菜型油菜,希望能创建高油酸、抗除草剂的甘蓝型和白菜型油菜育种材料。本研究作了以下工作并取得相关结果: 1、将bar基因(抗除草剂草丁膦基因)表达框(bar cassettee)整合到能反义表达油菜fad2基因(油酸脱氢酶)片断的植物表达型载体pBI121.NF上,构建成另一植物表型载体pBI121.XG。经菌落PCR、HindⅢ酶切检测证实该载体构建成功。 2、利用根癌农杆菌介导法将目的基因导入甘蓝型油菜湘油15和白菜型油菜苍白谷9—4.获得了湘油15号转化苗5株和苍白谷9—4转化苗7株,转化率分别为0.92%和2.52%。PCR检测fad2基因片断和bar基因确已转入再生苗。 3、通过对油菜子叶柄和子叶节在离体培养条件下的再生率的比较,建立了油菜子叶节丛生苗遗传转化系统。 4、以湘油15号为材料,分别用CTAB法、SDS法和山梨醇法提取油菜基因组DNA,并用紫外光分光光度法、琼脂糖电泳法对叁种方法对所提基因组DNA的质量和产量做了比较分析,结果表明以山梨醇法提取油菜基因组DNA的效果为最佳。 5、比较了5对bar基因的特异引物,和2种PCR用DNA聚合酶,发现引物B441和安比奥公司生产的pfuDNA聚合酶是从油菜基因组DNA中扩增bar基因的最佳引物和PCR用DNA聚合酶。
参考文献：
[1]. 抗除草剂基因克隆、表达载体构建及油菜的遗传转化[D]. 王旺田. 甘肃农业大学. 2004
[2]. 抗除草剂bar基因表达载体的构建及农杆菌转化的研究[D]. 檀琮萍. 安徽农业大学. 2003
[3]. 抗除草剂基因DsALS转化拟南芥和甘蓝型油菜的研究[D]. 吴学莉. 华中农业大学. 2013
[4]. 油菜BnGRF2和抗草甘膦EPSPs基因克隆及植物双价表达载体的构建[D]. 王开芳. 甘肃农业大学. 2015
[5]. 油菜籽油脂合成途径上游ACCase和PEPCase基因的克隆及功能研究[D]. 王伏林. 浙江大学. 2012
[6]. 甘蓝型油菜γ生育酚甲基转移酶基因（BnVET4）克隆及其遗传转化的研究[D]. 涂世伟. 浙江师范大学. 2012
[7]. 水稻苯达松和磺酰脲类除草剂抗性基因Bel的载体构建与转化[D]. 刘双青. 华中农业大学. 2007
[8]. 抗草甘膦EPSPS基因克隆、表达载体构建及亚麻的遗传转化[D]. 张瑜. 甘肃农业大学. 2014
[9]. 天麻抗真菌蛋白基因导入甘蓝型油菜的研究[D]. 任佑华. 湖南农业大学. 2006
[10]. 反义fad2基因与bar基因转化甘蓝型油菜和白菜型油菜的研究[D]. 肖钢. 湖南农业大学. 2005
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