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黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4的克隆及抗逆功能分析

2020-12-10阅读(853)

黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4的克隆及抗逆功能分析

论文摘要

黄瓜是一种重要的具有很高经济价值的作物,由于在农业生产中经常遭受各种胁迫,使得黄瓜的正常生长受到阻碍,从而造成产量减产。提高黄瓜的抗逆能力,对黄瓜的增产、提高经济效益等都有着十分重要的作用和意义。我们以黄瓜全基因组测序为基础,对黄瓜金属硫蛋白基因家族进行生物信息学分析;通过荧光定量PCR分析了黄瓜金属硫蛋白基因在胁迫下的表达量;通过RT-PCR克隆了CsMT4基因;通过进行酶切、连接以及转化,成功构建了pET32a-CsMT4表达载体,并通过原核表达系统对CsMT4基因进行抗逆性功能分析。主要结果如下:1.预测了黄瓜金属硫蛋白基因家族成员。黄瓜中共有3个金属硫蛋白基因,根据它们在染色体上的具体不同的位置,将它们分别命名为:CsMT2、CsMT3、CsMT4。进化分析表明,黄瓜CsMT3与水稻OsMT3a和OsMT3b以及拟南芥AtMT3聚为一类,但亲缘关系较远,同源性不高;黄瓜CsMT4与拟南芥AtMT2a和AtMT4b以及水稻OsMT4,但亲缘关系也比较远,同源性不高,CsMT2与水稻OsMT1d和OsMT2c聚为一类,亲缘关系比较近,同源性高。2.分析表明,黄瓜金属硫蛋白基因的表达具有明显的组织特异性:CsMT2在各个组织都表达,在茎、叶、花中的表达量很高;CsMT3不在根中表达,在茎中的表达量不是很高,在其它组织中表达量都很高;CsMT4在茎和花中不表达,在根的表达量比较低,在叶和果中的表达量较高。3.荧光定量PCR表达量分析结果表明,非生物胁迫（PEG、ABA和NaCl）的胁迫下,使用不同的胁迫方法处理,在不同程度上对CsMT4的表达都具有促进作用。4.通过RT-PCR克隆了黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4,成功构建了pET32a-CsMT4表达载体,并且在BL21中高效表达。5.抗逆性分析结果表明,原核表达的黄瓜金属硫蛋白CsMT4能够有效的提高大肠杆菌抗逆性。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 植物金属硫蛋白的研究进展
  •     1.1.1 植物金属硫蛋白的结构特征和分类
  •     1.1.2 植物金属硫蛋白的理化性质
  •       1.1.2.1 分子量
  •       1.1.2.2 氨基酸成分
  •       1.1.2.3 紫外吸收
  •       1.1.2.4 等电点
  •     1.1.3 植物金属硫蛋白的生理功能
  •       1.1.3.1 参与金属离子的储存、运输和代谢
  •       1.1.3.2 参与重金属离子解毒
  •       1.1.3.3 参与清除ROS
  •       1.1.3.4 参与植物生长发育和表达调控
  •       1.1.3.5 参与逆境胁迫
  •       1.1.3.6 环境保护作用
  •   1.2 黄瓜逆境胁迫的研究进展
  •     1.2.1 不同胁迫对黄瓜生长发育的影响
  •       1.2.1.1 低温对黄瓜生长的影响
  •       1.2.1.2 干旱对黄瓜生长的影响
  •       1.2.1.3 盐度对黄瓜生长的影响
  •   1.3 本研究的目的和意义
  • 第二章 黄瓜金属硫蛋白基因的生物信息学分析
  •   2.1 材料与方法
  •     2.1.1 实验材料
  •     2.1.2 实验方法
  •       2.1.2.1 黄瓜金属硫蛋白核酸与蛋白质序列的获取
  •       2.1.2.2 黄瓜金属硫蛋白基因CsMT的基因结构与启动子顺式作用元件分析
  •       2.1.2.3 黄瓜金属硫蛋白的系统进化分析
  •       2.1.2.4 黄瓜金属硫蛋白基因的保守基序分析
  •       2.1.2.5 黄瓜金属硫蛋白基因的其它生物信息学特征分析
  •   2.2 结果与分析
  •     2.2.1 黄瓜金属硫蛋白基因CsMT的鉴定与基本分析
  •     2.2.2 黄瓜金属硫蛋白基因CsMT的基因结构分析
  •     2.2.3 黄瓜金属硫蛋白基因CsMT的启动子顺式作用元件分析
  •     2.2.4 黄瓜与其他物种金属硫蛋白CsMT的多序列比对及进化树构建
  •     2.2.5 黄瓜金属硫蛋白的基序分布
  •     2.2.6 黄瓜金属硫蛋白的跨膜结构与亲疏水性分析
  •     2.2.7 黄瓜金属硫蛋白的结构域与亚细胞定位分析
  •     2.2.8 黄瓜金属硫蛋白的三级结构预测
  • 第三章 黄瓜金属硫蛋白基因CsMT的表达分析
  •   3.1 材料与方法
  •     3.1.1 植物材料与处理
  •     3.1.2 试剂和仪器
  •     3.1.3 引物
  •     3.1.4 RNA的提取
  •     3.1.5 cDNA合成及组织表达谱分析
  •     3.1.6 黄瓜金属硫蛋白基因CsMT的荧光定量分析
  •   3.2 结果与分析
  •     3.2.1 黄瓜金属硫蛋白基因CsMT组织表达谱
  •     3.2.2 黄瓜金属硫蛋白基因CsMT在逆境胁迫下的表达模式
  • 第四章 黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4 的原核表达
  •   4.1 材料与方法
  •     4.1.1 植物材料
  •     4.1.2 菌种和载体
  •     4.1.3 引物
  •     4.1.4 酶和试剂
  •     4.1.5 主要仪器和设备
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4 的克隆
  •       4.2.1.1 黄瓜幼苗叶片的提取
  •       4.2.1.2 逆转录获得c DNA第一条链
  •       4.2.1.3 反转录扩增黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4
  •       4.2.1.4 凝胶中回收CsMT4 基因
  •       4.2.1.5 黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4 的连接
  •       4.2.1.6 转化
  •       4.2.1.7 提取质粒
  •       4.2.1.8 重组质粒的鉴定和测序
  •     4.2.2 构建原核表达载体
  •       4.2.2.1 提取pMD18-CsMT4 质粒
  •       4.2.2.2 原核表达载体pET-32a和 pMD18-CsMT4 的双酶切
  •       4.2.2.3 CsMT4 基因和线性化载体pET-32a的连接
  •       4.2.2.4 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞
  •       4.2.2.5 CsMT4 基因重组质粒PCR和酶切鉴定
  •     4.2.3 CsMT4 蛋白的诱导表达
  •     4.2.4 SDS-PAGE电泳检测CsMT4 蛋白表达情况
  •     4.2.5 重组大肠杆菌的抗逆性分析
  •   4.3 结果与分析
  •     4.3.1 CsMT4 基因的克隆
  •       4.3.1.1 黄瓜叶片总RNA的提取
  •       4.3.1.2 RT-PCR扩增黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4
  •       4.3.1.3 PCR产物的胶回收
  •       4.3.1.4 连接产物的转化
  •       4.3.1.5 重组质粒的菌液PCR鉴定
  •       4.3.1.6 重组质粒的酶切鉴定
  •     4.3.2 黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4 的原核表达
  •       4.3.2.1 原核表达载体的构建
  •       4.3.2.2 较优条件下CsDHN4 蛋白的诱导表达
  •     4.3.3 黄瓜金属硫蛋白CsMT4 对大肠杆菌的抗逆性影响
  •       4.3.3.1 耐高温
  •       4.3.3.2 耐低温
  •       4.3.3.3 耐旱
  •       4.3.3.4 耐盐
  • 第五章 讨论
  • 第六章 结论与展望
  •   6.1 结论
  •   6.2 展望
  • 参考文献
  • 附录A 英文缩写符号及中英文对照表
  • 附录2 试剂配方
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 李光华

    导师: 刘世强

    关键词: 黄瓜,金属硫蛋白,克隆,原核表达

    来源: 江西农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,园艺

    单位: 江西农业大学

    分类号: S642.2;Q943.2

    DOI: 10.27177/d.cnki.gjxnu.2019.000305

    总页数: 60

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