林竞韧[1]2003年在《人骨髓基质干细胞克隆的培养及其造血支持作用的实验研究》文中研究表明研究背景／目的：骨髓基质干细胞是骨髓中除造血干细胞和内皮祖细胞以外的另一种成体干细胞，具有广泛的分化潜能和造血支持作用，是组织工程和基因治疗最有应用潜能的候选细胞之一。目前认为MSC是一异质性的细胞群，已证实至少存在3种形态的细胞，但由于无特征性的表面标记其分离纯化缺乏特异性，它的生物学特性如诱导分化的机理及最终的分化潜能等仍不甚了解，同时其体外培养方法也有待完善。近年来基质干细胞与造血干细胞共同移植加快造血恢复作用及降低GVHD的作用日益受到重视。克隆培养是进一步研究其生物特性的有效方法。本实验拟探讨骨髓基质干细胞克隆的培养方法和研究其对体内外造血支持作用的影响。为骨髓基质干细胞体外大量扩增培养及造血干细胞与基质干细胞共同移植做初步尝试。 方法：1．人骨髓基质干细胞的克隆培养及生物学特性的检测 以密度梯度离心法和贴壁法分离人骨髓基质干细胞，以套圈法获取克隆源骨髓基质干细胞扩增培养。检测其生物学特性，包括①MSCs的表面标记检测；②MSCs的生长曲线测定，分别检测了P5、P10、P17代MSCs；③克隆形成能力的检测，分别检测了P2、P7、P17代细胞；④MSCs的冻存和复苏；⑤原子力显微镜的观察；⑥MSCs转染GFP的实验及⑦MSCs向脂肪细胞和神经元样细胞的定向诱导分化等实验。 2．克隆源人骨髓基质干细胞对脐血造血细胞体外增殖的影响 人骨髓基质干细胞的预处理，传代后接近融合生长的MSCs经15Gy~(60)CO照射。 免疫磁株分离系统正性分离CD34细胞。流式细胞仪检测CD34细胞纯度。 hMSCs对脐血CD34+细胞体外扩增的影响：将分选的脐血CD34+细胞置于不同条件体系培养，包括细胞因子组、细胞因子组+基质干细胞组、基质干细胞组等3组，共培养3周。镜下观察细胞增殖情况，分别计数不同培养时间细胞总数扩增的倍数。比较不同培养阶段(P5和P15)MSCs对造血细胞体外扩增作用的差异。 hMSCs对扩增的CD34+细胞集落形成(CFCs)影响的实验：上述3种体系培养2周的CD34+细胞以2×10~4／孔密度接种到含CFU-MIX培养体系中，培养21天。分别计数CFU~GM、CFU一、CFU~GE]迈M、BFtl一E集落数。比较不同培养条件对脐血CFcs扩增的影响。3.克隆源骨髓基质干细胞对脐血在裸鼠体内造血支持作用的研究克隆源人骨髓基质干细胞的培养方法同上。制备脐血单个核细胞。移植脐血单个核细胞和或骨髓基质干细胞给亚致死剂量60Co照射的裸鼠，移植后观察小鼠精神、饮食、生长、大便、死亡等一般情况，计数移植后2周、4周和6周外周血及骨髓单个核细胞数并检测移植后裸鼠骨髓CFU一ML狡集落形成能力。检测其骨髓中CD34+、CD45+细胞判断脐血造血干细胞的植入情况。进行了急性GVHD的初步观察，取裸鼠的肝、脾、小肠、肺、皮肤、脑等组织，常规病理切片，镜检各组织的炎症反应，比较脐血MNCs单独或与MSCs共同移植移植及不同剂量骨髓基质干细胞移植条件对造血恢复和急性GVHD的的影响。结果:本实验所用培养方法能有效扩增克隆来源的骨髓基质干细胞，细胞倍增时间约为48~72h。能传代20代，使扩增的细胞总数达到1~3x 1010数量级。流式细胞仪检测示细胞表达CD13、cD29、cD59而不表达CD 11、CD 14、CD31、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86、CDll7，表明它是基质干细胞而不是造血细胞。细胞的表面标记显示扩增的是骨髓基质干细胞且纯度达97%以上，可视为克隆来源的骨髓基质干细胞。生长曲线示培养的细胞17代以前生长良好，17代以后细胞生长明显变慢，光镜下形态变大、形状变为不规则，胞浆内及培养液中可见较多颗粒，折光性差。克隆形成能力检测示MSCs随代次不同而各异，随传代次数增加，克隆形成能力逐渐降低。常规冻存方法能有效保存细胞，复苏后活细胞达%%以上，细胞生长传代良好。原子力显微镜观测示典型细胞为梭形，微观检测示表面有较多角状、颗粒状和不规则突起。基因转染试验示GFP基因能导入MSCs，约于转染后14天出现绿色萦光，随时间的推移强度逐渐增强，约于转染后23天达峰值，细胞转染率达16%。体外诱导分化能力检测显示培养的细胞保持其分化潜能，可分化成神经元样细胞和脂肪细胞。诱导比例分别为53.3%和60%。人骨髓基质干细胞对脐血细胞总数扩增能力的影响:不同培养条件下脐血细胞扩增的总数显示各组在相同培养时间点上存在显着性差异(P< 一5-0.05)。基质干细胞+细胞因子组和细胞因子组都能有效扩增脐血CD34+细胞，细胞因子组扩增细胞的能力最强，而单独基质细胞组对造血细胞体外扩增能力相对较弱。以P15基质干细胞作为支持层细胞时，在培养的第7、14、21天各组脐血细胞扩增的倍数差异也存在显着性差异。同以PS代为支持层相比其对脐血细胞的扩增能力明显下降(P<0.01)。MSCs对脐血CD34+细胞CFCs形成能力的影响:将上述MSCs(PS)细胞+细胞因子组、单纯细胞因子组、单纯基质干细胞组条件下扩增2周的脐血单个核细胞接种到CFU一Mix培养基中检测其对脐血CFCs扩增的影
王跃嗣[2]2005年在《人nthESC向HSC诱导分化和胚胎造血标志物表达研究》文中研究指明造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)是近年来研究较多的一类组织干细胞,目前发现卵黄囊、胎肝、主动脉-性腺-中肾区(AGM)、胎儿血液以及胎盘中均存在具有高度扩增能力的HSC。本论文主要进行了具有课题组专利的人自体基因胚胎干细胞(nthESC)向造血干细胞的诱导分化、人胚胎发育过程中卵黄囊、胎肝和胎盘中的造血发育以及胎盘贴壁细胞的分离培养、向神经细胞诱导分化的研究,为nthESC 和HSC的临床应用提供了理论依据和技术方法。1. 探讨了人胚骨髓间充质干细胞(MSC)的体外分离、扩增、冻存、复苏、转GFP基因和向成骨和神经细胞的诱导分化条件,结果发现MSC有60%可转染GFP基因,表达CD29、CD13、CD59,而CD34、CD45和CD38表达阴性。Vimentin染色阳性,mallory染色显示胶原存在,分离的细胞可在神经诱导体系和成骨诱导体系下进一步向神经细胞和成骨细胞分化。表明MSC在体外能迅速扩增,具有向成骨和神经细胞分化潜能,可以作为稳定饲养层来源。2. 利用人MSC 与人nthESC 共培养,研究人MSC 对胚胎干细胞诱导造血的作用并建立一种有效诱导nthESC 为HSC 的方法。经过20 d 培养,获得大量的CD133+和CD34+绿色荧光标记的HSC。来源于nthESC 的KDR+细胞首先出现在第5 天,CD133 随后出现,CD34+细胞出现在第7 天,随时间延长叁者表达增强,第11 天左右表达最强,随后减弱,20 d 仍有表达。培养中发现11 d 可形成小造血集落,14 d 形成大集落。在BMP4、FGF-1和VEGF 等因子作用下,可促进造血细胞形成。结果显示由nthES 与MSC 共培养可产生CD34+细胞,nthESC 的造血分化程序为先形成KDR+细胞,其次是CD133+,再形成CD34+细胞。表明nthESC 可在人胚骨髓MSC 饲养层上有效诱导成HSC。3. 采用分阶段悬浮培养法,首先诱导nthESC 形成拟胚体(EB),在此过程中添加BMP4 和FGF-1。第二阶段,打散EB,再添加VEGF 和其他细胞因子,对HSC 进行扩增。结果发现,采用低黏附板可有效促进EB 形成,BMP4 和FGF-1 可使EB 形成数量明显增加,可使KDR+和CD133+荧光细胞数量明显增多。添加VEGF 等细胞因子,可有效促进CD34+细胞数量增加。结果表明,联合使用BMP4、FGF-1、VEGF 和SCF 等细胞因子,可使悬浮培养形成EB 数量增加,产生更多的造血前体细胞,继而产生大量HSC。
张曦[3]2006年在《VCAM-1基因修饰人脐血源基质细胞移植重建造血微环境功能》文中指出骨髓造血微环境(hematopoietic inductive microenvironment,HIM)是造血干/祖细胞生长发育的“土壤”,基质细胞作为造血微环境中的重要成分,不仅与造血干/祖细胞的归巢定位、增殖分化和自我更新密切相关,而且在某些血液系统疾病的发生、发展和转归过程中具有非常重要的作用,探讨基质细胞在造血调控中的作用需继续深入。人脐血中的细胞成分丰富且较骨髓和外周血更原始;脐血细胞具有来源广泛、采集方便、GVHD轻和高增殖的特点,临床应用前景广阔。目前对造血基质细胞的研究主要侧重于骨髓基质细胞,而对于脐血中是否存在基质细胞,脐血源基质细胞的生物学特点如何,能否作为一种新型的造血基质细胞来源等问题尚缺乏系统深入的研究;血管细胞粘附分子(vascular cell adhsion molecule-1,VCAM-1)是骨髓基质细胞参与造血调控不可缺少的粘附分子,它与受体整联蛋白(Integrin)家族中的α4β1特异性结合能起到固定造血干细胞于骨髓基质的作用,对造血干/祖细胞的增殖、分化、迁移中发挥重要调控作用。鉴于此,本课题将人脐血CD34+细胞,采用Dexter贴壁细胞培养体系行脐血源基质细胞培养,探讨人脐血细胞体外扩增基质细胞的可行性和有效性;研究人脐血源基质细胞微环境的造血支持作用;构建荧光蛋白标记的VCAM-1腺病毒载体并转染人脐血源基质细胞,移植给造血微环境辐射损伤裸鼠,探讨其对重建造血微环境功能及促进造血损伤修复的作用,为平战条件下造血功能损伤的救治提供新的辅助治疗措施。1.研究内容及方法:1.1分离人脐血CD34+细胞,采用Dexter贴壁细胞培养体系行脐血源基质细胞培养、传代扩增,采用光镜,电镜、组织细胞化学、免疫细胞化学和流式细胞仪等技术对脐血源基质细胞进行鉴定;1.2采用DNA重组技术,将目的基因VCAM-1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒;在BJ5183细胞中与腺病毒基因组进行同源重组,产生重组腺病毒;在脂质体介导下,将重组的腺病毒表达质粒转染293细胞,使腺病毒在293细胞中包装复制,并对转染后的293细胞进行荧光观测,检测培养上清目的蛋白的表达;用高效转染载
赵英杰[4]2006年在《成鼠骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化的实验研究》文中认为[目的] 神经干细胞移植治疗神经系统疾病是生命科学重要研究内容之一。但是,无论是胚胎或成体的神经干细胞,作为移植细胞尚存在相当大的缺陷。如来源不足,采集困难,免疫排斥,道德伦理及法律等方面的限制。骨髓基质细胞是一种特殊成体干细胞。它具有几乎和胚胎干细胞一样多的分化潜能,能诱导分化成几乎所有的体细胞类型。骨髓基质细胞容易获取并可用于自体移植,而且可以在一定条件下诱导成神经细胞,这为神经干细胞的应用提供了无限制的来源,克服了从脑组织获取神经干细胞的危险性和局限性,也避免了胎儿脑组织移植中存在的伦理和免疫排斥问题。本实验以Sprague Dawley(SD)成年大鼠为实验对象,研究成年大鼠骨髓基质细胞体外培养的增殖和分化特点,为神经干细胞移植提供更多的理论依据。 [方法] 成年SD大鼠,雌雄不拘,鼠龄5～6月,体重150～200g。在细胞培养室内超净工作台上取材。用股骨、胫骨灌洗法采集成年大鼠骨髓细胞,密度梯度离心法分离出骨髓基质细胞。利用表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)等增殖及分化诱导因子和神经干细胞培养液进行培养,诱导分化,用细胞免疫组化染色进行细胞鉴定。 [结果] 成年大鼠骨髓基质细胞在体外培养48h后,大部分细胞贴壁,部分细胞展开成梭形或扁平状,渐形成单细胞层。4～7d出现多个细胞聚集的细胞克隆团,将其机械分离成单细胞悬液,重新种植,4～5d即有新的细胞克隆出现。经分化诱导3～4d后,从细胞球周围迁出不同形态的细胞,渐分化出大而稍圆的细胞,以及双极细长突起的神经元样细胞。 [结论] 骨髓基质细胞具有较强的自我更新及多向分化能力,在适宜的诱导分化条件下,可诱导为神经干细胞,分化出神经元和胶质细胞。本实验采用的培养方法适合骨髓基质细胞的体外培养。
袁雅红[5]2008年在《人胎盘源间充质干细胞对脐血单个核细胞体外生长的支持作用及体内移植促进造血重建的实验研究》文中提出间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的成体干细胞。在不同的诱导条件下,MSCs可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。MSCs的主要来源为成人骨髓,但成人骨髓源MSCs的细胞数量及增殖分化潜能会随着年龄的增大而下降,且病毒感染率较高,此外供者MSCs的采集需行骨髓穿刺术,因而MSCs的临床应用存在很大的局限。近年的研究表明,从胎盘中可分离出MSCs,它们和骨髓MSCs一样,在合适的培养条件下具有多向分化能力。MSCs作为骨髓造血微环境中的重要组成成分,它通过分泌多种造血生长因子以及细胞与细胞间的直接接触等方式作用于造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs),因而在造血调控中发挥重要的作用。目前,MSCs已被用来体外支持HSCs扩增,体内联合HSCs移植促进造血重建。本研究在成功分离培养人胎盘源间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSCs)的基础上,探讨人PMSCs在体内和体外支持造血的功能效应。本文分为两部分。第一部分阐述了人PMSCs的分离培养和鉴定,并探讨人PMSCs对脐血单个核细胞(MNCs)体外生长的支持作用。将人胎盘组织经胶原酶消化、贴壁和传代培养获得人PMSCs,运用流式细胞仪检测其表面标志,分别联合应用β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松体系和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛、地塞米松体系将其诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,继而采用碱性磷酸酶检测和vonkossa染色对其进行成骨分化鉴定,采用油红染色对其进行脂肪分化鉴定。将用密度梯度离心法分离的脐血MNCs和传代后的PMSCs进行共培养,通过细胞计数和流式细胞仪分别检测造血细胞的生长情况。结果显示:1.从人胎盘组织中成功分离和培养PMSCs,贴壁细胞呈成纤维细胞状,经流式细胞仪检测其表型为CD29~+、CD44~+、CD105~+、CD106~+、CD166~+、CD34~-、CD45~-、HLA-DR~-;2.PMSCs经成骨诱导3周后,碱性磷酸酶染色呈强阳性,von kossa染色可见明显钙结节。PMSCs经成脂诱导2周后,油红染色呈阳性,有明显的脂滴出现;3.人PMSCs+脐血MNCs共培养组的细胞总数和CD45~+细胞数在各培养时间点均明显高于对照组,在培养第7天,CD45~+、CD14~+及CD19~+细胞数共培养组也明显高于对照组。结果表明,人PMSCs可以作为滋养层细胞有效支持脐血MNCs的体外生长。第二部分利用同种异基因小鼠骨髓移植模型,比较经骨髓腔内注射(intra-bonemarrow injection,IBMI)和外周静脉输注(intravenous injection,Ⅳ)两种途径移植小鼠骨髓单个核细胞(BMNCs)后受体早期的造血重建情况,建立了小鼠IBMI技术平台,并利用IBMI技术初步探讨了人PMSCs联合脐血MNCs共移植入SCID鼠体内后的早期造血重建效应。以BALB/c小鼠为供体,通过IBMI和Ⅳ两种途径将其BMNCs移植入经致死量辐照预处理的C57BL/6受鼠体内。60只受鼠随机分为3组:骨髓腔内注射高剂量组1(IBM1组)、骨髓腔内注射低剂量组2(IBM2组)、尾静脉注射组(Ⅳ组),每组20只。在骨髓移植后1、3、6、9 d分别计数各组受鼠胫骨骨髓腔内细胞总数,并用流式细胞仪检测供体植入水平(供体来源细胞总数、供体来源髓系细胞数)。以人PMSCs和脐血MNCs为供体,通过IBMI方法或结合Ⅳ方法,将两种细胞联合或单独移植入经亚致死量辐照预处理的SCID受鼠体内。9只受鼠随机分为3组:联合移植A组(PMSCs+脐血MNCs,IBMI)、单独移植B组(脐血MNCs,IBMI)、联合移植C组(PMSCs经IBMI,脐血MNCs经Ⅳ),每组3只。在移植后14 d取各组SCID小鼠注射侧和对侧胫骨腔内骨髓细胞,并用流式细胞仪检测分析人CD34~+、CD45~+细胞的植入水平。结果显示:1.IBM1组和IBM2组注射侧于移植后6 d胫骨骨髓腔内细胞总数、供体来源细胞总数、供体来源髓系细胞总数均明显高于Ⅳ组;2.SCID小鼠移植后14 d,B组注射侧及对侧胫骨骨髓腔内的人CD34~+、CD45~+细胞的百分比均明显低于A组小鼠的注射侧和对侧。结果表明,IBMI较Ⅳ更能促进同种异基因骨髓移植后的早期造血功能重建;人PMSCs可以增加脐血MNCs的植入,促进造血重建。综上所述,本实验从人胎盘组织中成功分离培养获得PMSCs,人PMSCs在体外对脐血MNCs的生长有明显的支持作用。通过IBMI技术将人PMSCs与脐血MNCs共移植于SCID小鼠体内,人PMSCs可有效促进脐血MNCs的早期造血重建。这为进一步研究人PMSCs体内和体外支持造血的相关分子机理奠定了实验基础。
楼晓[6]2003年在《人骨髓间充质干细胞支持造血的研究》文中研究表明造血干细胞移植是近30年来血液学重大进展的领域，作为一种治疗血液系统疾病、恶性肿瘤及部分遗传性疾病有效的方法，在临床上已得到广泛应用，取得了良好的效果。然而患者常常因造血功能迟迟不能恢复，发生严重感染或出血，最终导致移植失败，甚至死亡。自体移植是目前开展最广泛的一种干细胞移植形式，与异基因造血干细胞移植、自体外周血干细胞移植相比，自体骨髓移植后中性粒细胞，尤其是血小板的恢复需要较长时间。在骨髓损伤后的修复过程中、或造血干细胞移植后重建造血的各阶段，往往先有造血基质成分的恢复，而后才有造血的重建。移植前的预处理措施如大剂量放、化疗损伤了造血微环境的结构和功能，严重影响了移植后造血的重建过程。造血微环境的再生与重建是造血恢复的关键与先决条件。 机体体内正常的造血活动依赖于复杂而完整的骨髓造血微环境系统，其中的细胞成分是该系统的关键。存在于成人骨髓中的间充质干细胞(MSC)是骨髓基质细胞系的前体细胞，是造血微环境中最重要的细胞成分，不仅是更新骨髓中基质细胞系的源泉，还同时分泌一系列造血生长因子促进造血干细胞的归巢、定居和增殖分化，在造血调控和造血重建机制中占有非常重要的地位。实验研究已经表明体外扩增的MSCs表达很多具有支持造血活性的生长因子，临床前和早期临床的安全性研究已经显示MSCs具有可移植性(长期植活、无移植毒性)、支持造血、促进植入、免疫调节等作用。间充质干细胞的体外扩增与联合移植将成为传统移植方式的有效补充和完善，值得进一步探讨。我们的研究旨在探讨人骨髓MSCs体内外支持造血的作用，为扩大进一步临床应用提供依据。 要利用骨髓MSCs就必须实现其体外的分离培养扩增。在第一部分工作中，我们用密度为1.073g／ml的Percoll细胞分离液密度梯度离心和早期贴壁分离相结合的方法获得了均一的人骨髓MSCs。研究其在体外培养中的生长曲线、贴壁率和分裂指数等细胞生物学特点。在原代培养过程中，MSCs呈集落生长，具有典型的纺锤状的形态，传代后则均匀生长。传代培养的人骨髓MSCs倍增时间为30小人骨筑间充质千细月包文持造.血的减开究中j忆摘委时，分裂指数最高达30%0，传代接种时间12小时90%以上的细胞已贴壁，反映了其旺盛的分裂增殖能力。人骨髓MSCs在低血清的培养条件下可以实现细胞的大量扩增。利用流式细胞仪(FCM)对体外培养的MSCs进行表型鉴定，选择较具代表性的指标:CD166、CD105、CD29、CD13及CD34、CD45和HLA一DR。结果发现CD166、CD105、CD29、CD13阳性率达99%以上。通过体外定向诱导的方法研究其多向分化的潜能，体外培养的人骨髓MSCS在特定的诱导条件下可向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经细胞分化。人骨髓MSCs液氮冻存1个月后复苏存活率约为90%，且在冻存时间分别为2个月、3个月时，重复测定其复苏存活率无明显差异。在本实验条件下进行MSCS体外连续培养的过程中发现:骨髓MSCs最多传代至30代，传至25代后生长速率逐渐减慢，部分细胞形态发生变化:传代至23代时，成功进行定向诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化。上述实验为深入研究MSCs对体内外造血的作用奠定了坚实的基础。 在第二部分工作中，我们应用长期骨髓细胞培养体系，分别通过MSCs培养上清促进集落形成实验、MSCs与CD34+细胞共培养实验初步探讨MSCs体外支持造血的作用。将脐血来源的CD34猎血细胞接种于经射线照射的MSCs单细胞层上，从而建立了长期骨髓细胞培养体系。在MSCs培养上清的刺激下，造血细胞在无血清的甲基纤维素半固体培养体系中形成了明显的造血集落，表明MSCs的培养上清具有促进造血集落形成的活性和能力。共培养5周后造血细胞仍具有体外集落形成能力，说明MSCs具有维系长期培养启动细胞的能力。MSCs与CD34+细胞共培养实验中，我们观察两个指标:悬浮造血细胞数量和造血细胞形成的集落形成细胞(CFC)数量。在悬浮造血细胞数量和造血细胞形成的CFC数量上，有MSCs培养组较无MSCs培养组均显着增多(P<0.01)。用3 pm的微孔滤过膜阻断MSCs与造血干祖细胞(HSPCs)的直接接触作用后，MSCs对造血干祖细胞的支持作用明显减弱。在悬浮造血细胞数量和造血细胞形成的CFC数量上，阻断接触共培养组较直接接触共培养组显着减少(P<0.01)。以上结果表明:璐Cs具有体外支持造血的作用;MSCS和HSPCs间的相互接触在MSCS支持造血过程中起着重要的作用。 在第叁部分工作中，我们进行了MSCs支持体内造血的初步临床研究。建立了稳定的人骨髓MSCs体外大规模培养扩增体系和技术方法。培养扩增后的MSC具有纯度高，形态和表型均一的特点，通过FCM鉴定纯度可达99%，其扩增倍数护、劳垃间充质干细肥文扮造月血的布开究中文摘委超过16，000倍。对6例急性白血病自体骨髓移植病人进行了自体MSCs的同步联合移植。采集6例将行自体骨髓移植的急性白血病病人自体骨髓40~60ml，经14~34天(平均27天)的体外培养扩增后，收获并与骨髓同步联合回输数量为0.32~2.8 X 108(平均1.233 X 10，)的自体MSes，相当于每公斤受者体重0.
王海燕[7]2009年在《淋巴细胞活化与BMMSCs向脂肪分化的相互影响及可能的临床意义》文中进行了进一步梳理淋巴细胞活化与BMMSCs向脂肪分化的相互影响及可能的临床意义研究背景再生障碍性贫血(再障，Aplastic Anemia，AA)发病机理较为复杂，近来认识到免疫机制紊乱尤其是淋巴细胞免疫功能紊乱在再障发病中的作用，己成为再障基础研究方面一个最活跃的领域。骨髓间充质干细胞(Bone marrowmesenchymal stem cells，BMMSCs)作为骨髓基质细胞的起源细胞细胞，BMMSCs及其分化成的细胞在再障发病过程中的作用鲜有研究报道。红髓脂肪化是再障特征性病理改变。但对于再障骨髓中的脂肪组织增多原因及作用尚未见到相关报道。一直以来，脂肪组织被认为是单纯的能量储存组织。然而随着一些脂肪细胞分泌的因子被人们发现，脂肪细胞的其他重要生理学功能被逐渐发掘出来。数十种脂肪细胞分泌因子(adipocyte-secreted factors)在近10余年来已被相继发现，并引起广泛重视。这些因子被统称为脂肪细胞因子(adipocytokines)或简称脂肪因子(adipokines)。目前认为脂肪组织是有独特组织类型，具有特定功能(例如，平衡能量储备、分泌激素和调节免疫)的真正器官系统。Leptin和Adiponectin是脂肪组织参与免疫调节反应的两个主要的脂肪因子。Leptin对T淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞都具有免疫调节作用。免疫细胞受到免疫刺激后，产生细胞因子(尤其是TNF-α)作用于脂肪细胞，使其分泌Leptin，从而达到使免疫信号扩大化的目的。Adiponectin是脂肪细胞表达最丰的激素。主要在天然免疫效应中发挥作用，能抑制髓单核细胞祖细胞的增殖，抑制巨噬细胞的活性。因此，与Adiponectin不同，对于造血免疫系统，Adiponectin被看作是一种负调控因素，可能参与炎症反应的终止。异常的免疫反应可能在损伤造血干细胞的同时对BMMSCs也具有损伤作用，对BMMSCs的脂肪分化能力产生一定的影响，骨髓内显着增多的脂肪细胞也可能对免疫系统有一定的作用。我们对此进行以下研究，以期从一个新的角度探索再生障碍性贫血的发病机制。目的(1)体外分离、培养、扩增小鼠BMMSCs，并研究其生物学特点。(2)培养、扩增再障患者和正常对照BMMSCs，比较两组BMMSCs生物学特性及脂肪分化能力的不同。(3)建立免疫相关骨髓衰竭动物模型，观察免疫紊乱条件下模型小鼠骨髓脂肪化程度的改变，并研究该模型BMMSCs的生物学特性。(4)研究同基因条件下，活化淋巴细胞对BMMSCs向脂肪分化能力的影响及BMMSCs向脂肪细胞分化后对单个核细胞(MNCs)增殖及活化状态的影响。方法(1)贴壁筛选法分离纯化BALB／c小鼠BMMSCs，胰酶消化传代，FCM鉴定细胞表型，并在特定诱导剂下诱导向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化。(2)体外密度梯度离心法分离培养正常人和再障患者的BMMSCs，观察其形态学的异同，同时用流式细胞仪检测其分子表面抗原以及RT-PCR法检测成脂肪细胞的差异。(3)C57BL/6小鼠(父本)和BALB／c小鼠(母本)杂交产生CByB6F1小鼠，将F1小鼠γ射线亚致死量照射(4．5Gy)后尾静脉注射母本淋巴细胞，建立免疫相关骨髓衰竭动物模型。记录白细胞，红细胞，血小板及血红蛋白的变化，股骨切片HE染色观察模型小鼠骨髓脂肪化程度，贴壁筛选法分离小鼠BMMSCs，观察其生物学特性的改变。(4)将Percoll密度梯分离BALB／c小鼠脾脏MNCs，ConA活化后与BALB／c小鼠BMMSCs共培养72小时，Real-time PCR，Western Blot及ELISA检测BMMSCs脂肪分化相关基因和蛋白表达的变化。BMMSCs诱导分化成脂肪细胞，与脾MNCs共培养72小时，CCK-8检测MNCs增殖，流式检测淋巴细胞活化标志的变化。结果(1)BMMSCs呈梭形或叁角形，长梭形，细胞排列整齐，低倍镜下部分呈平行状或旋涡状。流式检测BMMSCs高表达CD44，CD73，CD90和CD105，低表达或不表达CD14，CD34，CD45及HLA-DR。在特定的诱导条件下，BMMSCs能向脂肪细胞，成骨细胞及软骨细胞分化。(2)在起始培养细胞数相同条件下，初次换液时再障患者形成的克隆数明显少于正常对照[(19．3±4．77)／5×10~5 MNCs vs(47．72±3．46)／5×10~5 MNCs，(P＜0．05)]，再障组和正常对照BMMSCs细胞形态和表面标志无明显差别，体外再障患者BMMSCs向脂肪细胞诱导分化较正常组早。(3)CByB6F1小鼠亚致死量照射后，骨髓衰竭为可逆性，外周血象在第10天开始恢复，约6周恢复至正常水平，而亚致死量照射后经尾静脉注射母本小鼠淋巴细胞的小鼠，外周血象降低为不可逆性，造成不可逆性免疫相关骨髓衰竭。骨髓病理学检查证实骨髓衰竭，免疫相关骨髓衰竭组小鼠髓腔空虚，脂肪组织明显增多，而正常对照组和单独照射组骨髓内均无明显脂肪组织形成。体外培养证实，与对照组相比，免疫相关骨髓衰竭组小鼠BMMSCs增殖能力降低，不能传代。(4)体外培养，BALB／c小鼠BMMSCs与经ConA活化的BALB／c小鼠脾脏的MNCs按1：5比例共培养72小时，Real-time PCR检测发现，BMMSCs的Leptin基因表达明显增加而Adiponectin基因表达轻度降低，Western Blot检测该两种蛋白表达也有近似的趋势。ELISA定量检测共培养上清中这两种蛋白的表达发现，Leptin低于检测下限而Adiponectin则明显减少。将BALB／c小鼠的脾MNCs与其BMMSCs或脂肪分化的BMMSCs按一定比例共培养，BMMSCs：MNCs为1：0．5时，脂肪分化的BMMSCs组的淋巴细胞增殖抑制作用显着低于正常对照组BMMSCs[正常对照组vs脂肪分化组为-(77．8±20．7)％vs-(47．8±14．3)％，(P＜0．05)]；而其比例相当(BMMSCs：淋巴细胞为1：1)时，脂肪分化的BMMSCs组对淋巴细胞的作用为轻度促增殖，但与正常对照组的轻度抑制增殖作用相比，差异无显着性[正常对照组vs脂肪分化组为-(28．3±5．2)％vs(3．3±4．9)％，(P＞0 05)]；当淋巴细胞数量逐渐增多，超过BMMSCs数量时，脂肪化的BMMSCs组就表现为促淋巴细胞增殖作用[正常对照组vs脂肪分化组为1：2．5时(-3．9±8．3)％vs(34．2±17．1)％，(P＜0．05)；1：5时(9．4±8．8)％vs(40．8±16．3)％(P＜0．05)；1：10时(20±14．9)％vs(65．8±12．5)％(P＜0．05)]，而且该作用在一定比例范围内，随着淋巴细胞数量的增多而逐渐增强。脂肪分化的BMMSCs与MNCs共培养72h后，却能使淋巴细胞的活化标志CD25和CD69表达与正常对照组相比明显增增加[脂肪分化BMMSCs共培养组vs正常BMMSCs共培养组：CD25+(50．9±7．7)％vs(16．2±5．7)％，(P＜0．05)；CD69+(47．3±5．8)％vs(13．3±4．6)％(P＜0．05)]。结论(1)全骨髓贴壁筛选培养法可简便、高效分离、纯化BMMSCs。所获得的细胞具有BMMSCs特征性的细胞表型及向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化能力。(2)再障患者BMMSCs形态与正常对照相比无明显变化，但其增殖能力较正常对照降低，而且脂肪细胞分化早于正常对照。(3)CByB6F1小鼠在亚致死量照射后，骨髓衰竭为可逆性，经尾静脉注射母本小鼠淋巴细胞可诱导不可逆性骨髓衰竭，形成免疫相关骨髓衰竭动物模型，模型动物骨髓脂肪组织明显增多，BMMSCs增殖能力降低，不能传代，对照组却无此种改变。(4)ConA活化的淋巴细胞能促进BMMSCs脂肪分化相关基因的表达，且脂肪因子分泌失调，Leptin增加而Adiponectin减少。当BMMSCs诱导分化为脂肪细胞后，与MNCs共培养，可检测到淋巴细胞早期活化标志CD25和CD69表达的增加，提示BMMSCs脂肪分化后，具有刺激淋巴细胞活化的作用。(5)我们的实验提示，活化淋巴细胞能促进BMMSCs脂肪分化，BMMSCs脂肪分化后能刺激淋巴细胞增殖及活化，二者形成恶性循环。此现象可能在再障的发生发展中起一定的作用，有待后期实验进一步研究。
耿珊[8]2016年在《当归多糖调控CML患者骨髓间充质干细胞衰老抑制白血病干细胞增殖的机理研究》文中进行了进一步梳理背景干细胞具有自我更新和多向分化能力,这是维持组织和器官结构与功能稳态的关键因素之一。人体衰老和老年性疾病的发生、发展与机体干细胞衰老有密切关系。研究证明。造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC)衰老与多种老年性疾病密切相关,主要表现为造血系统衰退所致的严重贫血,免疫系统低下所致的防御功能降低,细胞增殖分化失控所致的白血病发生等。研究证明,随着年龄的逐步增加,造血诱导微环境的生态龛数量减少和功能衰退,进而导致HSC数量减少和功能低下,最终伴随相关老年性疾病的发生。因此干细胞是研究细胞衰老的重要模型,深入研究干细胞衰老和延缓干细胞衰老的现代生物学机理,不仅对推动人体衰老问题的研究有重大的科学意义,而且在预防老年疾病和治疗退行性疾病中有不可估量的社会价值。造血诱导微环境(HIM)是HSC赖以生存和增殖分化的场所,HIM不仅是HSC生存的支架,它还产生诸多造血调控因子,影响细胞信号转导对其功能起着重要调控作用。现代造血理论认为,HIM的核心成分是骨髓基质细胞,它构成特定的生态龛调控HSC的功能,骨髓基质细胞是多种细胞组成的混合细胞群,它们大多起源于骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCS)。因此阐释造血干细胞衰老机制需要同步研究BMSCS对其衰老的影响。慢性髓细胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)是一种造血干细胞克隆增生性疾病,骨髓以髓系细胞增生,外周血以白细胞增多和脾肿大为主要特征,以老年人的患病率较高。研究证明,白血病的发生发展与白血病干细胞(leukemia stem cell,LSCS)密切相关。目前认为,LSCS由正常HSC演化而来,尤其HSC衰老或HIM变化是形成LSCS的关键因素,同时LSCS也是临床治疗白血病的难点所在。迄今白血病的根治除了HSC移植外没有理想的治疗手段,但该治疗手段复杂,尤其是难以获得理想的供体细胞,且花费巨大,大多数患者并没有治疗机会。如何治愈白血病仍是医学界难以攻克的瓶颈。如果寻找到既能抑制白血病细胞增殖分化,又能对骨髓正常造血细胞有良好保护作用的天然药物有效成分将对白血病等肿瘤的治疗带来新的治疗途径。当归是中医临床“补血、活血”要药,当归多糖(ASP)是其主要药物活性成分之一。我们多年的研究证明,ASP对HSC的增殖分化有重要调控作用,且可以延缓HSC衰老,促进贫血动物骨髓造血功能,对免疫器官有良好保护作用。最近我们研究发现,ASP能促进LSCS的衰老,对移植性白血病有较好的治疗效果。但ASP的“双向调节”作用机理尚不清楚。目的本文将现代干细胞最新理论和技术与传统中医“气血理论”和衰老理论结合研究如下内容1.随年龄增加小鼠与人骨髓HSC/HPCS与BMSCS衰老的生物学特点;2.ASP调控骨髓间充质干细胞对LSCS的影响;3.ASP调控BMSCS衰老抑制LSCS作用机理。研究对阐释干细胞衰老理论和中医学“气血理论”有重要的理论价值;对临床治疗白血病有重要的应用价值。方法1.雄性C57BL/6小鼠,分为幼年组(A组,3~4周龄),青年组(B组,2月龄),中年组(C组,6月龄),中老年组(D组,12月龄),老年组(E组,18月龄)。提取各组小鼠骨髓单个核细胞,用本课题组改良MACS分离法分选纯化Sca-1+细胞群。衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色观察各年龄组阳性细胞百分比,造血祖细胞混合集落(CFU-Mix)培养比较各年龄组Sca-1+细胞集落形成能力。2.取正常人骨髓,分为青年组(3例,26~31岁),中年组(3例,52~59岁)与老年组(3例,62~70岁),改良MACS分选出各组骨髓CD34+CD38-细胞,流式细胞术检测其纯度,台盼蓝染色检测细胞存活率,SA-β-gal染色检测各组细胞衰老情况。3.分离各组人骨髓单个核细胞,体外贴壁培养14-21天,倒置镜下计数细胞数>50的成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)个数。取第3代BMSCS,流式细胞术检测CD34,CD45,CD73,CD90,and CD105细胞表型,SA-β-gal染色观察各年龄组阳性细胞百分比,CCK-8检测比较各年龄组BMSCS形成CFU-F的能力。4.取正常人骨髓3例。慢性髓细胞白血病患者骨髓5例,分别分为对照组与ASP组。对照组,进行常规培养;ASP组,在培养体系中加10μg/ml当归多糖,其它条件同于对照组。分别计数各组CFU-F数量,CCK-8检测各组BMSCS增殖情况,SA-β-gal染色检测衰老细胞阳性率。碱性磷酸酶染色检测各组BMSCS的成骨分化能力,油红O染色检测BMSCS成脂分化能力。5.检测上述各组BMSCS内SOD,总谷胱甘肽,MDA,超氧化物的含量,观察各组细胞的氧化损伤及抗氧化能力。Elisa检测血管生成素Ⅰ含量,了解各组BMSCS的对造血系统的支持作用。6.RT-PCR和Western blotting检测各组人BMSCS衰老相关基因p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1m RNA及衰老相关蛋白P16INK4a、P21Cip1/Waf1、P19、P53表达的改变。7.将培养了叁代的各组BMSCS分别加入到带Transwell的六孔板的下层,将LSCS分别加入transwell的上层,每孔各106个LSCS。培养24h,取出上层的CD34+CD38-细胞进行CFU-Mix培养及CCK-8增殖能力检测。结果1.MACS分选前小鼠Sca-1+细胞百分比为(1.02 0.19)%;MACS分离纯化后Sca-1+细胞纯度可达(93.66±0.83)%。各年龄组分选前后Sca-1细胞纯度百分比无统计学差别。MACS分离纯化前每106个BMNCs中CD34+CD38-细胞群比例为1.76±0.34%;MACS分离纯化后每106个细胞中CD34+CD38-细胞群比例为91.15±2.41%。各组人BMSCS高表达CD73,CD90,CD105抗原,低表达CD34,CD45抗原。2.青年组,中年组与老年组人每107个BMNS形成CFU-F能力随年龄增加逐渐下降;人CD34+CD38-细胞形成CFU-Mix数量随年龄增加逐步下降降低,集落中的细胞数也逐渐减少;人BMSCS的SA-β-gal染色阳性率随年龄增加逐渐升高。幼年组,青年组,中年组,中老年组和老年组小鼠Sca-1+HSC/HPCSs形成CFU-Mix数量随年龄增加逐渐降低,集落中细胞数也逐渐减少;SA-β-gal染色小鼠BMSCS阳性细胞数随年龄增加逐渐升高。小鼠或人BMSCS的增殖情况均随年龄呈现逐步降低趋势。3.LSCS与BMSCS共培养结果表明,空白对照组和白血病组的LSCS集落数量明显高于其它组,集落中细胞数也高于其它组。ASP组LSCS集落数量明显少于白血病组,提示ASP干预的BMSCS有抑制LSCS增殖的作用,ASP作用BMSCS可以延缓其衰老。4.CML患者的BMSCS与健康人的BMSCS比较,形成CFU-F能力下降,而ASP作用CML患者的BMSCS后,形成CFU-F能力明显提高。SA-β-gal染色阳性的人BMSCS数在白血病组显着增加,而ASP组的SA-β-gal染色阳性的细胞数明显降低。白血病组的BMSCS成骨、成脂分化能力明显降低,而ASP组的BMSCS成骨、成脂分化能力明显高于白血病组。白血病组BMSCS的SOD,总谷胱甘肽与血管生成素Ⅰ含量明显降低,而MDA及超氧化物均明显增高,而ASP组BMSCS的SOD,总谷胱甘肽与血管生成素Ⅰ的含量明显提高,而MDA及超氧化物均明显降低。说明CML患者BMSCS较健康人的BMSCS出现明显衰老,而ASP可以延缓其衰老。5.PCR结果显示p16INK4a,p19Arf,p53,p21Cip1/Waf1基因在各组人BMSCS中均有表达,白血病组p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1m RNA表达水平显着高于其它各组,ASP组相应基因表达水平低于白血病组,Western Blot结果提示各组人BMSCS均有所表达P16INK4a、P21Cip1/Waf1、P53、P19蛋白,白血病组表达明显增高,ASP组相应蛋白表达低于白血病组,提示ASP能延缓人BMSCS衰老,其机理可能与ASP调控p16INK4a-Rb和p19Arf-Mdm2-p53-p21Cip1/Waf1信号通路有关。结论1.随年龄增加小鼠和人类的HSC及BMSCS均会出现衰老,表现为增殖分化能力下降等,这两种细胞的衰老可能存在相互关联。2.随着年龄的增加,人骨髓间充质干细胞出现衰老,对造血系统尤其是造血干细胞的支持作用下降,这可能会导致造血干细胞变成增殖性很强的白血病干细胞,于是患上白血病。且有白血病干细胞的存在,白血病的治疗效果不好,容易复发。本部分实验提示当归多糖可能可以通过延缓间充质干细胞衰老抑制白血病干细胞的增殖分化,进而抑制白血病干细胞的产生,降低慢性髓细胞白血病的患病率。3.当归多糖可以调控CML骨髓间充质干细胞衰老,从而抑制白血病干细胞的增殖,其可能的机理是通过提高细胞的抗氧化能力和降低细胞氧化损伤。也可能与p16INK4a-Rb和p19Arf-Mdm2-p53-p21Cip1/Waf1信号通路的调控有关。这个发现可以成为我们今后探索治疗CML的新方法的新途径。
庞全海[9]2005年在《山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及体外分化潜能的研究》文中进行了进一步梳理骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是来自于骨髓的两种干细胞之一,在人、小鼠、大鼠、兔、猪等许多物种的研究证明了该类干细胞具有体外分化为多种细胞表型的能力,有望成为未来细胞/基因治疗、组织工程的主要种子细胞之一。但是,迄今未见关于山羊,特别是成年山羊骨髓间充质干细胞分离、培养、分化等方面的系统研究报道。本研究目的在于阐明山羊骨髓间充质干细胞的生物学性能及其分化潜能,以便未来利用该类细胞作为疾病细胞/基因治疗的模型,以及利用该类细胞作为细胞生物反应器体外生产生物活性物质,进而建立山羊骨髓间充质干细胞细胞系。为此,本试验利用成年关中奶山羊为对象,较为系统全面地研究了其骨髓间充质干细胞的分离、培养、扩增、形态学、生长特性、细胞表面标志,以及体外诱导分化能力。结果如下:1. 本试验应用贴壁分离法或密度梯度离心法成功分离获得关中奶山羊髂骨骨髓间充质干细胞,体外培养到第21 代,仍然保持其干细胞的特性,并已扩增到2.8×108细胞。2. 本试验所分离的关中奶山羊骨髓间充质干细胞呈多角形、叁角形或长梭形,类似于人和其他物种的间充质干细胞。3. 扫描电镜下,山羊骨髓间充质干细胞表面较为粗糙,有多个突起,并有较多微棘和丝突,当多个细胞同时存在时,这些丝突相互搭接成网状。透射电镜下,山羊骨髓间充质干细胞的结构与其他物种基本相似,即表现为细胞内有大量扩张的粗面内质网、线粒体,分泌功能旺盛,具有该类细胞的典型特征:细胞核质比大、胞浆中细胞器少、核仁明显处于功能静息期。4. 免疫细胞化学分析表明,山羊骨髓间充质干细胞能够表达间充质干细胞的表面标志CD29、CD44、CD105、CD106 以及CD166(阳性),而不表达造血干细胞的标志CD14、CD34、CD45、c-kit (阴性),和其他物种的骨髓间充质干细胞相似。这些标志的检测有助于鉴定间充质干细胞。但本试验还发现,山羊骨髓间充质干细胞也表达TGF-α,其意义需要进一步阐明。5. 山羊骨髓间充质干细胞可以在体外用5-氮胞苷诱导分化为心肌细胞表型,能够表达α-actin 抗原,呈PAS 染色阳性,并分泌糖原,从而为未来利用这种细胞进行心脏疾病细胞/基因治疗的模型研究提供了科学依据。同时,这也是和骨髓造血干细胞的区别之一。6. 用HGF 和尼克酰胺向胰岛β-细胞诱导后,山羊骨髓间充质干细胞能够变为较典
陈伟[10]2004年在《人骨髓间充质干细胞集落培养及其生物学特性的研究》文中指出一、目的 (一)拟体外在集落水平上建立有效培养人骨髓间充质干细胞的一条技术路线。 (二)进一步研究人骨髓间充质干细胞增殖、分化等生物学特性，为问充质干细胞作为“种子细胞”在细胞移植和支持造血方面的临床应用奠定基础。 二、方法 (一)以健康自愿者骨髓为实验对象，密度梯度离心法和贴壁法结合筛选骨髓间充质干细胞，以套圈法获取骨髓间充质干细胞集落扩增培养。 (二)检测人骨髓间充质干细胞的生物学特性：包括1、hMSCs的表面标记检测；2、hMSCs的生长曲线测定，分别检测了P3、P8、16、P17代MSCs；3、克隆形成能力的检测，分别检测了P3、P8、16、P17代细胞；4、MSCs的冻存和复苏； (叁)应用RA诱导hMSCs向神经干细胞的分化。 叁、结果 (一)本实验所用培养方法能有效扩增集落来源的骨髓间充质干细胞，细胞倍增时间约为48～72h。传15代即使扩增的细胞总数达到(1～3)×10~(10)数量级。继续传代可传20代。 (二)流式细胞仪检测示细胞表达CD13、CD29、CD59、CD44、CD71而不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86、CD117，表明它是间充质干细胞而不是造血细胞。细胞的表面标记显示扩增的是骨髓间充质干细胞且纯度达97％以上，可视为集落来源的骨髓间充质干细胞。 (叁)生长曲线示培养的细胞17代以前生长良好，17代以后细胞生长明显变慢，光镜下形态变大、形状变为不规则，胞浆内及培养液中可见较多颗粒，折光性差。克隆形成能力数:MsCsl7代前3、8、16无明显差异(P>0.05)，17代后克隆形成能力降低，与17代前数代比有显着性的差异(P<0.05)。 (四)常规冻存方法能有效保存细胞，复苏后活细胞达96%以上，细胞生长传代良好。 (五)体外诱导分化能力检测显示培养的细胞保持其分化潜能，可分化成神经干细胞，诱导比例分别为25.6%。 四、结论 (一)本实验所用培养方法能有效扩增集落来源的骨髓间充质干细胞，经表面标记检测、体外维甲酸(RA)诱导分化神经干细胞实验证实为MSCs。细胞的生长曲线和克隆形成实验显示MSCS是一种生命力有限的细胞。 (二)本实验方法简便可靠，扩增培养的细胞生长良好达(1一3)x 10’“数量级，并具有向神经干细胞定向诱导分化的潜能，不仅可以作为“种子细胞”用于实验研究，还可满足临床细胞移植所需，有一定先进性。
参考文献：
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[5]. 人胎盘源间充质干细胞对脐血单个核细胞体外生长的支持作用及体内移植促进造血重建的实验研究[D]. 袁雅红. 苏州大学. 2008
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[7]. 淋巴细胞活化与BMMSCs向脂肪分化的相互影响及可能的临床意义[D]. 王海燕. 复旦大学. 2009
[8]. 当归多糖调控CML患者骨髓间充质干细胞衰老抑制白血病干细胞增殖的机理研究[D]. 耿珊. 重庆医科大学. 2016
[9]. 山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及体外分化潜能的研究[D]. 庞全海. 西北农林科技大学. 2005
[10]. 人骨髓间充质干细胞集落培养及其生物学特性的研究[D]. 陈伟. 第一军医大学. 2004
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