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4株乳杆菌胞壁蛋白酶的分离纯化及鉴定

2020-12-08阅读(423)

4株乳杆菌胞壁蛋白酶的分离纯化及鉴定

论文摘要

乳酸杆菌的蛋白水解系统包括细胞胞壁蛋白酶（cell-envelope proteinase,CEP）,寡肽转运系统和内肽酶。其中,CEP作为该系统的关键酶发挥着重要作用,不仅参与酪蛋白降解,助发酵产品风味和质地的形成,还可酶解食物蛋白释放出生物活性肽,有益于消费者健康。目前关于乳杆菌CEP分离纯化的报道不多,对其结构鉴定更是鲜有报道,本课题采用不同提取方法研究4种乳杆菌CEP的提取效果;探讨双水相系统对CEP分离的影响,单因素及响应面法优化确定双水相分离CEP最佳条件;采用超滤、葡聚糖凝胶色谱对其分离纯化;电泳测酶分子量,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）鉴定CEP,比较不同乳杆菌的产酶差异。研究结论如下:1.选取的10种方法提取4株乳杆菌CEP存在显著差异。Ca2+-free法为植物乳杆菌LP69和鼠李糖乳杆菌LR22 CEPs的最适提取方法;保加利亚乳杆菌LB6和干酪乳杆菌L61 CEPs的最适提取剂分别是盐酸胍和十二烷基硫酸钠（SDS）。综合考虑提取方法对四株菌的通用性及效果,选用Ca2+-free法处理4种乳杆菌细胞,其粗酶液酶活分别为6.28 U/mL、8.98 U/mL、6.08U/mL、47.59U/mL,其比活力分别为70 U/mg、90 U/mL、200 U/mL、210 U/mL。2.单因素及响应面法优化确定了4株乳杆菌CEP的双水相萃取条件。植物乳杆菌LP69 CEP的最佳萃取条件为:30%（w/v）（NH4）2SO4,30%（w/v）PEG-1000,pH 7.0,在此条件下,CEP回收率和纯化倍数分别为90.83%和2.57;鼠李糖乳杆菌LR22 CEP的最适萃取条件为:30%（w/v）（NH4）2SO4,25%（w/v）PEG-1000,pH 6.7,CEP回收率和纯化倍数各为91.05%和1.11;保加利亚乳杆菌LB6 CEP的最佳萃取条件为30%（w/v）（NH4）2SO4,30%（w/v）PEG-4000,pH 7.0,CEP回收率和纯化倍数各为86.67%和1.25;干酪乳杆菌L61 CEP的最佳萃取条件为40%（w/v）NaH2PO4,15%（w/v）PEG-1000,pH6.8,CEP回收率和纯化倍数各为92.94%和1.95,表明双水相萃取法提取乳杆菌粗酶液CEP是可行的。3.超滤、Sephadex G-100凝胶层析进一步纯化了4株菌的CEP,电泳测定了纯度和分子量;三种截断分子量（100K Da、50K Da、10K Da）超滤膜分离双水相萃取的4株乳杆菌CEP,发现LB6酶活最高的组分的分子量在50K Da100K Da超滤液中,其它三株菌CEP酶活最高的组分的分子量在10K Da50K Da超滤液中。凝胶色谱纯化后LP69 CEP的比活力、CEP回收率和纯化倍数分别为976 U/mg、45.32%和13.94;LR22 CEP的比活力、回收率和纯化倍数分别为410 U/mg、23.43%和4.56;LB6 CEP的比活力、回收率和纯化倍数分别为1180 U/mg、33.58%和5.90;L61 CEP的比活力、回收率和纯化倍数分别为5310 U/mg、21.12%和25.29。4株菌CEP的电泳结果均为单一条带,分子量分别约为45K Da、80K Da、30K Da和38K Da。采用LC-MS/MS对4株乳杆菌CEP进行分析,得到多肽的分子量在600-1800Da范围内。4株乳杆菌CEP均存在6种相同肽段SIEDTK、RMISVAR、TIDDLK、QSELKAATK、YISTK、FLEQQNK。本课题研究乳杆菌CEP最适提取方法及双水相体系萃取CEP,为后续开发具有生物活性的功能性产品提供技术依据;研究获得了不同乳杆菌CEP的氨基酸组成,这可为后续基因工程表达制备CEP提供参考。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 1 前言
  •   1.1 乳酸菌
  •   1.2 胞壁蛋白酶
  •   1.3 胞壁蛋白酶提取研究进展
  • 2+-free缓冲液'>    1.3.1 Ca2+-free缓冲液
  •     1.3.2 离液剂
  •     1.3.3 低浓度洗涤剂
  •     1.3.4 溶菌酶
  •     1.3.5 混合提取剂
  •   1.4 双水相萃取胞壁蛋白酶
  •     1.4.1 双水相系统
  •     1.4.2 双水相分离酶研究进展
  •   1.5 胞壁蛋白酶的分离纯化
  •     1.5.1 超滤法
  •     1.5.2 凝胶层析法
  •   1.6 胞壁蛋白酶结构鉴定
  •   1.7 目的意义及研究内容
  • 2 材料与方法
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 菌株及培养基
  •     2.1.2 主要试剂
  •     2.1.3 仪器及设备
  •   2.2 技术路线及实验方法
  •     2.2.1 技术路线
  •     2.2.2 菌种活化
  •     2.2.3 菌体制备
  •     2.2.4 胞壁蛋白酶提取
  •     2.2.5 胞壁蛋白酶酶活测定
  •     2.2.6 蛋白含量测定及比活测定
  •     2.2.7 双水相系统萃取胞壁蛋白酶的工艺研究
  •     2.2.8 胞壁蛋白酶的分离纯化
  •     2.2.9 质谱鉴定胞壁蛋白酶
  •     2.2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶分子量
  • 3 结果与讨论
  •   3.1 酪蛋白及蛋白质标准曲线的建立
  •   3.2 探究提取方法对乳杆菌胞壁蛋白酶的影响
  •     3.2.1 不同提取剂最适浓度的确定
  • 2+-free法提取乳杆菌胞壁蛋白酶的效果分析'>    3.2.2 Ca2+-free法提取乳杆菌胞壁蛋白酶的效果分析
  •     3.2.3 溶菌酶提取乳杆菌胞壁蛋白酶的适用性
  •     3.2.4 氯化锂离液剂提取四种乳杆菌胞壁蛋白酶的选择性
  •     3.2.5 溶菌酶-氯化锂对乳杆菌胞壁蛋白酶提取的影响
  •     3.2.6 尿素离液剂提取四种乳杆菌胞壁蛋白酶的选择性分析
  •     3.2.7 盐酸胍离液剂提取乳杆菌胞壁蛋白酶的浓度及选择性分析
  •     3.2.8 甘氨酸提取4 株乳杆菌胞壁蛋白酶的效果分析
  •     3.2.9 SDS洗涤剂处理对乳杆菌胞壁蛋白酶提取的影响
  •     3.2.10 磷酸钠缓冲液提取四种乳杆菌胞壁蛋白酶的机制分析
  •     3.2.11 氢氧化钠处理4 株乳杆菌的机理及胞壁蛋白酶提取的选择性
  •     3.2.12 小结
  •   3.3 双水相法优化乳杆菌胞壁蛋白酶萃取条件
  •     3.3.1 双水相体系萃取植物乳杆菌LP69 胞壁蛋白酶
  •     3.3.2 双水相体系萃取鼠李糖乳杆菌LR22 胞壁蛋白酶效果评价
  •     3.3.3 保加利亚乳杆菌LB6 胞壁蛋白酶双水相萃取体系分析
  •     3.3.4 双水相萃取干酪乳杆菌L61 胞壁蛋白酶的效果分析
  •     3.3.5 小结
  •   3.4 乳杆菌胞壁蛋白酶的分离纯化及鉴定
  •     3.4.1 超滤膜截断分子量对CEP分离的影响
  •     3.4.2 凝胶色谱G-100 纯化乳杆菌胞壁蛋白酶
  •     3.4.3 SDS-PAGE法测定乳杆菌胞壁蛋白酶分子量
  •     3.4.4 乳杆菌胞壁蛋白酶的鉴定
  •     3.4.5 小结
  • 4 结论、创新点和展望
  •   4.1 结论
  •   4.2 创新点
  •   4.3 展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读学位期间发表的成果目录

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 黄洁

    导师: 陈合,舒国伟

    关键词: 乳杆菌,胞壁蛋白酶,提取,双水相系统,分离纯化,结构鉴定

    来源: 陕西科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,化学,轻工业手工业

    单位: 陕西科技大学

    分类号: TS201.3;O657.63

    总页数: 91

    文件大小: 6879K

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