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向日葵锈菌金属蛋白酶基因的生物信息学分析及其原核表达

2020-12-02阅读(97)

向日葵锈菌金属蛋白酶基因的生物信息学分析及其原核表达

论文摘要

向日葵锈病（Puccinia helianthi Schw.）是向日葵重要病害之一,严重危害向日葵的品质及含油量。向日葵锈菌分泌的胞外蛋白酶是其致病因子之一,这种蛋白酶破坏植物细胞外部保护屏障,有利于病菌侵入,导致寄主感病。本研究基于前期实验室对向日葵锈菌转录组数据分泌蛋白的筛选,从中挑出一条表达量较高的基因（KU994904）进行分析,首先进行该基因生物信息学分析,以确定它的主要的功能,命名为金属蛋白酶（metalloproteinase,mep）,其次克隆了该金属蛋白酶基因,构建相关原核载体进行体外表达,同时对其亚细胞定位,确定其主要作用位点,为实验室今后进一步研究该蛋白的致病机制奠定了基础。主要取得以下结果:1.生物信息学分析。该金属蛋白酶成熟基因序列长1335bp,编码445个氨基酸,利用在线软件 SignalP4.1 Server、TMpred、big-PI predictor 及 TargetP 1.1 确定此蛋白酶为胞外分泌蛋白,通过NCBI进行比对,其与M36家族中5条序列具有较高相似性,并利用SWISS-MODEL基于同源建模的方法检索PDB（protein data bank）蛋白质结构数据库,发现同胞外金属蛋白酶基因序列相似度达到53.77%,因此,推断其为胞外分泌金属蛋白酶。2.原核表达。利用密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Program（V13）对序列进行优化,采用全基因克隆方法同pET30a表达载体连接,成功构建原核表达载体pET30a-金属蛋白酶。将重组质粒转到BL21菌株中,利用O.lmM IPTG进行重组蛋白诱导表达。重组质粒在15℃和37℃下诱导16h均可大量表达,利用不同浓度咪唑洗脱蛋白质,确定蛋白酶存在于包涵体中。将蛋白质通过Ni-IDA亲和层析进一步纯化,通过Bradford方法测定蛋白浓度为0.558 mg/mL。最后,利用Western-blot进行验证,证实该蛋白为目的蛋白,其蛋白分子量约为49.5kDa。3.亚细胞定位分析。利用T4连接酶成功构建表达载体pCambia1302-eGFP,将表达载体转到农杆菌GV3101,进一步将带有表达载体的农杆菌GV3101转化到本氏烟草,观察亚细胞定位结果。发现向日葵锈菌金属蛋白酶定位于烟草细胞外部的屏障上（细胞壁或细胞膜）,推测向日葵锈菌胞外分泌的金属蛋白酶主要作用于细胞外部屏障,通过破坏寄主细胞组织结构成分促进其侵染。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 1 引言
  •   1.1 向日葵种植情况
  •   1.2 向日葵锈病发生与发布
  •   1.3 向日葵锈病侵染循环
  •   1.4 病原菌的致病机制
  •   1.5 病原菌分泌酶类物质
  •     1.5.1 蛋白酶
  •     1.5.2 真菌蛋白酶
  •     1.5.3 金属蛋白酶
  •   1.6 生物信息学
  •   1.7 本研究的目的及意义
  • 2 向日葵锈菌胞外分泌蛋白生物信息学分析
  •   2.1 数据来源
  •   2.2 生物信息学分析
  •     2.2.1 蛋白序列及特征性分析
  •     2.2.2 蛋白疏水性、跨膜区、信号肽、GPI锚定位点及亚细胞定位分析
  •     2.2.3 蛋白二三级结构与结构域
  •   2.3 结果
  •     2.3.1 蛋白酶基因序列筛选及特征性分析
  •     2.3.2 蛋白酶疏水性、跨膜区、信号肽、GPI锚定位点及亚细胞定位分析
  •     2.3.3 蛋白二三级结构与结构域预测
  •   2.4 结论与讨论
  • 3 金属蛋白酶原核表达
  •   3.1 材料与方法
  •     3.1.1 实验材料
  •     3.1.2 主要仪器
  •     3.1.3 主要试剂
  •     3.1.4 培养基的配制
  •     3.1.5 向日葵锈病菌RNA提取
  •     3.1.6 cDNA的合成
  •     3.1.7 基因扩增
  •     3.1.8 PCR产物纯化
  •     3.1.9 回收产物与克隆载体连接
  •     3.1.10 感受态的制备与转化
  •     3.1.11 重组质粒的筛选
  •     3.1.12 重组质粒的提取与验证
  •     3.1.13 目的基因和表达载体pET30a连接
  •     3.1.14 重组质粒的诱导表达
  •     3.1.15 菌液放大培养
  •     3.1.16 蛋白纯化
  •     3.1.17 亲和层析纯化蛋白
  •     3.1.18 分子筛层析（SEC）纯化蛋白
  •     3.1.19 Bradford测定蛋白浓度
  •     3.1.20 Western-blot检测蛋白
  •   3.2 结果与分析
  •     3.2.1 蛋白酶基因扩增及克隆载体构建
  •     3.2.2 蛋白酶基因表达载体构建
  •     3.2.3 SDS-PAGE分析鉴定诱导表达结果
  •     3.2.4 蛋白纯化
  •   3.3 结论与讨论
  • 4 金属蛋白酶亚细胞定位
  •   4.1 材料与方法
  •     4.1.1 实验材料
  •     4.1.2 主要仪器
  •     4.1.3 主要试剂
  •     4.1.4 基因扩增
  •     4.1.5 目的基因与克隆载体连接
  •     4.1.6 表达载体构建
  •     4.1.7 农杆菌GV3101感受态细胞制备
  •     4.1.8 农杆菌感受态细胞转化
  •     4.1.9 烟草瞬时表达
  •   4.2 结果与分析
  •     4.2.1 金属蛋白酶表达载体构建
  •     4.2.2 金属蛋白酶成熟基因的烟草瞬时表达
  •   4.3 结论与讨论
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 作者简介

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 李鑫淳

    导师: 景岚

    关键词: 向日葵锈菌,金属蛋白酶,生物信息学分析,原核表达,亚细胞定位

    来源: 内蒙古农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,植物保护

    单位: 内蒙古农业大学

    分类号: S435.655;Q78

    DOI: 10.27229/d.cnki.gnmnu.2019.000483

    总页数: 55

    文件大小: 3654K

    下载量: 163

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