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基于VP0蛋白检测1型和3型DHAV抗体的间接ELISA的建立及应用

2020-12-08阅读(660)

基于VP0蛋白检测1型和3型DHAV抗体的间接ELISA的建立及应用

论文摘要

鸭病毒性肝炎（Duck Viral Hepatitis,DVH）是由鸭肝炎病毒（Duck Hepatitis virus,DHV）引起的雏鸭的一种急性、致死性疾病,由于其发病迅速且死亡率高,给养鸭业造成了巨大的经济损失。我国鸭病毒性肝炎主要是由DHAV-1和DHAV-3引起的,且比较常见的感染形式为两种型混合感染,因此急需一种操作简单、快速、成本低廉,且检出抗体全面的的检测方法。本研究首先以实验室保存的携带1型和3型VP0/VP3/VP1的重组质粒pMD18T-DHAV-1-1/2和pMD18T-DHAV3-1/2为模板,通过PCR扩增得到DHAV-1/3-VP0、DHAV-1/3-VP3和DHAV-1/3-VP1目的基因,将其克隆至pET-30a（+）和pET-32a（+）原核表达载体中,进行蛋白的原核表达,获得了Rosetta-pET30a-DHAV1/3-VP0、Rosetta-pET32a-DHAV1/3-VP1和Rosetta-pET30a-DHAV1/3-VP3重组蛋白。以纯化后的重组蛋白为抗原,利用Western Blot分别与同型和异型的鸭血清抗体进行免疫反应性分析,结果表明,重组VP0/VP1蛋白与同型和异型的鸭血清抗体均可发生反应,而重组VP3蛋白仅可与同型的鸭血清抗体反应。分别以纯化的6段重组蛋白作为包被抗原,利用ELISA方法检测重组蛋白与同型和异型血清抗体的免疫反应性,结果发现1型和3型重组VP0/VP3/VP1蛋白均可同时与同型和异型的血清抗体发生反应,重组VP0和VP3蛋白与同型抗体反应的强度大于与异型抗体反应的强度,重组VP1蛋白与同型和异型反应的强度相近。Western Blot和ELISA分析重组蛋白免疫反应性结果表明:重组VP0和VP1蛋白适合作DHAV血清抗体检测的群特异性抗原。综上,以纯化的1型重组VP0蛋白作为包被抗原,建立了一种可同时检测DAHV（1型和3型）血清抗体的ELISA方法。通过对方法进行优化,最佳的反应条件为:以0.25μg/mL 1型DHAV VP0重组蛋白37℃孵育2 h后4℃包被过夜;5%脱脂乳37℃封闭90 min;被检血清1:100倍稀释,37℃孵育1 h;HRP标记的山羊抗鸭IgG进行1:400倍稀释,37℃孵育1 h;TMB显色液避光显色15 min。通过对118份阴性鸭血清进行检测,最终确定阴阳性临界值为0.307;特异性试验结果显示,所建立的间接ELISA只与DHAV（1型和3型）阳性血清呈阳性反应,与鸭源小鹅瘟抗体、鸭病毒性肠炎抗体、禽流感H9N2亚型抗体、鸭坦布苏抗体等均无交叉反应;敏感性试验结果显示,所建立的间接ELISA最低检出量为1:320;该方法的板内和板间的变异系数均小于10%;应用本研究建立的VP0-ELISA检测方法与鸭甲肝病毒抗体（DHAV-Ab）定性ELISA检测试剂盒同时检测一批临床血清样本,两种检测方法符合率高达95.7%。说明本方法可初步应用于鸭甲型病毒肝炎抗体的检测,为今后DHAV感染的检测及二价疫苗免疫效果的评价提供技术支持,实现鸭病毒性肝炎的快速血清学诊断,进而促进养鸭业的健康发展。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 前言
  •   1.1 鸭甲肝病毒的概述
  •     1.1.1 鸭甲肝病毒的分类地位
  •     1.1.2 鸭甲肝病毒研究的发展史
  •   1.2 鸭甲型肝炎病毒的基因结构特点
  •     1.2.1 DHAV的基因组结构特征
  •     1.2.2 DHAV的蛋白结构及功能
  •   1.3 鸭肝炎病毒抗体检测方法
  •     1.3.1 中和试验
  •     1.3.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）
  •     1.3.3 间接血凝试验
  •     1.3.4 补体结合试验
  •     1.3.5 琼脂扩散试验
  •   1.4 DHAV的防控
  •     1.4.1 疫苗防治
  •     1.4.2 高免血清和高免卵黄抗体的防治
  •     1.4.3 药物防治
  •   1.5 本研究的目的和意义
  • 2 材料与方法
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 毒株、血清和试验动物
  •     2.1.2 质粒、菌种及载体
  •     2.1.3 酶、抗体及主要试剂
  •     2.1.4 仪器
  •     2.1.5 主要溶液配制
  •   2.2 方法
  •     2.2.1 种鸭的免疫及免疫后血清的采集
  •     2.2.2 免疫种鸭的卵黄抗体的提取及分离
  •     2.2.3 1型和3型DHAV-VP0/VP3/VP1基因的克隆及原核表达载体的构建
  •     2.2.4 1型和3型DHAV-VP0/VP3/VP1的原核表达及纯化
  •     2.2.5 重组蛋白的免疫反应性鉴定
  •     2.2.6 基于重组VP0蛋白的间接ELISA的建立
  •     2.2.7 ELISA方法检测血清样本的初步应用
  • 3 结果与分析
  •   3.1 1型和3型DHAV-VP0/VP3/VP1重组蛋白的免疫反应性筛选
  •     3.1.1 1型和3型DHAV-VP0/VP3/VP1基因的克隆
  •     3.1.2 重组克隆质粒的鉴定
  •     3.1.3 原核表达载体的构建
  •     3.1.4 目的蛋白的诱导表达及纯化
  •     3.1.5 重组蛋白免疫反应性的Western Blot分析
  •     3.1.6 重组蛋白免疫反应性的ELISA分析
  •   3.2 VP0-ELISA检测方法的建立
  •     3.2.1 最适包被液的选择
  •     3.2.2 抗原最佳包被时间的确定
  •     3.2.3 最佳封闭液的选择
  •     3.2.4 最佳封闭时间的确定
  •     3.2.5 最佳血清抗体工作时间的确定
  •     3.2.6 酶标二抗最佳工作浓度的确定
  •     3.2.7 酶标二抗工作时间的确定
  •     3.2.8 底物显色时间的确定
  •   3.3 VP0-ELISA检测方法临界值的确定
  •   3.4 特异性试验
  •   3.5 敏感性试验
  •   3.6 重复性试验
  •   3.7 抗原包被保存期
  •   3.8 符合率试验
  •   3.9 VP0-ELISA方法检测血清样本的初步应用
  •     3.9.1 免疫鸭血清抗体消长规律的评价
  •     3.9.2 临床样本的检测
  •     3.9.3 免疫种鸭的卵黄抗体的检测
  •     3.9.4 雏鸭体内母源抗体的检测
  • 4 讨论
  •   4.1 研究背景
  •   4.2 抗原的选择
  •   4.3 基于重组VP0蛋白的DHAV抗体检测间接ELISA
  •   4.4 ELISA临界值的判定和符合率
  •   4.5 血清抗体消长规律的评价
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间发表的学术论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 戚海惠

    导师: 马波

    关键词: 结构蛋白,间接,检测

    来源: 东北农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 东北农业大学

    分类号: S852.4

    总页数: 62

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