李永旺[1]2003年在《TLR4及MD2在内毒素激活肺泡Ⅱ型上皮细胞中的作用机制研究》文中研究说明内毒素又称脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是革兰阴性细菌外膜的主要成分。内毒素血症及由此引起的急性肺损伤(Acute lung injury, ALI)、急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory dysfunction syndrome, ARDS）和多器官功能障碍综合征（Multiple organ dysfunction syndrome, MODS）是病人感染死亡的重要原因。在LPS所致肺急性炎症反应的研究中，既往多注重肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages, AM）和多形核白细胞（polymorphonuclear leukocyte, PMN）在诱发和调节炎症反应中的作用。而对肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar typeⅡepithelial cells, ATⅡcells）的研究却较少。事实上，ATⅡcell象AM和PMN一样，也能被LPS强烈激活，释放大量炎症介质，对急性肺损伤的发生、发展同样起着不可忽视的作用。Toll样受体4（Toll like receptor-4, TLR4）及其附属蛋白MD2，控制着LPS炎症信号进入细胞内的通路，ATⅡcells是否表达TLR4和MD2受体，以及它们在LPS激活ATⅡcells的过程中有何作用尚不清楚。本研究探讨TLR4及MD2在LPS激活ATⅡcells中的作用及其机制，以期为急性肺损伤的防治提供新的思路。方法：（1）通过RT-PCR的方法检测TLR4及MD2 mRNA在ATⅡcells的表达；通过EMSA检测LPS刺激后的ATⅡcells NF-κB活性的变化；ELISA检测ATⅡcells培养上清中TNF-α和IL-6的含量变化。（2）应用PCR技术扩增出TLR4及MD2基因片段，分别反向插入真核表达载体pEFBOS的多克隆位点，构建TLR4及MD2基因的反义真核表达载体，并对其进行酶切和测序鉴定。（3）采用脂质体转染试剂将反义载体转染入培养的ATⅡcells。Northern blot检测TLR4及MD2 mRNA表达；Western blot检测TLR4及MD2 蛋白表达；EMSA检测转染后的ATⅡcells NF-κB活性的变化；ELISA检测转染后的ATⅡcells培养上清中TNF-α和IL-6的含量变化。结果：（1）正常未刺激细胞即可见TLR4和MD2 mRNA表达。1 ng/ml LPS刺激2 h后即可引起TLR4和MD2 mRNA表达显着增高（P＜0.01），此后随着LPS浓度的增高，表达继续增强，当LPS浓度达到103 ng/ml以上时，继续增加LPS浓度，TLR4和MD2 mRNA表达虽仍有增多，但无显着变化。103 ng/ml LPS刺激后1 h，TLR4和MD2 mRNA
倪志宇[2]2005年在《CCK-8对炎症反应中促炎及抗炎性细胞因子表达的调控机制研究》文中提出全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)和代偿性抗炎反应综合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome, CARS)是感染性及创伤性疾病并发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的重要病理过程。MODS不仅有炎症介质过度释放,而且还伴有内源性抗炎介质的不足或过度释放,两者均可导致炎症反应失控,最终导致多系统器官衰竭(multiple systemic organ failure, MSOF)以至死亡。在炎症反应失控而发展成MODS的病理过程中,肺脏是公认的较早发生功能障碍的器官,急性肺损伤(acute lung injury, ALI)或急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)即是MODS 在肺部的表现。作为一种重要的炎症介质,细胞因子在炎症的发生发展过程中发挥着重要作用,其失控性释放是构成ARDS 和MODS 的主要病理学基础。根据细胞因子在宿主防御反应中的功能不同,可将其分为两类:促炎细胞因子和抗炎细胞因子。在炎症反应发展的过程中,机体在释放TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎细胞因子的同时,亦可分泌IL-10、IL-4 等抗炎性细胞因子以对抗炎症反应、维持机体内环境的稳定。活化的单核-巨噬细胞是炎症反应中细胞因子的重要来源, G-菌菌壁的主要活性成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是诱导巨噬细胞产生和释放炎症介质最强烈、最有效的激活物,在G-菌感染和内毒素休克发病中发挥重要作用。胆囊收缩素(cholecystokinin, CCK)是一种典型的脑肠肽,它不但具有胃肠激素的功能,还以神经递质和神经调质的形式发挥着重要的作用。近年的研究表明,八肽胆囊收缩素(CCK-8)具有一定的抗炎作用,用CCK-8 预处理可使内毒素休克(endotoxin shock, ES)大鼠平均动脉压回升而肺动脉压降低,并明显减轻LPS 引起的大鼠心肌组织、肺脏、脾脏和肾脏白细胞浸润、毛细血管血液淤积等征象,抑制体内TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎因子的升高。ES 大鼠脾、肺、心脏组织及肺间质巨噬细胞
闫姝含[3]2013年在《多拉菌素的抗炎作用及其对相关信号转导通路的调控》文中研究表明多拉菌素(Doramectin)是新一代大环内酯类抗寄生虫药物，属伊维菌素的衍生物。主要用于治疗胃肠道蛔虫，肺蠕虫，眼丝虫，虱，和疥螨等引起的寄生虫病。已有研究表明大环内酯类抗生素除具有抗菌驱虫作用外，还具有抗炎活性。本文对多拉菌素的抗炎作用进行了深入研究。通过LPS刺激小鼠RAW264.7单核-巨噬细胞建立体外炎症反应模型，研究多拉菌素的体外抗炎活性，并在此基础上借助炎性信号传导通路平台进一步探索其分子抗炎作用机制。同时通过构建内毒素血症，急性肺损伤，过敏性哮喘和特应性皮炎模型，评估多拉菌素对四种不同的炎症动物模型的保护作用。首先通过建立LPS诱导的小鼠RAW264.7单核-巨噬细胞体外炎症模型，研究不同浓度的多拉菌素对RAW264.7细胞分泌细胞因子TNF-α，IL-6和IL-1β及炎性介质NO和PGE2的影响。结果显示，多拉菌素显着抑制了TNF-α，IL-6和IL-1β的分泌，并成剂量依赖关系。同时抑制了NO和PGE2的合成。以上数据表明，多拉菌素能够通过调节细胞因子和炎性介质的分泌而发挥体外抗炎作用。LPS诱导巨噬细胞分泌细胞因子与炎性介质的机制已被深入研究，其中TLR4受体和常见的两条炎症信号转导通路NF-κB和MAPKs起到了重要的作用。TLR4是介导内毒素诱导炎症反应最重要的受体，而NF-κB和MAPKs通路常被作为抗炎分子机制的重要靶位。本实验通过LPS诱导小鼠RAW264.7细胞，检测多拉菌素对TLR4受体，NF-κB和MAPKs信号转导通路的影响，进而研究多拉菌素的抗炎分子机制。结果显示，多拉菌素显着抑制了LPS诱导小鼠RAW264.7细胞TLR4受体的表达、NF-κB的活力，同时显着抑制了p38MAPKs和ERK1/2MAPKs的蛋白表达。结果表明，多拉菌素通过抑制TLR4受体的表达，调控NF-κB、ERK1/2和p38MAPKs信号通路，从而抑制细胞因子TNF-α，IL-6和IL-1β及炎性介质NO和PGE2的合成。在体外实验的基础上，我们进一步研究了多拉菌素的体内抗炎作用，从而为临床疗效提供全面的理论基础。通过构建LPS诱导的小鼠内毒素血症模型，研究不同浓度的多拉菌素对小鼠内毒素血症的治疗作用，确定多拉菌素最佳抗炎剂量，及多拉菌素对小鼠血清中TNF-α，IL-6，IL-8，IL-10和IL-1β分泌的影响。实验结果显示，多拉菌素显著提高了内毒素血症小鼠的生存率，并显著下调了血清中TNF-α，IL-6，IL-8的表达，提高了IL-10的表达水平，但对IL-1β的作用并不显著。因此多拉菌素可通过调节小鼠血清中细胞因子的表达水平提高LPS诱导内毒素血症小鼠的生存率，对内毒素血症小鼠有良好的保护作用。通过构建LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型，研究最佳抗炎剂量的多拉菌素（3mg/kg）对肺损伤小鼠的保护作用。结果显示，预服多拉菌素可以显着抑制ALI小鼠肺组织湿重/干重比、肺泡灌洗液中总蛋白的浓度、炎性细胞的数量、MPO的活性；显着抑制了肺泡灌洗液中TNF-α，IL-6和IL-1β的分泌水平；肺组织病理切片显示，多拉菌素显著降低了由LPS诱导引起的肺组织的损伤，说明多拉菌素对ALI小鼠具有一定的保护作用。通过构建OVA诱导的过敏性哮喘模型，研究多拉菌素（3mg/kg）对过敏性哮喘小鼠的保护作用。结果显示，预服多拉菌素可显着抑制血清中OVA特异性的IgE和IgG的水平；降低肺泡灌洗液中IL-4，IL-5，IL-13和CCL11的表达量，提高了IFN-γ的水平，而对IL-10无显着作用；抑制肺泡灌洗液中总细胞和嗜酸性粒细胞的数量；降低了肺阻力并升高了肺动态顺应性；肺组织切片显示，多拉菌素显着降低了出现在支气管和血管周围的炎性细胞浸润、黏液分泌增多以及杯状细胞的增生等。以上结果表明，多拉菌素对由OVA诱导的过敏性哮喘小鼠有一定的保护作用。通过构建TNCB诱导的特应性皮炎模型，研究多拉菌素（3mg/kg）对特应性皮炎小鼠的保护作用。结果显示，预服多拉菌素可以显着抑制血清中IgE的表达；下调小鼠耳组织液中IL-4，IL-6，IL-1β和IL-18的水平；抑制皮损处MPO的活性；降低了淋巴结中总细胞和淋巴细胞的数量；促进淋巴细胞分泌IFN-γ，抑制其分泌IL-4和IL-13；耳组织切片显示，多拉菌素减轻了表皮层和真皮层的炎性病变程度、降低了组织中炎性细胞的浸润，抑制了耳壳水肿的程度。以上结果表明，多拉菌素对由TNCB诱导的AD小鼠有一定的保护作用。本文首次证明了多拉菌素具有体内外的抗炎活性，并在此基础上进一步证实多拉菌素是通过对TLR4-NF-κB、ERK1/2和p38MAPKs等信号转导通路的调控来发挥抗炎作用的。为该药在临床上的合理应用提供充分的理论依据。
任文智[4]2010年在《云芝糖肽（PSP）对小鼠巨噬细胞的双向免疫调节及NF-κB信号通路的调控研究》文中认为云芝糖肽(PSP)是从云芝(Trametes versicolor)COV-1菌株深层发酵培养的菌丝体中提取的肽结合多糖,是国家II类新药,用于减轻癌症病人化、放疗产生的毒副作用、提高自身免疫力,并用于增强亚健康人群机体免疫力。但云芝糖肽对已存在过度免疫状态机体的作用及机理尚不明确。本研究用LPS刺激的小鼠巨噬细胞Raw264.7作为炎症模型,分析PSP对静息和LPS过度刺激两种不同状态的巨噬细胞的调控作用。ELISA检测发现,PSP(25、100?g/ml)单独作用于细胞时(24h),有促进IL-1β产生的趋势,IL-1β浓度分别达到0.76+1.07pg/ml和2.73+1.29pg/ml(对照组为0.76+0.21pg/ml),但均未达到显着(p>0.05)。LPS刺激可促使大量的IL-1β产生,浓度达到8.20+0.43pg/ml(p<0.05)。PSP(25,100?g/ml)与LPS共同孵育时,IL-1β分泌下降到6.36+0.86和7.12+3.21pg/ml,虽未达到统计学显着性(p>0.05),但有减弱LPS刺激产生的高IL-1β水平的趋势。用ELISA检测25、100?g/ml PSP单独作用细胞后PGE2的浓度,结果为114.11+17.67pg/ml和200.25+76.00pg/ml,略高于对照组(95.01+14.70pg/ml)。LPS刺激可促进大量的PGE2产生(419.78+75.70pg/ml)(p<0.05),但当与PSP(25、100?g/ml)共同孵育时, PGE2的水平分别下调到146.97+15.20、154.96+58.73pg/ml,其中25?g/ml达到统计学显着(p<0.05)。?Western blot结果显示,PSP(25、100?g/ml)不影响静息状态细胞COX-2(PGE2合成的关键限速酶)的表达水平,但能降低LPS刺激后的COX-2高表达,且有量效关系(p<0.05)。免疫荧光观察发现,对照组细胞中核转录因子NF-κB主要分布在细胞质,细胞核中少有分布;LPS刺激后,NF-κB大量转移到细胞核中,很少在细胞质中分布;PSP单独作用于静息状态细胞可轻微促进NF-κB的核转移;当与LPS共同作用时,则可弱化NF-κB大量向核内转移的程度。Western blot检测进一步发现,NF-κB主要分布在静息状态细胞的细胞浆内。LPS刺激可显着降低胞浆内的NF-κB水平,与免疫荧光观察结果相符。PSP单独作用时也可微弱地降低胞浆内的NF-κB水平,但与LPS共同作用时,则可减少LPS刺激所导致的胞浆NF-κB水平显着下降,有阻滞NF-κB核转移作用。流式细胞分析发现,PSP可干扰LPS-FITC与巨噬细胞结合,使细胞荧光强度从2.07+0.42(LPS-FITC组)减少到1.20+0.25(PSP+LPS-FITC组)。这些研究表明,PSP能激活正常静息状态的巨噬细胞,有弱的上调IL-1β和PGE2产生的能力。但当细胞处在过度激活状态时,PSP又能下调LPS诱导产生的大量IL-1β、PGE2等炎症介质,下调COX-2表达。这种下调作用与阻滞NF-κB的核转移、干扰LPS与细胞结合有关。因此PSP对巨噬细胞的免疫调节作用是双向的,是一种双向免疫调节剂。
王居平[5]2011年在《TLR4乙酰化/甲基化修饰激活对炎症免疫的调节》文中指出Toll样受体4(Toll Like Receptor4,TLR4)在巨噬细胞的抗感染(特别是抗病毒)过程中发挥重要作用。TLR4可与配体革兰阴性菌的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)结合,并与MD2、CD14两个分子形成MD2/TLR4/CD14复合体而活化。活化的TLR4激活两条经典的信号转导通路：一条是MyD88依赖性信号转导路径,主要接头蛋白为MAL(TIRAP)和MyD88, TLR4通过招募Mal(TIRAP)/Myd88,激活一系列蛋白酸磷酸化激酶(如TAK1、IKKγ, IKKαA, IKKβ)、导致转录因子NF-κB激活并入核而启动炎症因子基因表达。这些炎症因子如白介素6(Inter leukin 6, IL6)、IL12. IL17.肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα, TNFα)的表达释放参与巨噬细胞的炎症免疫反应。另一条是MyD88非依赖性信号转导途径,其主要接头蛋白为TRAM和TRIF。TLR4通过招募TRAM/TRIF,激活另一些蛋白酸磷化激酶(如TBK1、IKKs/IKKi)、导致转录因子干扰素调节因子3(IFN-regulated factor3, IRF3)激活并入核,来诱导包括干扰素β(Interferon beta,IFNβ)的转录,最终引起免疫反应。丝氨酸磷酸化被认为在TLR4的信号通路(尤其在两条通路的中下游)的激活,起到了至关重要的作用。然而至今为止,TLR4和TLR4的接头蛋白是如何被激活的,却毫无所知。最近,本实验室率先报道的蛋白乙酰化参与I型干扰素受体信号转导(Ref)为TLR4上游信号转导通路得激活提供了极为重要的线索。本论文研究证实了乙酰化和甲基化修饰对LPS引起的TLR4信号通路的激活,细胞因子合成释放以及巨噬细胞的炎症免疫调控功能具有重大的生物学意义。(一)TLR4乙酰化修饰在LPS活化的炎症信号转导中的作用1、LPS刺激巨噬细胞系Raw264.7细胞后,利用泛乙酰化抗体进行免疫印迹检测发现TLR4可发生乙酰化修饰。免疫荧光法和免疫共沉淀法证实LPS刺激可促进CBP出核并与TLR4相互作用；抑制内源CBP表达后,TLR4乙酰化显着降低,表明CBP介导TLR4的乙酰化修饰。为探索TLR4乙酰化修饰位点,我们构建了两个突变体即第732位和第813赖氨酸(K)分别突变为精氨酸(R)(K732R,K813R),并与CBP共表达后检测乙酰化程度。结果表明,与野生型TLR4相比,两个突变体的乙酰化程度显着降低。质谱法检测到TLR4第813位K发生乙酰化修饰。此外,我们分别制备了K732和K813乙酰化修饰的特异性抗体,发现LPS刺激后TLR4的K732和K813乙酰化显着升高。以上结果表明,LPS刺激可促进CBP介导的TLR4第732位和第813位赖氨酸的乙酰化修饰。2、应用免疫共沉淀法分析TLR4及其两个突变体K732R和K813R与TRAM、TRIF和MyD88叁个接头蛋白的相互作用,结果表明,K732R突变阻断了TLR4与TRIF和MyD88的相互作用,而Κ813R突变阻断了TLR4与TRAM的相互作用。报告基因技术分析显示CBP过表达后,TLR4乙酰化程度增强,导致NF-κB和IRF3反应元件活性增加。相反,Κ732R和K813R突变均可降低IRF3反应元件的活性,而Κ732R突变则还可以使NF-κB反应元件活性降低。在TLR4-/-小鼠骨髓来源的巨噬细胞(Bone Marrow-Derived Macrophage, BMDM)中,应用半定量RT-PCR的方法分析了乙酰化对TLR4两条不同通路终产物的影响,结果显示,Κ732R和K813R突变可分别抑制IFNβ的合成释放,而Κ732R突变还可抑制IL6合成释放。以上结果表明TLR4第732位和第813位赖氨酸的乙酰化分别调控下游不同的信号通路。3、LPS刺激巨噬细胞系Raw264.7细胞,利用泛乙酰化抗体进行免疫印迹检测发现IRF3可发生乙酰化修饰。抑制内源CBP表达后,IRF3乙酰化显着降低,表明CBP介导IRF3的乙酰化修饰。为探索IRF3乙酰化修饰位点,我们用质谱法检测到IRF3第77位的Κ发生乙酰化修饰。在此基础上,我们构建了突变体Κ77R,并与CBP共表达后检测乙酰化程度。结果表明,与野生型IRF3相比,突变体的乙酰化程度显着降低。免疫印记法分析表明,加入去乙酰化酶6(Histone Deacetylase 6, HDAC 6)后,CBP/P300介导的IRF3的乙酰化程度显着下降,表明HDAC6介导IRF3的去乙酰化。免疫共沉淀法结果显示K77R突变阻断了IRF3二聚体的形成,而去乙酰化酶的抑制剂曲古抑菌素(Trichostatin A, TSA)和烟酰胺(Nicotinamide,NAM)则增强IRF3二聚体间的相互作用。免疫荧光法证实抑制内源CBP和K77R突变均能阻止IRF3入核。以上结果表明LPS诱导的乙酰化促进IRF3形成二聚体然后进入细胞核。主要结论：(1)LPS通过CBP介导TLR4第732位和第813位赖氨酸发生乙酰化修饰；(2)TLR4第732位赖氨酸的乙酰化参与了MyD88和TRAM/TRIF介导的信号通路的活化,而第813位赖氨酸的乙酰化则仅仅参与了TRAM/TRIF介导的信号通路的活化；(3)LPS诱导第77位赖氨酸的乙酰化促进IRF3形成二聚体进入细胞核。(二)TLR4甲基化修饰在LPS活化的炎症信号转导中的作用1、免疫共沉淀法分析表明TLR4可以与IRF3直接相互作用。LPS刺激巨噬细胞系Raw264.7细胞,利用泛甲基抗体进行免疫印迹检测发现TLR4可发生甲基化修饰。为探索TLR4甲基化修饰位点,我们构建两个突变体R731K,R812K,并与甲基化转移酶PRMT2共表达后检测甲基化程度。结果表明,与野生型TLR4相比,两个突变体的甲基化显着降低。以上结果表明,LPS刺激可促进PRMT2介导的TLR4第731位和第812位精氨酸的甲基化修饰2、应用免疫共沉淀法分析TLR4及其两个突变体R731K和R812K与IRF3的相互作用,结果表明,R812K突变阻断了TLR4与IRF3的相互作用。IRF3 R285K的突变也阻断TLR4与IRF3的相互作用。报告基因技术分析表明PRMT2过表达后,TLR4甲基化程度增强,导致IRF3反应元件活性增加。相反,R812K突变则降低IRF3反应元件的活性。在BMDM细胞中,用定量RT-PCR的方法检测了甲基化对TLR4-IRF3信号通路终产物的影响,结果显示,TLR4 R812K突变抑制IFNβ的合成释放。同样的结论在在293T细胞中也获得。以上结果表明,TLR4第812位精氨酸甲基化参与了IRF3的活化及其与TLR4的相互作用。3、LPS刺激巨噬细胞系Raw264.7细胞,利用泛甲基抗体进行免疫印迹检测发现IRF3可发生甲基化修饰。为探索IRF3甲基化修饰位点,我们构建了突变体R285K,并与PRMT2共表达后检测甲基化程度。结果表明,与野生型IRF3相比,突变体的甲基化程度显着降低。免疫共沉淀法和免疫荧光法证实R285K突变阻断了IRF3二聚体的形成并且阻止其进入细胞核。以上结果表明,LPS诱导的甲基化促进IRF3形成二聚体进入细胞核。主要结论：(1)LPS通过PRMT2介导TLR4第731位和第812位精氨酸发生甲基化修饰；(2)TLR4第812位精氨酸的甲基化参与了其与IRF3的直接相互作用以及IRF3的活化；(3)LPS诱导第285位精氨酸的甲基化促进IRF3形成二聚体进入细胞核。
杨清武[6]2002年在《TLR4在LPS激活内皮细胞中的作用及其可溶性受体表达》文中研究表明脓毒症是严重创伤、烧伤、休克、外科大手术后等常见的并发症，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征，已成为临床危重患者的重要死亡原因。越来越多的研究表明，内皮细胞在LPS引起的内毒素休克、多器官功能衰竭等病理过程中起着关键的作用。因此，深入研究LPS激活内皮细胞机制具有非常重要的意义。与巨噬细胞等髓样细胞不同，内皮细胞不表达mCD14，LPS对其的激活需要LBP和sCD14的参与，加之CD14缺乏跨膜区和胞浆内段，不能直接和细胞内进行信号交流，强烈提示内皮细胞膜上存在跨膜信号分子或跨膜受体。发现并鉴定内皮细胞上的跨膜信号分子，是深入理解LPS激活／损伤内皮细胞机制的关键。新近发现并广为研究的TLR4给上述研究带来了新的机遇。研究表明：TLR4是LPS的受体或信号转导分子，在LPS的病理生理效应中具有重要作用。那么，人内皮细胞是否表达TLR4?如果表达，它是否在LPS激活内皮细胞和信号转导通路中的具有重要作用?TLR4是不是人们长期探索的内皮细胞上LPS的Rt?如果它在LPS激活内皮细胞和信号转导通路中具有重要作用，则可以此为靶，探讨可溶性受体的拮抗效应。对此问题的研究，国内外很少报道。目前研究手段主要采用基因转染、基因突变以及基因敲除等技术，存在表达量低、技术难度较高、不易掌握的缺点。有报道运用抗体的手段进行研究，但多为多克隆，存在着针对性不强等问题。所以单克隆抗体的制备就成为急待解决的问题。 因此，本研究在制作抗人TLR4单克隆抗体的基础上，观察了人内皮 细胞TLR4的表达及LPS对其表达的影响，并对TLR4在LPS激活内皮细 胞和信号转导通路中的作用进行了初步研究；最后，克隆了TLR4的胞外“区，利用毕赤酵母表达系统对其初步表达。旨在为TLR4的相关研究提供 充足的研究材料，初步阐明TLR4在LPS激活／损伤内皮细胞机制和信号 转导通路中的作用。为深入研究和阐明LP S作用机理奠定基础和最终在 细胞受体水平为阻断LPS对内皮细胞的激活／损伤和G”菌脓毒症、脓毒性 休克的防治提供新靶点和新途径。 主要结果及结论如下： 一、预测的B细胞优势表位为＊＊R4＊89工02＞ ＊＊2－＊＊L＊＊R NNNNF。DSL NV．COOH，经毛细管电泳分析合成多肽的纯度达98二％。该表位多 肽能诱发小鼠产生抗TLR4抗血清，其效价为 1：32至 1：128，该多抗能 特异识别TLR4阳性细胞。表明以此制作抗人TLR4单克隆抗体是可行的。 二、经细胞融合和ELISA筛选，建立了能稳定分泌TLR4单抗的杂 交瘤细胞B4。制备了B4的培养上清和腹水，间接ELISA测定抗体效价， 培养上清为1：64～1：256，腹水的效价为1：10 00o。84分泌的抗体为ig＊2， K型，可特异识别TLR4阳性细胞，并具有阻断活性。表明成功制备了抗 人TLR4单克隆抗体。 叁、RT．PCR和 Western blot检测结果显示，人内皮细胞能表达 TLR4mRNA和TLR4蛋白，LPS能明显上调其表达水平，并呈时间和剂 量依赖性。初步说明TLR4在LPS激活内皮细胞效应中具有重要作用。 四、转染TLR4的功能突变体和运用抗人TLR4单克隆抗体后，LPS 对内皮细胞激活效应明显减弱，表现为 NF－K B活性明显降低，呈剂量依 赖性。进一步提示，TLR4在LPS对内皮细胞激活效应中具有重要的地位， 很可能为内皮细胞上LPS作用的受体／信号转导分子。 五、TLR4介导LPS对内皮细胞激活具有CD依赖性，同时，SCD14 可明显上调LPS对转染TLR4的293细胞NF。B激活，初步说明TLR4 与 CD间可能存在相互作用。成功构建了 TLR4胞外区和 CD的酵母 ·IX· ＼’表达载体，转化酵母Y187后，发现它们本身无自发激活活性，对酵母细胞也无毒性。酵母双杂交体系的实验结果表明，TLR4与 CD间存在相互作用。初步提示这可能为LPS跨膜信号转导的一种模式，为深入研究LPS的跨膜信号转导机理奠定了基础。。 六、成功构建了pPICgK1LR4酵母表达载体，经酶切和测序鉴定完全正确。电转化GS酵母菌后，经MD／His和G418筛选。共获得了200多个高拷贝菌株，并对其中的几个克隆进行PCR鉴定。结果表明，TLR4的胞外区基因完全整合到酵母菌中。 七、运用毕赤酵母初步表达了可溶性TLR4，SDS－PAGE电泳初步鉴定分子量约66kD，与TLR4胞外区蛋白的分子量一致，表明成功表达了TLR4可溶性受体，为进一步的筛选、表达、纯化和功能研究奠定了坚实。的基础。
方晓君[7]2008年在《TGFβ_1对脓毒症大鼠肝脏MD2表达的影响》文中研究表明目的:建立大鼠脓毒症模型,观察不同时间点大鼠肝脏髓样分化蛋白2(Myeloid Differential protein-2 MD2)表达情况和NF-κB含量动态变化,并给予外源性TGFβ1干预,探讨TGFβ1对大鼠脓毒症的作用及可能机制,为临床脓毒症的治疗提供思路。方法:1、动物分组:健康雄性CL级SD大鼠120只,体重在220-250g,随机编号分为叁组。对照组(假手术组):40只,按2h、6h、12h、24h、48h时间点再分为5组,每组各8只。模型组(脓毒症模型组):40只,按2h、6h、12h、24h、48h时间点再分为5组,每组各8只;建立盲肠结扎穿孔模型(Cecal Ligation and Puncture CLP),于造模后0.5h尾静脉注射生理盐水1ml/250g。TGFβ组(TGFβ干预组):40只,按2h、6h、12h、24h、48h时间点再分为5组,每组各8只;建立盲肠结扎穿孔(CLP)模型,于造模后0.5h尾静脉注射TGFβ1 20ng/ml·250g。2、标本取材:在各个时间点活杀大鼠,无菌取肝脏存放于离心管中,-80℃冰箱保存。待逆转录聚合酶链反应( Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction RT-PCR)及免疫酶联吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ELISA)检测使用。10%福尔马林溶液固定肝脏组织,常温保存,病理切片HE染色用。3、结果检测:HE染色光镜观察肝脏组织形态改变;用ELISA法测肝脏组织匀浆上清液NF-κB含量;RT-PCR法检测肝脏MD2mRNA的表达。结果:1、病理HE染色结果:对照组肝脏组织基本正常;模型组较对照组组织损伤严重,炎症细胞浸润多,伴有出血;TGFβ组较对照组仍有炎细胞浸润,但较模型组炎症细胞浸润减少,损伤减轻。2、ELISA法检测NF-κB结果:NF-κB在对照组各个时间点之间无差异;模型组(6h、12h、24h、48h)较对照组含量明显增加,差异有统计学意义(p<0.05),并且在24h达到最高,48h进入平台期。TGFβ组(6h、12h、24h)较模型组含量减少,差异有统计学意义(p<0.05)。3.RT-PCR结果:MD2mRNA在对照组有少量表达,各个时间点之间无差异;在模型组(6h、12h、24h、48h)较对照组表达明显增加,差异有统计学意义(p<0.05),并且在24h表达达到最高,48h进入平台期;TGFβ组(12h、24h)与模型组比较表达减少,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:1、MD2mRNA在正常生理条件下可少量表达,脓毒症时表达明显增加,提示LPS信号转导增强。2、脓毒症大鼠模型组NF-κB含量增加,提示炎症介质释放增加,炎症反应失控。3、外源性应用TGFβ后,使脓毒症大鼠肝脏MD2表达减少,NF-κB含量减少,提示TGFβ可能通过抑制LPS的信号转导,减轻炎症反应。但是TGFβ的抗炎症作用有限。4、TGFβ可为临床治疗脓毒症提供重要的思路及理论依据。
曾泽[8]2016年在《rfaE在副猪嗜血杆菌LPS致病过程中作用和机制的研究》文中研究说明副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是危害全球养猪业一个重要的细菌性病原,已造成巨大的经济损失。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌外膜的主要成分,也是重要的毒力因子,由脂质A,核心多糖和O-侧链多糖组成,核心多糖在LPS致病过程中起着重要的作用。rfaE基因编码的ADP-L-甘油-D-甘露庚糖参与核心多糖中L-甘油-D-甘露庚糖的合成,但是对rfaE基因在LPS致病过程中的具体作用还不清楚。本实验的目的是以血清4型强毒株SC096为亲本株,构建ΔrfaE缺失株和互补株,研究其生长速度、对细胞的粘附入侵能力和抗血清杀菌能力等生物学特性,并提取其LPS,研究其对细胞和机体炎症刺激反应的影响及机制,取得如下成果:1.HPS SC096株ΔrfaE缺失株和互补株的构建为了研究rfaE基因在HPS SC096株致病过程中的作用及机制,本实验用已优化的自然转化方法,构建将含有红霉素抗性片段的重组质粒p ZZ2,并将重组质粒p ZZ2自然转化到野生型菌株SC096中,获得ΔrfaE缺失株,经过PCR检测和基因测序进行鉴定表明ΔrfaE缺失株构建成功。构建rfaE基因单拷贝基于染色体的互补质粒p ZZ3,并将互补质粒p ZZ3转化到ΔrfaE缺失株,获得cΔrfaE互补株。通过PCR检测和基因测序进行鉴定表明cΔrfaE互补株构建成功。这为研究rfaE基因在HPS致病过程中的作用及机制奠定了基础。2.ΔrfaE缺失株生物学特性的研究为了研究rfaE基因在HPS SC096株LPS糖型的变化,生长特性,抗血清杀菌作用和对宿主细胞的黏附入侵作用等生物学特性中的作用。提取菌株LPS,并将提取的LPS进行SDS-PAGE电泳和银染。结果发现ΔrfaE缺失株LPS(ΔrfaE-LPS)在蛋白胶上的泳动速度明显快于HPS SC096菌株LPS(HPS-LPS)的泳动速度,cΔrfaE互补株LPS(cΔrfaE-LPS)的泳动速度和HPS-LPS相似。通过生长特性的测定,发现ΔrfaE缺失株(代时为69 min)的生长速度明显变慢(p<0.05),而cΔrfaE互补株(代时为60 min)的生长能力恢复到SC096菌株(代时为59 min)水平。以猪肾上皮细胞(PK-15)和猪脐静脉血管内皮细胞(PUVEC)为模型,测定缺失rfaE基因后菌株对PK-15和PUVEC细胞黏附和入侵能力的变化。结果发现与SC096菌株相比,ΔrfaE缺失株对PK-15和PUVEC细胞的黏附和入侵能力分别降低了10倍和12倍(p<0.001)。在抗血清杀菌实验中,结果发现与SC096菌株相比,ΔrfaE缺失株在50%和90%的血清中的存活率分别降低了30倍和36倍(p<0.001),而cΔrfaE互补株对血清的敏感性恢复到与SC096菌株一致。上述实验结果表明缺失rfaE基因后菌株的LPS糖链结构明显变短,生长速度变慢,对宿主细胞的黏附入侵能力和抗血清杀菌作用显着降低。3.ΔrfaE缺失株LPS诱导炎性因子表达的研究为了研究rfaE基因在LPS诱导炎性因子表达中的作用。提取LPS,用5μg/mL和10μg/m L的LPS刺激猪肺泡巨噬细胞(PAMs),分别在2 h,4 h,6 h,12 h和24 h后收集细胞,提取RNA并反转录成c DNA,运用Real-Time PCR检测IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的m RNA转录水平。以核糖体蛋白L4(RPL4)作为内参基因,用2-ΔΔCT方法计算炎性因子的m RNA相对表达量。结果表明用5μg/m L HPS-LPS刺激细胞时,2 h,4 h,6 h,12 h和24 h后IL-1α的m RNA转录水平显着高于ΔrfaE-LPS刺激组IL-1α的m RNA转录水平(P<0.05),12 h和24 h后IL-1β、IL-6和IL-8的m RNA转录水平显着高于ΔrfaE-LPS刺激组m RNA转录水平(P<0.05),24 h后TNF-α的m RNA转录水平显着高于ΔrfaE-LPS刺激组m RNA转录水平(P<0.05),与HPS-LPS刺激组相比,ΔrfaE-LPS刺激组IL-1α和IL-8的m RNA转录水平降低倍数最高为2倍;10μg/m L HPS-LPS刺激细胞后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的m RNA转录水平显着高于ΔrfaE-LPS刺激组m RNA转录水平(P<0.05),与HPS-LPS刺激组相比,ΔrfaE-LPS刺激组IL-1α和IL-8的m RNA转录水平降低倍数最高分别为7倍和4倍。同时5μg/m L和10μg/m L cΔrfaE-LPS刺激PAMs后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的m RNA转录水平能够恢复到HPS-LPS水平。用80μg LPS腹腔注射BALB/c小鼠,分别在6 h和12 h后去眼球采血,分离血清。用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IL-1α,IL-6,IL-8和TNF-α的表达量,结果显示HPS-LPS刺激小鼠后IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α的表达量均升高,且细胞因子的表达量具有时间依赖性,随着时间延长炎性因子的表达量升高。与HPS-LPS刺激组相比,ΔrfaE-LPS刺激小鼠后IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α的表达量分别降低了约4倍、5倍、3倍和8倍。cΔrfaE-LPS刺激小鼠后IL-1α、IL-6、 IL-8和TNF-α的表达量恢复到HPS-LPS水平。以上实验结果表明,HPS-LPS均能诱导PAMs及小鼠产生炎症反应,缺失掉rfaE基因后HPS-LPS诱导PAMs及小鼠的炎症反应能力均显着降低,这表明rfaE基因调节了HPS-LPS诱导的炎症反应。4.ΔrfaE缺失株LPS诱导NF-κB和MAPK信号通路的研究鉴于缺失rfaE基因后菌株诱导炎性反应能力的降低,本研究应用Real-Time PCR和Western blot方法比较HPS-LPS和ΔrfaE-LPS对NF-κB和MAPK信号通路的影响。Real-Time PCR方法结果表明ΔrfaE-LPS刺激PAMs后TLR4、MD2、My D88、MAP2K2、ERK、P38和JNK的m RNA转录水平均显着低于HPS-LPS刺激细胞后信号通路分子的m RNA转录水平,cΔrfaE-LPS刺激PAMs后信号通路分子的m RNA转录水平均恢复HPS-LPS水平,但NF-κB的m RNA转录水平无显着差异。Western blot方法结果表明HPS-LPS刺激PAMs后IκBα的蛋白表达量显著低于ΔrfaE-LPS刺激PAMs后IκBα的蛋白表达量,降低了约1倍,而NF-κB p65和MAPK p38的磷酸化水平显着高于ΔrfaE-LPS刺激PAMs后的磷酸化水平,分别升高了约2倍和1倍,cΔrfaE-LPS刺激PAMs后IκBα的蛋白表达量,NF-κB p65和MAPK p38的磷酸化水平均恢复到HPS-LPS水平。以上实验结果证实了在HPS-LPS诱导的炎症反应中,缺失rfaE基因后通过降低NF-κB和MAPK p38信号通路活性以减轻炎症反应。在本研究中,我们成功构建了HPS SC096的ΔrfaE缺失株;证明rfaE基因参与HPS LPS的合成,并参与了HPS对宿主细胞的黏附入侵作用和抗血清杀菌作用;同时还证实了rfaE基因通过调节NF-κB和MAPK P38信号通路活性来影响HPS LPS诱导PAMs炎性因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的合成和表达。
忻寅强[9]2013年在《热休克蛋白27(HSP27)的磷酸化通过影响Toll样受体4(TLR4)的转运调控下游炎症信号通路》文中研究指明热休克蛋白27(Heat shock prote in 27, HSP27)是小热休克蛋白家族最重要的成员之一,其生理功能主要包括保护细胞免受各种应激因素如自由基、高温、缺血和毒性物质的损伤,促进蛋白质的正确折迭、组装,参与细胞的发育,增殖、分化及细胞凋亡的信号调节和肌动蛋白丝重建等。有关HSP27在各种信号通路的调节作用得到了广泛的研究,但是对于HSP27磷酸化修饰的意义目前还不十分明确。本课题对HSP27以其磷酸化形式在细菌脂多糖(LPS)引起的炎症反应中以Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)为靶点所起的调控作用进行了研究。首先,延续本实验室之前的研究方向,本研究确认了HSP27在LPS引起的炎症反应过程中有磷酸化激活。在初步探索实验中,我们发现HSP27人单核细胞型淋巴瘤细胞株THP1中高表达,在LPS刺激下Ser15位和Ser78位在2小时内有一个显着的磷酸化和去磷酸化的过程。我们随后使用叁方面的手段控制HSP27的磷酸化：一是使用抑制剂,包括特异性HSP27磷酸化抑制剂KRIBB3和HSP27上游激酶p38 MAPK的抑制剂SB203580；二是对HSP27的直接上游激酶MK2(丝裂活化蛋白激酶活化蛋白激酶.2,MAP kinase-activated protein kinase 2, MAPKAPK2)进行RNA干扰(RNA interference, RNAi),削弱HSP27的磷酸化；叁是使用HSP27的叁个主要磷酸化位点的突变质粒HSP27-3D(S15/78/82D),在细胞中过表达模拟磷酸化形式的HSP27。在THP.1细胞中,使用抑制剂(KRIBB3和SB203580)和MK2 RNAi可以显着的抑制细胞炎症因子的释放,并且影响了指标性的炎症相关酶iNOS和COX-2的蛋白表达。此外,在使用了这两种抑制HSP27磷酸化的处理后,在LPS刺激的情况下,以NF-kB和IRF3的激活分别为标志的TLR4下游MyD88依赖型和MyD88非依赖型/TRIF依赖型两条通路均被下调。使用TLR3的刺激源poly(IC)刺激THP1细胞后我们发现通过TLR3激活的IRF3激活无法通过抑制HSP27磷酸化而被抑制。在LPS刺激后单核/巨噬细胞的吞噬功能会加强,吞噬能力是在细胞水平反应炎症反应强度的一个标志。本研究使用荧光乳胶颗粒和荧光偶联LPS结合激光共聚焦和流式细胞术等手段发现了KRIBB3和SB203580可以削弱细胞吞噬能力。为了在整体水平上验证HSP27磷酸化对炎症的调控,我们建立了内毒素休克模型检测KRIBB3对急性炎症的治疗效果,实验中发现KRIBB3可以显着增加内毒素休克小鼠的存活率,表明抑制HSP27的磷酸化对于细菌感染性炎症确有一定的治疗作用。由于在细胞和整体模型水平上,我们均发现了抑制HSP27的磷酸化都能明显削弱炎症反应,我们进一步研究HSP27的磷酸化调控炎症反应的机制。既然控制HSP27磷酸化可以同时影响LPS引起的MyD88依赖型的和MyD88非依赖型的两条通路,抑制HSP27又不能显着抑制TLR3激活的MyD88非依赖型通路,说明其作用靶点处于信号通路上游位置。此外有报道细胞吞噬能力与外界病原对应的细胞表面TLRs的表达水平密切相关,考虑抑制HSP27也能抑制吞噬,故我们将研究方向落在了LPS的受体TLR4和TLR2之上。流式细胞术的结果证明了TLR2的膜分布在LPS刺激后变化不大并且也与HSP27磷酸化抑制剂没有显着联系。而LPS刺激下TLR4经历了膜定位上调后下降的趋势,KRIBB3和SB203580则可以去除这种趋势。根据已有报道,高尔基体是TLR4除了细胞膜外的另一个胞内聚集区室,也是趋向细胞膜的转运发生前所在的位置。我们使用了高尔基体特异性标记抗体进行激光共聚焦检测,发现TLR4在LPS后从高尔基体的趋膜转运可以被抑制剂阻断,与流式细胞术的结果相一致。同时我们通过免疫荧光和激光共聚焦手段,发现THP1细胞在接受LPS刺激后,胞内分散分布的HSP27有部分向高尔基体聚集的现象,这与已有报道的在其他炎症细胞系(小鼠巨噬样细胞J774.1)中的观察结果一致,在时间上略早于TLR4膜表面水平上调。结合前文结果,暗示抑制HSP27的磷酸化可以影响到由高尔基体起始的TLR4的转运和趋向细胞膜的分布,这可能是HSP27在上游调节TLR4通路的原因所在。在进一步的研究中使用免疫沉淀的方法证明了HSP27与TLR4在胞内可以形成复合体,在LPS刺激之后与TLR4结合增多。通过转染磷酸化突变体检测外源HSP27与TLR4的结合,又采取了新颖的二次串联IP实验方法辅证,我们发现了HSP27是以其磷酸化形式与TLR4结合并发挥作用的。此外为了研究更为细节的调控本质,本研究做了TLR4糖基化研究的初探,因为TLR4由高尔基体向膜上定位的过程必须经过一个糖基化成熟的过程,有意思的是我们发现了HSP27磷酸化抑制剂KRIBB3可以部分的抑制TLR4的糖基化过程。综上所述,本研究首次揭示了磷酸化形式的HSP27参与调节了LPS引起的炎症反应；在国际上首次提出了HSP27的磷酸化通过影响TLR4的糖基化调控其成熟与转运这一种全新的调控机制。这些结果对深入研究HSP27在细菌感染性炎症反应的地位和以HSP27的磷酸化为抗炎靶点进行药物开发具有重要的指导意义。
钟山[10]2001年在《TOLL样受体4(TLR4)基因的克隆及其在介导LPS细胞反应中的机理研究》文中进行了进一步梳理研究背景 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）即存在于细胞壁外膜中的内毒素（endotoxin）成分，在革兰阴性菌感染的致病机理中起着十分重要的作用，亦是内毒素中毒休克发生的主要病因。对LPS介导的毒性反应一直是研究的热点，自80年代发现人类Toll样受体后，对LPS引起机体损伤的机制逐渐明朗化。最近的研究表明，LPS引起的免疫反应与Toll样受体有很大的关系，由TLR2和TLR4作为LPS信号转导受体，通过MyD88蛋白与IL-IR信号转导途径重合，最终导致NF-κB的激活，引起各种炎症因子基因表达。从C3H/HeJ小鼠获得的TLR4含有一个单氨基酸突变，导致对LPS的低反应性；而从TLR2缺陷小鼠分离出的巨噬细胞和B细胞对LPS反应的程度几乎与从野生型小鼠分离出的相同；中国仓鼠细胞（CHO）虽然对LPS有完全反应性，但它的基因组型编码的是TLR2的无功能基因；U973细胞虽然缺乏TLR2的表达，但也保留对LPS的反应性。所有这些研究都证明TLR4是LPS诱导的免疫反应的信号转导受体。研究目的 本研究从原代培养的人脐静脉内皮细胞中克隆TLR4的细胞外段基因，进行表达；并将TLR4基因导入不表达TLR4的HL60和人皮肤成纤维细胞，观察LPS对这两种转染细胞的反应。研究方法 1、以原代培养的人脐静脉内皮细胞总RNA为模板，RT-PCR扩增TLR4细胞外 段基因，插入pMD18-T质粒，转化后，阳性克隆送全自动荧光测序。 2、将TLR4细胞外段基因克隆入pET-11a表达载体，获得重组表达的TLR4胞外 区蛋白。 3、将含TLR4全长基因的pCMVSPORT3质粒用Kpn Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，酶切产 物定向插入pcDNA3.1（+）质粒，转化后，阳性克隆提取质粒，以脂质体法 转染HL60和原代培养的人皮肤成纤维细胞，G418选择培养基筛选阳性细 胞。 4、将转染TLR4基因的细胞用LPS作用，观察TLR4对LPS反应的影响。研究结果 1、RT-PCR扩增出TLR4胞外区基因并克隆，送全自动荧光测序，与发表文献序 列一致。 中文摘要 一 2、将 TLR4胞外区基因克隆入 PET－118表达载体，重组表达 TLR4胞外区蛋白， 获得分子量为71kDa（SDS－PAGE）的预期蛋白。 3、将TLR4全长基因转染HL60和人皮肤成纤维细胞，获得稳定表达TLR4的 HL60细胞株。 4、TLR4可增强LPS对细胞的一定生长抑制作用，血清因子发挥协同增强作 用。 结论 成功从原代培养的人脐静脉内皮细胞中扩增出TLR4细胞外段基因，证实在LPS 反应中内皮细胞的信号转导途径可能与单核细胞、B细胞一样，是通过TLR介导 的。并将TLR4细胞外段克隆入pET叶 表达载体，获得71kDa的目的蛋白，为后续 研究TLR4胞外区功能打下基础。在稳定表达TLR4的HL60细胞株中，TLR4可增强 LPS对细胞的生长抑制作用，血清因子对TLR4的功能有协同作用。
参考文献：
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[4]. 云芝糖肽（PSP）对小鼠巨噬细胞的双向免疫调节及NF-κB信号通路的调控研究[D]. 任文智. 上海师范大学. 2010
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[6]. TLR4在LPS激活内皮细胞中的作用及其可溶性受体表达[D]. 杨清武. 第叁军医大学. 2002
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[10]. TOLL样受体4(TLR4)基因的克隆及其在介导LPS细胞反应中的机理研究[D]. 钟山. 第二军医大学. 2001