邹纯朴[1]2004年在《地黄饮子对Aβ致海马神经元损伤影响的实验研究》文中认为本课题通过建立β淀粉蛋白损伤离体培养的海马神经元模型，运用光、电镜技术及免疫组化、生物化学、高效液相及分子生物学等先进的检测手段和方法，从细胞及分子水平进一步探索了Aβ与老年性痴呆(AD)发生、发展密切相关的综合机制，从而全面深入地探讨了地黄饮子防治AD的作用机理。结果显示：一、地黄饮子能有效改善海马神经元生存状态，提高细胞生存活力。二、地黄饮子能明显降低海马神经元受β淀粉蛋白刺激时即早基因c-fos和c-jun的过度反应，提高海马神经元对外界不良刺激的应激性。叁、地黄饮子能提高培养液中SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶活性，提高对自由基清除能力。四、地黄饮子能有效抑制β淀粉蛋白损伤海马神经元所致的钙超载现象，保护细胞膜结构。五、地黄饮子是通过调控bcl-2／bax的比值、降低caspase-3基因mRNA的表达来抑制β淀粉蛋白损伤时海马神经元的过度凋亡。六、离体实验结果表明，地黄饮子对海马神经元的保护作用呈剂量依赖性，高剂量作用最好。并且明确了地黄饮子对脑内神经细胞损伤的保护作用可能是通过两种途径实现的：一是地黄饮子的某些有效成分透过血脑屏障直接发挥保护作用；二是地黄饮子通过激发促进机体保护神经细胞损伤的内源性物质的高表达达到治疗目的。
周妍妍[2]2007年在《地黄饮子对Aβ致PC12细胞损伤影响的实验研究》文中认为老年性痴呆(Alzheimer's disease，AD)是一种中枢神经系统原发性退行性变性疾病，临床主要表现为进行性记忆、理解、判断、定向等认知功能障碍，精神行为异常以及生活能力减退。该病不仅是一种随年龄增长而发病率升高的疾病，而且是一种致残率、致死率很高的疾病，给家庭和社会带来巨大的精神和经济负担，因而深入探讨AD的发病机制，研究有效的治疗措施是世界瞩目的重大课题。本课题在以往地黄饮子防治AD系列研究的基础上，采用脑脊液药理学方法，通过建立β淀粉样蛋白诱导PC12细胞损伤的AD细胞模型，运用实时荧光定量PCR、Werstern blot、免疫细胞化学、生物化学及光、电镜技术等先进的检测方法和手段，从细胞及分子水平对地黄饮子防治AD的作用及其机制进行探讨。结果显示：一、地黄饮子可显着改善Aβ25-35损伤引起的PC12细胞形态的改变，减轻细胞膜损伤，增强细胞活力，减少损伤所致的细胞死亡。二、地黄饮子能提高PC12细胞培养液中SOD的活性，上调SODmRNA的表达，降低培养液中MDA的含量，提高自由基清除能力，减少自由基对PC12细胞的损伤。叁、地黄饮子能明显提高Aβ25-35损伤时PC12细胞ChAT的表达，通过减轻胆碱能系统的损害防治AD。四、地黄饮子能抑制Aβ25-35损伤时PC12细胞微管相关蛋白tau的表达，从而起到防治AD的作用。
韩冉, 马涛, 张志辰, 高阔, 高俊峰[3]2018年在《地黄饮子治疗阿尔茨海默病的实验研究进展》文中研究说明地黄饮子出自《黄帝内经·素问·宣明论方》,其中君药肉苁蓉、巴戟天、熟地黄、山茱萸,温壮肾阳、滋补肾阴、填精益髓;臣药附子、肉桂、麦冬、石斛、五味子,保养真元、滋阴敛液;佐药远志、石菖蒲、茯苓,豁痰开窍;使药薄荷、生姜、大枣和其营卫。阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是神经退行性疾病,在中医学中属于呆病的范畴。AD发病机制复杂,涉及多个病理环节,且因其发病隐匿,进程不可逆,危害大、致死致残率高。基于中医理论的中药复方在治疗AD中具有独特优势。近年研究表明,地黄饮子临床治疗AD具有明确疗效,其药理作用机制包括保护线粒体结构与功能、改善能量代谢、抗氧化、调节β淀粉样蛋白前体蛋白(beta amyloid precursor protein,APP)加工和β淀粉样蛋白(amyloidβprotein,Aβ)代谢、抗神经元凋亡、调节神经递质、保护突触结构与功能及抗炎作用等多个方面。本文总结近年来地黄饮子治疗AD作用机制的实验研究进展做一综述。
姜卓, 宋琳, 朴钟源, 邸智勇, 房秋菊[4]2017年在《地黄饮子组成药物的中药有效成分治疗AD研究进展》文中研究指明阿尔茨海默病是一种中枢神经系统退行性疾病,以进行性认知功能障碍和认知、行为损害为主要临床表现,常发生在老年和老年前期,起病非常隐匿,还未有药物能够治愈。阿尔茨海默病的发病机制异常复杂,目前存在多种假说,临床上针对单一靶点的药物治疗效果不佳。而近年来研究发现地黄饮子在防治阿尔茨海默病方面有一定疗效,其中单味中药及其有效成分的研究也日益受到重视。本文对地黄饮子组成药物的中药有效成分防治阿尔茨海默的实验研究进行综述。
吴金娟[5]2014年在《改良叁甲散调控老年性痴呆病炎性因子的机理研究》文中研究说明老年性痴呆病,即阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD),是一种原因未明的以缓慢出现智力功能减退为特征的慢性进行性神经变性病。本文从理论和实验两个方面探讨了改良叁甲散治疗老年性痴呆病的相关作用,进而阐明在AD中抗炎作用机制,为探索防治AD有效方药提供相关的理论和实验依据,取得了一定的研究成果。在理论研究方面,根据中医“肾藏精,生髓”、“脑为髓之海”等理论,深入分析探讨“肾虚痰凝血瘀”在AD病变中的重要作用,确立改良叁甲散作为治疗AD的主要方药。从炎症反应和抗炎机制的角度,探讨改良叁甲散治疗AD的作用原理。在实验研究方面,采用细胞实验方法,研制以经老化处理的Aβ25-35加入大鼠海马神经元复制海马神经元AD模型,设立空白对照组、模型对照组、石杉碱甲组、改良叁甲散低、中和高剂量组,通过若干炎性因子指标来观察改良叁甲散对于本病的治疗效果,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞上清液中炎性因子IL-α、IL-1β、IL-6、TNF-α、TNF-β和NF-κB的含量。结果显示改良叁甲散能降低细胞上清液中IL-1α、IL-1β、 IL-6、TNF-α、TNF-β和NF-κB的含量,表明改良叁甲散含药脑脊液对Aβ25-35所致海马神经元细胞损伤的炎症反应有明显的抗炎作用,这种抗炎效应的可能机制是其能抑制Aβ沉积引起的炎症反应,降低神经细胞对Aβ的敏感性,抑制炎性因子IL-1α、IL-1β、IL-6、 TNF-α、TNF-β和NF-κB的释放,减少对神经细胞的神经毒性作用,从而保护神经元细胞。
张晓杰[6]2007年在《大鼠脑内注射Aβ_（1-40）致海马损伤的炎症相关机制及通络救脑口服液的作用》文中研究说明目的观察通络救脑口服液对双侧海马注射Aβ1-40建立的AD模型大鼠学习记忆能力的影响及其干预的分子机制,为该药临床应用提供科学的依据。方法:鼠龄8~(-1)2周的SD雄性大鼠140随机分为通络救脑口服液低剂量组(12 mg? k g~(-1)?d~(-1))、通络救脑口服液中剂量组(24 mg? k g~(-1)?d~(-1))、通络救脑口服液高剂量组(48 mg? k g~(-1)?d~(-1))、模型组、盐酸多奈哌齐组、假手术组和空白对照组共七组。采用大鼠大脑海马立体定向注射β-淀粉样蛋白1-40建立AD大鼠模型,复制AD模型后第叁天通络救脑口服液组、盐酸多奈哌齐组给药干预共28天后检测各项指标。采用Morris水迷宫测试大鼠寻找平台所需时间和通过原平台次数以检测大鼠空间学习记忆能力的变化,取海马组织电镜观察超微结构的变化,采用免疫组织化学染色和计算机图像分析技术测定海马区AChE、ChAT、NF-κB、CRP、NOS和SS蛋白阳性目标积分光密度以检测其表达的变化,应用实时定量PCR法(SYBR? GreenⅠ嵌合荧光法)检测Bax、Bcl-2、APP、BACE1 mRNA表达的变化,采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清TNFα和IL~(-1)β含量的变化,采用免疫印迹法检测SYP和caspase-3蛋白含量的变化,采用分光光度法检测了SOD、MDA、MAO酶活性的变化,采用荧光分光光度法检测了脂褐素的含量变化,以及通络救脑口服液对上述指标的影响。结果:Morris水迷宫实验显示:模型组大鼠在定位航行试验中隐匿平台平均逃避潜伏期较正常组显着延长,空间探索试验中跨越原平台位置次数明显减少(P<0.01),通络救脑口服液各剂量组平均逃避潜伏期较模型组显着缩短,跨越原平台位置次数明显增加(P<0.01),但与盐酸多奈哌齐组和正常对照组比较差异无显着性(P>0.05)。实时定量PCR结果显示:模型组BACE1 2-ΔΔCt为4.67±0.52 ,2-ΔΔCt显着多于假手术组(1.07±0.08,p<0.01),表明模型组BACE1 mRNA表达上调;与模型组比较,盐酸多奈哌齐组(1.80±0.23)、通络救脑口服液低、中、高各剂量组(分别为2.92±0.22、1.54±0.25和0.54±0.11)2-ΔΔCt显着减少,表明BACE1 mRNA表达下调。模型组APP 2-ΔΔCt为5.88±0.70,2-ΔΔCt显着多于假手术组(1.57±0.16,p<0.01),表明模型组APP mRNA表达上调;与模型组比较,盐酸多奈哌齐组(3.99±0.52)、通络救脑口服液低、中、高各剂量组(分别为4.24±0.44, 2.93±0.49, 2.53±0.43)2-ΔΔCt显着减少,表明APP mRNA表达下调。与假手术组Bax 2-ΔΔCt比较(1.79±0.13),模型组Bax 2-ΔΔCt显着升高(4.17±0.38),差异具有统计学意义(p<0.05),表明模型组Bax mRNA表达上调。与模型组Bax 2-ΔΔCt (4.17±0.38)比较,盐酸多奈哌齐组Bax 2-ΔΔCt (3.37±0.37))、通络救脑口服液低、中、高各剂量组Bax 2-ΔΔCt (2.52±0.68、1.89±0.38、1.58±0.22)显着降低,表明Bax mRNA表达下调;与假手术组Bcl-2 2-ΔΔCt(0.52±0.10)比较,模型组Bcl-2 2-ΔΔCt(0.12±0.02)明显降低,表明模型组Bcl-2 mRNA表达下调,差异具有统计学意义(p<0.05)。而盐酸多奈哌齐组Bcl-2 2-ΔΔC(t0.14±0.03)、通络救脑口服液低、中、高各剂量组Bcl-2 2-ΔΔC(t0.16±0.03、0.29±0.04、0.31±0.05)显着升高,表明Bcl-2 mRNA表达上调。免疫组化实验结果显示:与假手术组比较(3.10±0.39),模型组大鼠海马区CRP蛋白表达增高(8.95±0.57) ) (p<0.05),与模型组比较,通络救脑口服液低、中、高各剂量组CRP蛋白表达(分别为6.36±0.53, 5.57±0.34, 4.76±0.31)显着降低(P<0.05)。与假手术组比较(3.01±0.19),模型组NF-κB蛋白表达增高(6.90±0.80) ) (p<0.05),与模型组比较,通络救脑口服液低、中、高各剂量组NF-kappa B蛋白表达(分别为5.71±0.49, 4.58±0.34, 4.57±0.35)显着降低(P<0.05)。与假手术组比较(5.74±0.39),模型组大鼠海马区NOS1蛋白表达降低(2.38±0.30) (p<0.05),与模型组比较,通络救脑口服液低、中、高各剂量组NOS1蛋白表达(分别为3.57±0.30, 3.80±0.24, 4.99±0.31)显着升高(P<0.05)。与假手术组比较(8.45±0.97),模型组大鼠海马区SS蛋白表达显着降低(2.99±0.14 ) (p<0.05),与模型组比较,通络救脑口服液低、中、高各剂量组SS蛋白表达(分别为4.22±0.20, 5.63±0.25, 5.93±0.30)显着升高(P<0.05)。与假手术组比较(6.74±0.47),模型组大鼠海马区AChE蛋白表达显着降低(6.42±0.38 ) (p<0.05),与模型组比较,通络救脑口服液24mg/kg/d剂量组和48mg/kg/d剂量组AChE蛋白表达(分别为4.37±0.33, 3.20±0.40)显着降低(P<0.05)。与假手术组比较(6.58±0.58),模型组大鼠海马区ChAT蛋白表达显着降低(2.81±0.15 ) (p<0.05),与模型组比较,通络救脑口服液低、中、高各剂量组ChAT蛋白表达(分别为3.83±0.22, 4.44±0.23, 4.31±0.28)显着升高(P<0.05)。免疫印迹结果显示:模型组大鼠大脑组织SYP蛋白表达相对值(0.590±0.026)较假手术组(0.936±0.028)明显降低(p<0.05),而通络救脑口服液低、中、高各剂量组(分别是0.683±0.037, 0.713±0.036, 0.808±0.050),可上调SYP的表达(p<0.01)。模型组大鼠大脑组织caspase-3蛋白表达相对值(2.98±0.17)与假手术组(0.86±0.05)比较明显增高,(p<0.05),而通络救脑口服液低、中、高各剂量组蛋白表达相对值分别是2.44±0.19, 1.62±0.16, 1.69±0.11,可下调caspase-3的表达(p<0.05)。生化检测结果显示:模型组大鼠脑组织SOD活性(52.43±3.25 U/h·mg~(-1)·prot~(-1))较空白对照组(69.86±6.52 U/ h·mg~(-1)·prot~(-1))明显降低(p<0.05),而这种降低可被通络救脑口服液低、中、高各剂量组(分别是61.48±3.05, 64.04±4.64, 66.99±2.75 U/ h·mg~(-1)·prot~(-1))抑制。模型组大鼠脑组织MDA活性(9.09±0.41 U/h·mg~(-1)·prot~(-1))较空白对照组(5.37±0.65 U/ h·mg~(-1)·prot~(-1))明显升高(p<0.05),而这种升高可被通络救脑口服液低、中、高各剂量组(分别是5.71±0.58, 6.39±0.38, 7.12±0.29 U/ h·mg~(-1)·prot~(-1))抑制。模型组大鼠脑组织MAO活性(7.88±0.76 U/h·mg~(-1)·prot~(-1))较空白对照组(5.17±0.33 U/ h·mg~(-1)·prot~(-1))明显升高(p<0.05),而这种升高可被通络救脑口服液低、中、高各剂量组(分别是7.07±0.81, 7.13±0.53, 6.36±0.36 U/ h·mg~(-1)·prot~(-1))抑制。模型组大鼠脑组织脂褐素含量(5.42±0.24μg/g)较空白对照组((4.29±0.33μg/g)明显升高(p<0.05),而这种升高可被通络救脑口服液低、中、高各剂量组(分别是4.89±0.17, 4.52±0.20, 4.23±0.35 U/ h·mg~(-1)·prot~(-1))所抑制。双抗体夹心ABC-ELISA法检测结果显示:模型组TNFα、IL~(-1)β含量分别为120.97±7.32和88.54±4.07,TNFα和IL~(-1)β含量显著多于假手术组(TNFα为85.43±6.55 ,IL~(-1)β为68.29±4.37,p<0.01),表明模型组TNFα和IL~(-1)β含量升高;与模型组比较,盐酸多奈哌齐组(TNFα为106.86±7.09;IL~(-1)β为71.80±0.23)、通络救脑口服液低、中、高各剂量组(TNFα分别为100.08±9.29、99.97±6.09和85.90±4.40;IL-1β分别为77.56±6.97、77.85±3.81和67.87±2.38)TNFα和IL-1β含量显著减少。电镜观察结果显示:电镜结果显示模型组大鼠海马变性,通络救脑口服液能改善大鼠海马病理改变。结论:1、大鼠大脑海马立体定向注射β-淀粉样蛋白1-40建立的AD大鼠模型,较好的模拟了老年性痴呆的改变,可作为老年性痴呆的动物模型之一。2、通络救脑口服液对拟AD模型大鼠脑内海马组织超微病理改变具有改善作用。3、通络救脑口服液可显着改善拟AD模型大鼠的学习记忆障碍,这可能与它具有提高ChAT、NOS1、SS和synapsin蛋白表达,降低AChE蛋白表达有关。4、通络救脑口服液可抑制促凋亡基因Bax mRNA和caspase-3蛋白表达,促进抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达,从而发挥抗神经细胞凋亡的作用。5、通络救脑口服液能增加拟AD大鼠SOD活性,降低MAO和MDA活性,从而具有抗氧化作用,这可能是其发挥抗AD作用的机理之一。6、通络救脑口服液可抑制APP和BACE1的过度表达,从而减少海马Aβ在脑内的沉积。7、通络救脑口服液能抑制血清TNFα和IL-1β的含量,降低大脑海马组织CRP和NK-κB的表达,因而具有抗炎作用,通过抗炎可能是其治疗AD机理之一。
苏芮[7]2010年在《Aβ致痴呆老龄大鼠模型海马MARCKS表达变化机制及中药调节作用研究》文中指出阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是目前导致痴呆最常见的原因,其发病机制尚不清楚,并且缺乏有效的治疗方法。富含丙氨酸的豆蔻酰化蛋白激酶C的作用底物(myristoylated alanine-rich C-kinase substrate, MARCKS)是在大脑中表达丰富的联系神经元表面信号与树突棘可塑性的重要膜蛋白,与学习记忆功能密切相关。β-淀粉样蛋白(βamyloid, Aβ)在神经元外沉积形成的老年斑是AD的特征性病理表现,同时它又是导致其它病理表现和痴呆症状的原因,AD除了老年斑和神经纤维缠结,树突棘可塑性降低也是AD的重要病理表现之一。树突棘可塑性决定于细胞骨架肌动蛋白的运动,该过程受细胞膜表面4,5二磷酸磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, PIP2)的控制。PIP2可以激活多种肌动蛋白结合蛋白,导致细胞骨架肌动蛋白的运动,进而使树突棘可塑性发生变化。MARCKS通过其效应区(effector domain, ED)分别与PIP2和纤维状肌动蛋白(fibrous actin, F-actin)结合。MARCKS在蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)磷酸化或Ca2+的作用下,离开细胞膜,并释放PIP2和f-actin,使肌动蛋白结合蛋白被PIP2激活,并导致f-actin依赖性树突棘可塑性变化。故本研究以MARCKS为切入点,探索具有神经元毒性作用的Aβ(1-40)作用下老龄大鼠海马MARCKS的表达变化,并进一步探讨MARCKS变化导致的树突棘可塑性变化以及中药复方苁蓉益智胶囊对这一变化的作用,探讨中药治疗AD的新途径。目的：1.建立侧脑室一次性注射Aβ(1-40)至痴呆老龄大鼠模型,并评价该模型作为老年痴呆动物模型的有效性。2.研究Aβ(1-40)对痴呆老龄大鼠海马MARCKS表达的影响,进一步探索MARCKS介导的树突棘可塑性的变化以及复方苁蓉益智胶囊对Aβ致痴呆老龄大鼠海马MARCKS表达,及其介导的树突棘可塑性变化的作用机制。3.根据本研究结果,深入探讨AD的中医发病机制。方法：1对18-20月龄的老龄大鼠一次性侧脑室注射聚集态Aβ(1-40)建立模型,通过Morris水迷宫检测模型大鼠学习记忆功能,通过免疫组化检测海马Aβ(1-40)含量,通过病理检测,观察其海马病理变化,评价其表面效度；根据乙酰胆碱酯酶抑制剂安理申改善该模型学习记忆功能的有效性评价其预测效度；根据其导致痴呆的机理评价其结构效度。2将大鼠随机分为年轻组、老龄组、假手术组、模型组、安理申组以及中药组,模型组、安理申组以及中药组一次性侧脑室注射聚集态Aβ(1-40)建立老龄大鼠痴呆模型。中药和安理申组分别予口服复方苁蓉益智胶囊和安理申溶液14d。通过行为学、ELISA、RT-PCR和westernblotting等检测方法,观察模型大鼠学习记忆功能、Aβ(1-40)、MARCKS mRNA和树突棘可塑性标记蛋白drebrin含量的变化。结果：1该模型的表面效度成立：该模型可以模拟AD样记忆障碍、海马Ap含量增多以及神经元丢失等病理表现；预测效度成立：乙酰胆碱酯酶抑制剂可以改善该模型的学习记忆功能,减少模型大鼠海马Ap的含量,减少其海马神经元的变性和凋亡；结构效度成立：Ap(1-40)导致的病理变化符合淀粉样蛋白级联假说。2行为学检测表明模型组的学习记忆功能明显低于年轻组,安理申组和中药组大鼠的学习记忆功能明显高于模型组；模型组海马MARCKS mRNA比年轻组、老龄组及假手术组均明显升高(P<0.01)；模型组海马drebrin含量较年轻组、老龄组及假手术组均明显降低(P<0.01)；中药组海马MARCKS mRNA比模型组明显降低(P<0.01),安理申组海马MARCKS mRNA没有明显变化；中药组和安理申组海马drebrin含量与模型组相比无明显差别。结论：1侧脑室注射Ap(1-40)致痴呆老龄大鼠模型是用于研究AD发病机制以及新疗法的有效工具,尤其适合与Aβ相关的病理机制以及针对Aβ神经毒性治疗方法的研究。2侧脑室注射Ap(1-40)可以明显增加老龄大鼠海马MARCKS mRNA的表达,降低树突棘可塑性,并且导致老龄大鼠学习记忆障碍。根据MARCKS与树突棘可塑性之间的关系,推断MARCKS升高,导致与树突棘可塑性变化的游离态PIP2减少,很可能是Ap(1-40)致神经元可塑性降低的关键环节。基于“毒损脑络”理论研制的具有益肾补肝,解毒通络作用的复方苁蓉益智胶囊能够降低脑室注射Ap(1-40)致痴呆老龄大鼠海马MARCKS mRNA的表达,从而改善痴呆老龄大鼠学习记忆功能。其是否能够通过调节MARCKS的含量来增加树突棘可塑性,还需要进一步的证明。3.根据“毒损脑络”理论,对AD中医病机的探讨,发现Ap由人体产生,并可以导致神经元丢失,具有败坏形体的特征,属于中医“内生毒邪”的范畴。进一步思考“络”的含义,发现随年龄的增长,富含脂质的神经元细胞膜最易受到氧化损伤,并且细胞膜是联系细胞表面信号和细胞内功能变化的途径,是人体气机的重要通路,属于“络”的范畴。所以“毒损脑络”是AD的重要病机。
陈地灵[8]2012年在《巴戟天低聚糖巴戟甲素抗老年痴呆药效及作用机制研究》文中指出[目的]巴戟天是着名的补肾要药,也是广东的道地药材,需种植5年才能采收。长期以来巴戟天的经济价值偏低,以至于道地产区德庆、高要等地种植面积逐步减少。为了开发出高水平的新药,显着提高巴戟天的经济价值,应当对巴戟天主要有效成分进行深入研究。老年痴呆症是影响人类健康的常见重大疾病之一,本课题组前期研究显示,巴戟天低聚糖中的主要有效成分巴戟甲素,具有抗老年痴呆症活性。为此,作者在完善巴戟甲素工业化制备工艺、巴戟天药材中巴戟甲素的定性和定量鉴别研究、巴戟甲素纯化工艺及质控体系的基础上,采用细胞和动物体内外实验结合法,观察巴戟甲素对Aβ致PC12细胞损伤模型和Ap致SD大鼠拟痴呆模型的影响,阐明其抗老年痴呆药效及作用机制研究,为其抗老年痴呆新药研究与开发提供研究基础和科学依据。[方法]采用D-900离子交换树脂对巴戟天低聚糖进行静态和动态吸附试验,考察不同温度、不同树脂用量、不同流速和不同pH值等因素对吸附过程的影响,以脱色率和低聚糖保留率综合评价其脱色效果,优选巴戟天低聚糖最佳脱色工艺。而后采用不同浓度乙腈-水双相多次热回流提取法从低聚糖中分离纯化得到高纯度巴戟甲素原料药。采用薄层色谱法建立巴戟天中巴戟甲素定性鉴别方法；采用HPLC-ELSD法建立巴戟天中巴戟甲素定量检测方法。体外培养PC12细胞,采用MTT法检测巴戟甲素对正常PC12细胞的细胞毒性作用；采用A β25-35制备细胞损伤模型,应用MTT和LDH法检测细胞存活率、TUNEL试验和流式细胞仪检测细胞凋亡率；采用荧光分光光度计法检测细胞[Ca2+]i,线粒体膜电位、活性氧(ROS)等指标；采用试剂盒-酶标仪法测定细胞内SOD、MDA和GSH·Px等氧化指标；采用RT-PCR, Western-blot法检测Caspase-3、BAX、P21、E2F1、CDK4、 NF-κB、JAK2/STAT3等mRNA和蛋白的表达,观察活性成分对Aβ致PC12细胞损伤模型的影响,探讨巴戟甲素对Aβ致PC12细胞损伤模型的保护作用及机制。实验利用硫代乙酰胆碱(ATCh)在乙酰胆碱酯酶(AChE)作用下分解,生成硫代胆碱(Thiocholine),硫代胆碱与显色剂DTNB迅速作用,生成在412nm处有特征吸收的黄色物质,在酶催化反应的稳态阶段,其吸光值即可代表起始反应速率这一原理,体外评价巴戟甲素的乙酰胆碱酯酶抑制能力。在体外乙酰胆碱酯酶抑制能力评价基础上,采用SD大鼠双侧海马区注射A β25-35各10μ g制备拟痴呆模型,下设巴戟甲素高、中、低剂量组和巴戟天组,同时设空白组、假手术组和阳性药组；连续灌胃给药25d后,采用Morris水迷宫进行行为学检测；采用试剂盒酶-标仪法测定脑组织中超氧化歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽还原酶(GSH-Px)等氧化指标,以及乙酰胆碱(Ach)和乙酰胆碱酯酶(TchE)以及Na+/K+-ATPase等含量；采用HPLC-ECD法检测脑组织中单胺类神经递质水平；采用HE染色法检测脑组织中海马椎体细胞和大脑皮质神经元细胞等相关指标,观察巴戟甲素对A β2535致SD大鼠拟痴呆模型的影响,揭示巴戟甲素抗老年痴呆药理学作用。[结果]脱色工艺研究表明D-900树脂吸附巴戟天低聚糖色素的最佳工艺参数为：采用动态吸附,柱溶液温度45℃,流速1.0Bv·h-1,上样液pH值6.0。取由脱色工艺得到巴戟天低聚糖,加5倍量80%乙腈热回流提取30min,趁热过滤,滤渣加5倍量55%乙腈热回流提取30min,趁热过滤,取滤液调乙腈至75%,冷藏24h析晶,取结晶重复以上步骤3次,即得纯度达95%的巴戟甲素原料药。巴戟天中巴戟甲素薄层鉴别方法：取巴戟天粗粉1.0g,80%丙酮热回流1.0h,滤过,滤渣加40%乙腈热回流0.5h,滤过,滤液即为供试品溶液。吸取样品溶液3μL点于硅胶G薄层板上,以正丁醇：无水乙醇：水：磷酸(3：2.6：2：0.3)、喷10%硫酸乙醇液,在105℃烘至斑点清晰。巴戟天中巴戟甲素定量检测方法：采用HPLC-ELSD法,Rezex RCM色谱柱(Phenomenex,300mm×7.8mm),流动相：超纯水,流速0.6mL· min-1;柱温：35℃；飘移管温度：100℃；载气：空气,流速2.0L·min-1；在此色谱条件下,巴戟甲素能达到很好的分离,无杂质峰干扰。MTT法检测结果显示：低剂量的巴戟甲素能促进细胞生长,且存在量效关系。巴戟甲素在100μ g·mL-1范围内,随着浓度的增加,细胞增殖加快,超过此浓度细胞生长开始被缓慢抑制,说明巴戟甲素具有一定的细胞毒性。MTT、LDH和流式细胞法检测结果显示A p25-35诱导PC12细胞的IC50为21.46μ mol· L-1,在该浓度下,细胞凋亡率、[Ca2+]i、线粒体膜电位、活性氧(ROS)、超氧化歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽还原酶(GSH-Px)等指标,以及Caspase-3、 BAX、P21、E2F1、CDK4、NF-κB、JAK2/STAT5等mRNA和蛋白的表达,与空白组比较差异具有统计学意义(P<0.01),提示A β25-35对PC12细胞具有损伤作用。给予巴戟甲素与Aβ25-35处理后,其以上各项指标皆恢复到接近正常水平,提示在有效剂量范围内巴戟甲素具有保护A β25-35致PC12细胞损伤的作用,其作用机制与降低细胞内[Ca2+]i、升高线粒体膜电位、提高细胞抗氧化能力、抑制NF-κB和JAK2/STAT5等促凋亡因子的激活,同时激活P21的表达,抑制CDK4、E2F1等周期蛋白的表达等有关。巴戟甲素与乙酰胆碱酯酶抑制活性与反应时间具有相关性,反应前50min,随着时间延长,效果越好,反应50min后,保持一定抑制率,不再增大；巴戟甲素与乙酰胆碱酯酶抑制活性与药物浓度具有相关性,浓度越大,其抑制率越大。灌胃给予巴戟甲素25d后,水迷宫实验结果显示Aβ模型组定位航行潜伏期明显长于空白组,定位航行总路程明显高于空白组,而各给药组明显得到改善。空间探索实验结果显示空白组大鼠在第一象限(即平台原所在区域)游泳时间(27.36±3.38)s长于其他象限,差异具有统计学意义(P<0.05)；与空白组比较,模型组在第一象限游泳时间(20.77±5.63)s明显较短,巴戟甲素高剂量组(31.93±3.39)s比空白组延长,差异具有统计学意义(P<0.01),其余各组差异没有统计学意义(P>0.05)。与模型组比较,各给药组在第一象限游泳时间明显延长,且差异具有统计学意义(P<0.01)。实验结果提示Aβ具有神经毒性,可模拟老年痴呆长时记忆障碍特征；给予巴戟甲素治疗后,与模型组比较,大鼠定位航行潜伏期明显缩短,说明巴戟甲素具有改善老年痴呆模型大鼠记忆障碍。脏器系数测量结果显示,模型组脑、脾、肾、睾丸等脏器系数比空白组都降低,说明Aβ影响机体脏器功能,而给予巴戟甲素后,各脏器系数相应升高,说明巴戟甲素对老年痴呆大鼠各脏器具有补益作用。各给药剂量组动物脑内氧应激水平均得到一定的改善,与模型组比较,表现为大脑组织中SOD、CAT、GSH-Px活力增加,MDA含量降低,其中高剂量组最明显,可显着增加GSH-Px活力,降低MDA含量(P<0.01),脑组织中Na+/K+-ATPase活性显着升高；单胺类神经递质水平显着升高；海马CA1区、大脑皮质和前脑基底核神经元凋亡抑制率明显降低。[结论]采用D-900离子交换树脂建立巴戟天低聚糖的脱色工艺具有显着的脱色效果,低聚糖保留率较高；再从低聚糖中采用不同浓度乙腈-水提取纯化得到巴戟甲素,其工艺稳定,操作简便,耗时比原来节省叁分之二,可为大规模工业化制备工艺。实验所建立的薄层色谱法具有巴戟甲素特征斑点,HPLC-ELSD含量测定方法能定量检测巴戟天中巴戟甲素含量。实验从细胞水平和分子水平,研究探讨了巴戟甲素对Aβ致PC12细胞损伤模型的保护作用及其机制,巴戟甲素具有抑制Aβ致PC12细胞凋亡的作用,其作用机制为巴戟甲素通过降低细胞内[Ca2+]i,直接或间接地抑制细胞损伤的发生；升高线粒体膜电位,提高细胞抗氧化能力,抑制NF-κB、JAK2/STAT5等促凋亡因子的激活,切断Caspase-3执行细胞凋亡级联反应的必经之路,发挥抗凋亡作用；同时激活P21的表达,抑制CDK4、E2F1等周期调控蛋白的表达,以纠正细胞周期的紊乱,使细胞得以正常分化,从而达到抑制细胞凋亡的作用。体外巴戟甲素抑制乙酰胆碱酯酶活性实验说明巴戟甲素具有一定的抑制乙酰胆碱酯酶活性,并呈现量效关系。实验采用β-淀粉样蛋白多肽25-35片段(Aβ25～35)(20μg)于大鼠双侧海马内一次性注射,诱发制备了拟痴呆动物模型。从行为学、氧化应激、胆碱能系统、能量代谢、神经递质和神经元凋亡等方面,观察了巴戟甲素对Aβ模型大鼠的影响,实验结果显示巴戟甲素可以改善Aβ致大鼠痴呆症状,其机制与提高抗氧化能力、激活脑能量代谢、改善胆碱能系统损伤和抑制大脑神经元凋亡等有关。本研究主要创新点1从细胞水平和分子水平,揭示了巴戟甲素通过降低细胞内[Ca2+]i,提高细胞抗氧化能力,抑制NF-κB、JAK2/STAT5等促凋亡因子的激活,同时激活P21抑制CDK4、 E2F1等周期调控蛋白的表达,达到抑制神经细胞凋亡的作用机制。2实验通过整体动物实验,揭示了巴戟甲素还可通过激活脑能量代谢、改善胆碱能系统损伤以达到防治老年痴呆症的目的。
王琳琳, 胡镜清, 张治国, 江丽杰, 王传池[9]2019年在《中药及复方减少阿尔茨海默病氧化损伤研究探析》文中指出阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的神经系统变性性疾病。氧化应激在AD疾病发生与发展中起着重要作用,从健康人到AD疾病中,抗氧化系统与氧化系统失衡逐渐加重,调节氧化应激水平对AD疾病的进程有积极的意义。中药及复方可通过提高体内抗氧化酶活性,减少自由基生成,来减少Aβ聚集,从而减轻炎症反应及细胞毒性。本文通过综述中药及复方减少AD氧化损伤的研究进展,为临床防治AD提供依据。
叶应阳[10]2016年在《大明汤治疗血管性痴呆的临床研究》文中认为目的：本课题从“命门学说”的角度阐述血管性痴呆(Vascular Dementia, VD)的中医学机理,并应用陈根成教授基于“命门学说”治疗痴呆的自拟经验方“大明汤”与西药“尼膜同”采用随机对照的研究方法进行临床对照研究,为“大明汤”治疗血管性痴呆的临床疗效提供科学依据与探讨“温补命门”法治疗血管性痴呆的可行性。方法：1、本课题血管性痴呆的西医诊断标准采用(DSM-IV)和(NINDS-AIREN),中医诊断标准参用《老年呆病的诊断、辨证分型及疗效评定标准》“老年呆病”的诊断标准。评分则使用MMSE、HDS、中医证候评分表,进行治疗前后评分。2、治疗组服用“大明汤”煎剂,对照组口服尼莫地平(尼膜同)。两组皆连续用药3个月,每月随访一次。3、观察内容包括治疗前后的认知功能、日常行为能力以及相关中医证候及舌脉象的变化,用药前及用药后每月记录一次,定期填写临床观察表,随时记录用药期间可能出现的不良反应。4、统计学方面,所有数据采用软件SPSS-20.0进行统计分析,计量资料呈正态及方差齐时采用t检验,方差不齐时采用校正t检验,同时进行治疗前后检测的,计算出治疗前后指标的差值,并对差值进行组间独立样本t检验,计量资料治疗前后自身对照采用配对t检验,计数资料采用X2检验,当单元格出现n<40或T<1时使用Fisher确切概率法,两组程度比较采用秩和检验。结果：治疗血管性痴呆(VD)50例,其中脱失2例。(1)治疗组(大明汤组)23例,MMSE疗效评分：显效4例,有效15例,无效4例,总有效率82.6%；中医疗效评分：显效4例,有效19例,无效0例,总有效率100%(2)对照组(尼膜同组)25例,MMSE疗效评分：显效2例,有效12例,无效7例,总有效率72.0%；中医疗效评分：显效0例,有效18例,无效7例,总有效率72%。两组治疗前后疗效有显着差异均有统计学意义(p＜0.05)(3)两者治疗前后MMSE评分均有显着差异(P＜0.05),两组间MMSE评分差值经统计学处理差异具有统计学意义(p<0.05),提示两组均能提高均能提高MMSE评分,治疗组优于对照组；两者治疗前后HDS评分均有显着差异(p＜0.05),两组治疗前后评分差值比较有显着差异有统计学意义(p<0.05),提示两组均能提高HDS评分,治疗组优于对照组。中医证候疗效经统计学处理两组治疗前后有显着性差异(p＜0.05),两组间评分差值比较具有显着差异具有统计学意义(p＜0.05),提示两者均能改善中医证候,治疗组优于对照组。结论：从临床研究结果来看,“大明汤”对改善患者的认知功能及中医征候等疗效优于对照组,是治疗血管性痴呆的有效方剂。说明基于“命门学说”运用“温补命门”法治疗血管性痴呆是可行的及“大明汤”治疗血管性痴呆的有效方剂,值得进一步研究与推广。
参考文献：
[1]. 地黄饮子对Aβ致海马神经元损伤影响的实验研究[D]. 邹纯朴. 黑龙江中医药大学. 2004
[2]. 地黄饮子对Aβ致PC12细胞损伤影响的实验研究[D]. 周妍妍. 黑龙江中医药大学. 2007
[3]. 地黄饮子治疗阿尔茨海默病的实验研究进展[J]. 韩冉, 马涛, 张志辰, 高阔, 高俊峰. 中国实验方剂学杂志. 2018
[4]. 地黄饮子组成药物的中药有效成分治疗AD研究进展[J]. 姜卓, 宋琳, 朴钟源, 邸智勇, 房秋菊. 中医药学报. 2017
[5]. 改良叁甲散调控老年性痴呆病炎性因子的机理研究[D]. 吴金娟. 南京中医药大学. 2014
[6]. 大鼠脑内注射Aβ_（1-40）致海马损伤的炎症相关机制及通络救脑口服液的作用[D]. 张晓杰. 北京中医药大学. 2007
[7]. Aβ致痴呆老龄大鼠模型海马MARCKS表达变化机制及中药调节作用研究[D]. 苏芮. 北京中医药大学. 2010
[8]. 巴戟天低聚糖巴戟甲素抗老年痴呆药效及作用机制研究[D]. 陈地灵. 广州中医药大学. 2012
[9]. 中药及复方减少阿尔茨海默病氧化损伤研究探析[J]. 王琳琳, 胡镜清, 张治国, 江丽杰, 王传池. 世界科学技术-中医药现代化. 2019
[10]. 大明汤治疗血管性痴呆的临床研究[D]. 叶应阳. 广州中医药大学. 2016