植物中基于RNAi机制的高效CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建

论文摘要

CRISPR/Cas9是一种非常有效且被广泛使用的基因编辑工具,由于CRISPR/Ca9基因编辑系统的简便性以及高效性,目前它已成为获得动植物中特定突变体的主要手段。具体来说,CRISPR/Cas9由内切酶蛋白Cas9以及一段人工构建的用于靶向目的基因的sgRNA（single-guide RNA）构成。在植物中,Cas9蛋白的表达可能会被转录后基因沉默所抑制,从而导致目的基因编辑效率的降低。但目前并不清楚转录后沉默机制对CRISPR/Cas9编辑效率究竟有多大的影响。RDR6与DCLs（Dicer-likes）蛋白在转录后水平基因沉默的过程中发挥着至关重要的作用,本研究通过比较CRISPR/Cas9基因编辑系统在rdr6与dcl2 dcl3 dcl4突变体植物中的Cas9的表达水平探明RNAi机制对CRISPR/Cas9编辑效率的影响。研究结果发现,CRISPR/Cas9基因编辑系统的关键蛋白Cas9的表达量以及基因编辑效率在拟南芥rdr6单突与dcl2dcl3 dcl4三突变体中均比野生型更高。于是我们试图通过抑制内源基因rdr6的表达,提高野生拟南芥中CRISPR/Cas9基因编辑系统的效率。目前,用人工miRNAs（amiRNAs）来抑制植物内源基因的表达已经是非常成熟的技术。我们决定在CRISPR/Cas9的载体上连接一段靶向RDR6的人工小RNA（artificial microRNA targeting RDR6,amiR-RDR6）,以此来抑制植株体内RDR6基因的表达。研究结果显示,amiR-RDR6对RDR6基因表达的抑制提高了转基因植株体内的Cas9蛋白表达量以及基因编辑的效率。而且,amiR-RDR6引起的叶片突变表型,可作为筛选不含Cas9纯合突变体的直观标记。总的来说,我们证明了RNA干扰机制（RNAi）会降低CRSIPR/Cas9介导的基因编辑系统的编辑效率,并且通过抑制RDR6基因的表达能够减小RNAi的抑制效果。这一新的发现也许能够更进一步提高基因编辑的效率,并且可能成为筛选不含Cas9的突变体的有效工具。

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摘要

ABSTRACT

第1章引言

1.1 CRISPR/CAS基因编辑技术

1.1.1 CRISPR序列与CAS基因的发现

1.1.2 CRISPR/CAS系统的作用

1.1.3 CRISPR/CAS系统工作机制

1.1.4 CRISPR/CAS9 基因编辑系统

1.1.5 小结

1.2 植物的RNA沉默现象

1.3 DICER-LIKE蛋白

1.3.1 DICER-LIKE蛋白的结构与功能

1.3.2 DICER-LIKE与 PTGS

1.4 本研究的目的与意义

第2章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料处理方法与生长条件

2.1.2 基因、质粒和菌种信息

2.1.3 引物信息

2.1.4 主要培养基的配制

2.1.5 试剂与仪器

2.1.6 提取DNA试剂配制的方法

2.1.7 琼脂糖凝胶电泳所需的试剂配置方法

2.1.8 通用分子实验操作步骤

2.2 实验方法

2.2.1 CRISPR/CAS9 载体的构建

2.2.2 拟南芥的侵染及T1 代、T2 代植株表型统计

2.2.3 T1 转基因植株RDR6 基因表达量的荧光定量分析

2.2.4 CAS9 蛋白表达量检测

2.2.5 CAS9-FREE纯合突变体的获取与测序鉴定

第3章结果与分析

3.1 CRISPR/CAS9 基因编辑效率在PTGS缺陷突变体中增高

3.1.1 转基因植株统计学分析

3.1.2 PTGS缺陷突变体转基因植株CAS9 蛋白表达量增高

3.2 抑制内源性RDR6 基因的表达能够提高WT背景植株中的基因编辑效率

3.2.1 amiR-RDR6 序列能够抑制内源RDR6 基因的表达水平

3.2.2 CRIS-amiR-RDR6 转基因植株基因编辑效率增高

3.3 CRIS-amiR-RDR6 基因编辑系统能够更快的获得纯合突变体

第4章讨论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陆佳运

导师: 莫蓓莘

关键词: 干扰,转录后沉默,基因编辑,拟南芥

来源: 深圳大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 深圳大学

分类号: Q943.2

总页数: 42

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