代谢工程改造毕赤酵母促进乙酸生物利用

论文摘要

随着生物技术的飞速发展,微生物作为底盘细胞用于各类大宗或精细化学品的生产引起了广泛的关注和应用。目前,酵母底盘细胞多采用常规碳源葡萄糖和甘油,但如甲醇、乙醇、乙酸等非常规发酵碳源正在被越来越多地开发和利用。其中,乙酸是一种来源广泛、价格低廉、节能环保的碳源,可被直接催化为乙酰辅酶A而作为许多大宗和精细化学品的合成前体,因而受到广泛关注。毕赤酵母近年来被证实可以作为优良的底盘宿主用于小分子医药、化工产品的生物合成。本课题即尝试代谢工程改造毕赤酵母的乙酸耐受、转运和代谢过程以促进乙酸生物利用,进一步探讨乙酸作为碳源和生物合成前体的可行性。首先,乙酸的解离常数（pKa）为4.76,在低pH条件下对具有强烈的抑菌作用,涉及到一系列激酶相关的信号转导过程,是酵母中乙酸利用必须面对的难题。本研究利用课题组已构建的毕赤酵母激酶缺失文库筛选乙酸耐受相关激酶,进而通过激酶的缺失或过表达,提高细胞对乙酸的耐受能力。其中,毕赤酵母PASchr31091基因（命名为hrk1）缺失株对乙酸呈现强烈敏感表型,说明该基因对乙酸耐受有正面影响。因此我们构建了hrk1过表达菌株,同时以6-甲基水杨酸（6-MSA）,作为报告化合物来评估乙酸利用效果,该化合物为真菌聚酮化合物,利用乙酰辅酶A为合成前体。hrk1过表达菌株的6-MSA产率最高可达80 mg/g cell,约为对照菌株的1.55倍。结果表明,hrk1过表达有效促进了6-甲基水杨酸的合成,能够促进乙酸的生物利用。其次,乙酸发生解离后存在两种形式,即分子形式的乙酸和离子形式的乙酸根离子,而酵母细胞膜上携带分别负责转运分子和离子形式乙酸的转运蛋白。由于酵母比较适合在偏酸性的环境中生长,因此我们推测增强分子形式乙酸的转运是促进乙酸利用的一个必要环节。有文献报道,酿酒酵母水-甘油通道蛋白ScFps1可促进乙酸分子转运,因此我们在毕赤酵母中过表达了酿酒酵母来源的ScFps1*并分析了胞外乙酸的消耗速率和6-甲基水杨酸的合成水平。结果表明,过表达ScFps1*未能有效促进乙酸的转运和6-甲基水杨酸的合成,说明该条件下毕赤酵母自身的乙酸分子转运水平很可能已经能满足需求。再者,细胞内乙酸的过量积累会导致一系列的细胞程序性死亡过程,因此加快胞内乙酸的快速转化也是加强乙酸代谢利用的关键步骤。乙酸可在微生物细胞内经乙酰辅酶A合成酶催化或乙酸激酶/磷酸转乙酰化酶共同催化而转化为乙酰辅酶A。本研究中通过过表达这些乙酸代谢相关基因,以6-MSA作为报告化合物,分析了它们对乙酸代谢利用的作用效果。毕赤酵母来源的乙酰辅酶A合成酶PpAcs1和酿酒酵母来源的乙酰辅酶A合成酶ScAcs1*能够促进毕赤酵母中乙酸的利用,它们的6-MSA产率最高可达47.0 mg/g cell和43.7 mg/g cell,分别是对照株的1.39倍和1.30倍。而大肠杆菌来源的乙酸激酶AckA和磷酸转乙酰化酶Pta则没有明显的促进作用。最后,将乙酸耐受和乙酸代谢两部分中可以促进乙酸代谢的基因进行了组合表达,进一步促进了乙酸生物利用。该研究通过改造毕赤酵母的乙酸耐受、转运和代谢过程,有效地促进了毕赤酵母底盘宿主的乙酸生物利用能力,为利用酵母宿主生物合成以乙酸和乙酰辅酶A为前体的医药、化工产品提供了参考。但由于毕赤酵母受乙酸严重杀伤的天然生理特性,要实现毕赤酵母利用乙酸为碳源进行高效生长及产物合成依旧需要持续的深入研究。

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摘要

Abstract

第1章文献综述

1.1 乙酸及乙酸利用现状

1.1.1 大肠杆菌的乙酸利用

1.1.2 酵母的乙酸利用

1.2 乙酸代谢

1.2.1 乙酸与乙酰辅酶A

1.2.2 真核生物的乙酸代谢

1.2.3 原核生物的乙酸代谢

1.3 乙酸转运

1.3.1 分子形式乙酸的转运

1.3.2 离子形式乙酸的转运

1.4 乙酸耐受

1.4.1 乙酸诱导下的酵母程序性死亡

1.4.2 酵母在乙酸诱导下的适应性

1.5 毕赤酵母

1.5.1 毕赤酵母的发展

1.5.2 毕赤酵母表达系统的优缺点

1.6 本课题的研究背景、创新点及课题意义

第2章毕赤酵母激酶缺失文库中乙酸耐受相关激酶的筛选

2.1 前言

2.2 实验材料

2.2.1 实验菌株和试剂

2.2.2 培养基和培养条件

2.3 实验方法

2.3.1 激酶缺失株的活化

2.3.2 激酶缺失株的点板生长

2.4 实验结果

2.4.1 激酶缺失菌株的培养

2.4.2 乙酸敏感型激酶缺失株

2.5 本章小结

第3章乙酸耐受相关基因HRK1的功能

3.1 前言

3.2 实验材料及方法

3.2.1 实验菌株与试剂

3.2.2 培养基与培养条件

3.2.3 基因扩增及载体组装

3.2.4 大肠杆菌TOP10感受态制备及转化

3.2.5 毕赤酵母感受态制备及电穿孔转化

3.2.6 毕赤酵母基因组的提取

3.2.7 用于ATPase酶活检测的总蛋白提取

3.2.8 6-甲基水杨酸的摇瓶水平表达

3.2.9 6-甲基水杨酸的测定

3.3 实验结果与讨论

3.3.1 乙酸耐受相关基因hrk1的克隆和质粒构建

3.3.2 乙酸耐受相关基因pma1的克隆和质粒构建

3.3.3 乙酸耐受相关基因hrk1和pma1共表达质粒的构建

3.3.4 回补菌株Δhrk1-hrk1的构建

3.3.5 重组菌株GS-hrk1、GS-pma1和GS-hrk1/pma1的构建

3.3.6 重组菌株XN-hrk1、XN-pma1和XN-hrk1/pma1的构建

3.3.7 Hrk1激酶在乙酸压力下对生长的影响

3.3.8 重组菌株GS-hrk1、GS-pma1及GS-hrk1/pma1胞外pH

3.3.9 菌株GS115和Δhrk1的ATPase酶活

3.3.10 重组菌株XN-hrk1、XN-pma1和XN-hrk1/pma1的6-甲基水杨酸合成

3.4 本章小结

*的功能'>第4章乙酸转运蛋白SCFPS1^*的功能

4.1 前言

4.2 实验材料及方法

4.3 实验结果与讨论

*基因的获得及质粒pAG32-5AOX-Scfps1^*的构建'> 4.3.1 基因Scfps1^*基因的获得及质粒pAG32-5AOX-Scfps1^*的构建

*和XN-Scfps1^*的构建'> 4.3.2 重组菌株GS-Scfps1^*和XN-Scfps1^*的构建

*的乙酸转运能力'> 4.3.3 重组菌株GS-Scfps1^*的乙酸转运能力

*的6-甲基水杨酸合成'> 4.3.4 重组菌株XN-Scfps1^*的6-甲基水杨酸合成

4.4 本章小结

第5章乙酸代谢基因的过表达

5.1 前言

5.2 实验材料及方法

5.3 实验结果与讨论

5.3.1 基因PpAcs1的获得和质粒构建

*的获得和质粒构建'> 5.3.2 基因ScAcs1^*的获得和质粒构建

5.3.3 基因pta和ackA的获得和质粒构建

*和XN-pta/ackA的构建'> 5.3.4 重组菌株XN-PpAcs1、XN-ScAcs1^*和XN-pta/ackA的构建

*和XN-pta/ackA的6-甲基水杨酸合成'> 5.3.5 重组菌株XN-PpAcs1、XN-ScAcs1^*和XN-pta/ackA的6-甲基水杨酸合成

5.4 本章小结

第6章乙酸耐受和代谢相关基因共同促进乙酸的利用

6.1 前言

6.2 实验材料及方法

6.3 实验结果与讨论

*的构建'> 6.3.1 重组菌株XN-hrk1-PpAcs1和XN-hrk1-ScAcs1^*的构建

*的6-甲基水杨酸合成'> 6.3.2 重组菌株XN-hrk1-PpAcs1和XN-hrk1-ScAcs1^*的6-甲基水杨酸合成

6.4 本章小结

第7章结论与展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间撰写的论文

附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 徐沁

导师: 张元兴,蔡孟浩

关键词: 乙酸,毕赤酵母,代谢工程,乙酰辅酶,激酶

来源: 华东理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华东理工大学

分类号: Q78

总页数: 78

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代谢工程改造毕赤酵母促进乙酸生物利用

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