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猪圆环病毒2b和2d基因型Cap蛋白的重组表达及其免疫原性研究

2020-12-02阅读(703)

猪圆环病毒2b和2d基因型Cap蛋白的重组表达及其免疫原性研究

论文摘要

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）在临床上主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）、繁殖障碍和呼吸道疾病等多种疾病,主要发病猪为6-16周龄仔猪。根据国际分类方法主要分为PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e五个基因型。近年来根据流行病学调查和遗传变异分析表明PCV2流行以及变异的趋势国内目前主要流行的为PCV2d基因型毒株。对于PCV2暂无有效的治疗方法,疫苗免疫被认为是当前最为有效的防控措施。Cap蛋白是PCV2的主要免疫原性蛋白,是近些年研究PCV2相关亚单位疫苗的首选抗原。目前市场上商品化疫苗主要是针对PCV2a、PCV2b基因型疫苗,研究证明PCV2a疫苗对PCV2d毒株能提供较好的保护作用。本研究内容主要研究PCV2b疫苗对目前国内流行的PCV2d基因型毒株是否具有较好的保护作用以及构建表达量更高的重组Cap蛋白,构建表达了 PCV2 Cap蛋白重组杆状病毒并进行了免疫原性研究。主要内容如下:1.通过对疑似PCV2的病猪组织病料进行分离鉴定以及小鼠致病性试验,分离到两株分别为PCV2b、PCV2d基因型的PCV2毒株5123和X46,X46和5123的病毒效价TCID50分别为1×105 5TCID50/0.1ml、1×104.5TCID50/0.1ml。攻毒后PCV2对小鼠肝、脾、肺和肾侵袭力较强,病毒载量较高。X46毒株攻毒后,肝、肾、脾、肺病毒载量较高,显著降低了小鼠的增重,对小鼠有较强的侵袭力;毒株5123各脏器病毒载量均较低,对小鼠侵袭力较弱。2.利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统pFastBacDual表达载体成功构建了重组质粒pFastBacDual-ORF2b、pFastBacDual-ORF2d、多拷贝重组质粒 pFastBacDual-ORF2d 1、pFastBacDual-ORF2d1d2、pFastBacDual-ORF2d1d2d3、pFastBacDual-ORF2d1d2d3d4,利用重组质粒转染获得重组蛋白 PCV2b-Cap、PCV2d-Cap、PCV2d1-Cap、PCV2d-2Cap、PCV2d-3Cap和PCV2d-4Cap 6个重组蛋白,均有较好的反应原性。根据SDS-PAGE和Western-Blot得到多拷贝PCV2d-3Cap蛋白表达量较高,是较好的疫苗候选免疫原。3.利用重组蛋白PCV2d-3Cap、PCV2b-Cap、PCV2d-Cap制作亚单位疫苗,攻毒PCV2毒株X46和P58,进行PCV2b、PCV2d Cap蛋白重组杆状病毒疫苗的小鼠攻毒保护试验。结果显示,各免疫组小鼠组织病毒载量均极显著低于攻毒对照组,各免疫组之间没有显著差异,PCV2b-Cap、PCV2d-Cap亚单位疫苗对攻毒PCV2d毒株的小鼠均有较好的保护作用;综合来看3组亚单位疫苗对PCV2d毒株攻毒的小鼠均有较好的保护作用,尽管PCV2b、PCV2d不同基因型毒株之间抗原性存在一定差异、但不影响PCV2b-Cap、PCV2d-Cap亚单位疫苗对攻毒PCV2d毒株的小鼠提供保护作用;3组疫苗,在免疫剂量相同的情况下,均能提供较好的保护作用,其中PCV2d-3Cap蛋白表达量更高,是较好的PCV2候选疫苗。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 符号说明
  • 文献综述
  •   1. 猪圆环病毒2型的研究进展
  •     1.1 猪圆环病毒的分类
  •     1.2 PCV2的病毒结构及理化特性
  •     1.3 PCV2病毒基因组特征及编码蛋白
  •   2. 猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）
  •     2.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）
  •     2.2 猪皮炎肾病综合征（PDNS）
  •     2.3 猪呼吸道疾病综合征（PRDC）
  •     2.4 仔猪先天性震颤（CT）
  •     2.5 繁殖障碍
  •     2.6 肉芽肿性肠炎
  •   3. PCV2的诊断方法
  •     3.1 酶联免疫吸附测定法（ELISA）
  •     3.2 原位杂交技术（ISH）
  •     3.3 间接免疫荧光（IFA）
  •     3.4 聚合酶链式反应（PCR）
  •     3.5 免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）
  •     3.6 免疫组织化学检测（IHC）
  •     3.7 免疫胶体金试纸
  •   4. PCV2疫苗的研究进展
  •     4.1 灭活疫苗
  •     4.2 重组嵌合病毒疫苗
  •     4.3 弱毒疫苗
  •     4.4 PCV2亚单位疫苗
  •     4.5 活载体疫苗
  •     4.6 核酸疫苗
  •   5. 杆状病毒表达载体及其应用
  •     5.1 杆状病毒的概述
  •     5.2 杆状病毒表达载体系统原理及其优点
  •     5.3 杆状病毒表达系统在疫苗生产中的应用
  •   6. 研究目的和意义
  • 研究内容一 两株猪圆环病毒2型的分离鉴定和小鼠致病性试验
  •   1. 实验材料
  •     1.1 生物材料
  •     1.2 实验试剂
  •     1.3 实验动物
  •     1.4 实验仪器
  •   2. 方法
  •     2.1 引物设计合成
  •     2.2 病料的处理
  •     2.3 病毒的分离鉴定
  •     2.4 荧光定量PCR检测分离株增殖拷贝数
  • 50)的测定'>    2.5 病毒半数感染量(TCID50)的测定
  •     2.6 病毒全基因序列合成和测序
  •     2.7 基因序列的比较分析
  •     2.8 小鼠人工感染试验
  •   3. 结果
  •     3.1 分离毒株PCR检测
  •     3.2 间接免疫荧光（IFA）检测
  •     3.3 分离病毒DNA拷贝数的测定
  • 50测定'>    3.4 PCV2分离株TCID50测定
  •     3.5 分离病毒全长基因组序列的扩增
  •     3.6 分离株的序列分析
  •     3.7 小鼠致病性试验
  •   4. 讨论
  • 研究内容二 PCV2b和PCV2d基因型Cap蛋白的重组表达及鉴定
  •   1. 实验材料
  •     1.1 病毒和细胞
  •     1.2 试剂和生物耗材
  •     1.3 仪器
  •   2. 方法
  •     2.1 提取病毒DNA
  •     2.2 引物设计与合成
  •     2.3 PCR扩增PCV2b和PCV2d毒株的ORF2基因
  •     2.4 PCR产物的回收与纯化
  •     2.5 PCR回收产物与载体pFastBacDual的双酶切
  •     2.6 酶切产物的胶回收及浓度测定
  •     2.7 PCV2b和PCV2d重组杆状病毒表达载体的构建和PCV2d多位点拷贝重组杆状病毒转座载体的构建
  •     2.8 多拷贝重组杆状病毒转座载体的构建
  •     2.9 重组Bacmid-Cap穿梭载体的构建
  •     2.10 重组杆状病毒的制备
  •   3. 结果
  •     3.1 PCV2 ORF2基因的扩增结果
  •     3.2 重组杆状病毒转座载体pFastBacDual-ORF2的双酶切鉴定
  •     3.3 重组穿梭载体Bacmid-Cap鉴定
  •     3.4 重组Cap蛋白SDS-PAGE
  •     3.5 Western-Blot鉴定重组PCV2-Cap蛋白特异性
  •   4. 讨论
  • 研究内容三 PCV2b和PCV2d Cap蛋白亚单位疫苗小鼠攻毒保护试验
  •   1. 实验材料
  •     1.1 病毒和细胞
  •     1.2 实验试剂
  •     1.3 实验动物
  •     1.4 实验仪器
  •   2. 实验方法
  •     2.1 亚单位疫苗的制备
  •     2.2 小鼠免疫攻毒程序
  •     2.3 病毒载量测定
  •     2.4 血清抗体效价测定
  •     2.5 小鼠体重变化
  •   3. 结果
  •     3.1 小鼠各脏器病毒脏器测定
  •     3.2 血清抗体效价
  •     3.3 小鼠免疫攻毒后体重变化
  •   4. 讨论
  • 全文总结
  • 参考文献
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 郭佳慧

    导师: 秦爱建,何孔旺

    关键词: 重组蛋白,亚单位疫苗,攻毒保护试验

    来源: 扬州大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 扬州大学

    基金: 江苏现代农业(生猪)产业技术体系JSTX(2018)259,江苏省农业自主创新专项资金CX(14)2045,江苏高校优势学科建设工程资助项目,江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

    分类号: S852.65

    DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000329

    总页数: 69

    文件大小: 4567K

    下载量: 181

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