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东方蝾螈IL-8在肢体再生过程中的表达变化

2020-12-09阅读(850)

东方蝾螈IL-8在肢体再生过程中的表达变化

论文摘要

研究背景:外伤后的肢体再生一直是医学的难点和研究热点,免疫系统及其调控机制被认为在伤口愈合及再生完成的过程中发挥着关键的作用。有尾两栖类动物蝾螈,具有独特而强大的再生能力,是研究肢体再生过程中的理想模型。巨噬细胞对肢体早期再生过程至关重要,但是对启动巨噬细胞募集至损伤部位的信号,目前还不清楚。白介素8（IL-8）是一种对巨噬细胞有强烈趋化作用的细胞因子,在炎症反应中起到关键作用,IL-8也参与细胞的迁移、血管生成、有丝分裂等生命活动。但是IL-8在伤口愈合和再生中的作用及其机制的相关研究却很少。方法及结果:本实验首先建立东方蝾螈断肢再生模型,根据蝾螈转录组测序结果设计合成引物,利用PCR技术首次克隆出蝾螈IL-8基因开放阅读框（ORF）共306bp,可编码101个氨基酸。通过构建原核表达载体pET32a/IL-8,成功诱导表达IL-8融合蛋白,其大小约为29kD。随后将镍柱纯化得到的融合蛋白作为抗原,制备蝾螈IL-8多克隆抗体,并利用ELISA、细胞转染、Western Blot等技术检测抗体特异性。利用实时荧光定量PCR（QRT-PCR）,切片原位杂交技术观察蝾螈肢体再生不同时间点IL-8在核酸水平的表达变化和分布,发现IL-8 mRNA在肢体再生早期有明显的上调,随着伤口愈合IL-8表达量逐渐下调,直到肢体再生14dpa（day post amputation）恢复到正常水平,IL-8 mRNA表达主要集中分布在肢体截肢部位处。随后利用IL-8多克隆抗体,观察肢体再生不同时间点IL-8在蛋白水平的表达变化及分布,通过Western Blot结果显示在蝾螈断肢后,IL-8蛋白表达量持续升高,在再生3dpa时达到峰值,直至再生14dpa左右IL-8蛋白的表达逐渐恢复到正常基线水平,利用荧光免疫组织染色技术在肢体再生早期伤口处检测到大量IL-8阳性细胞。结论:本研究证实IL-8表达在蝾螈肢体再生的早期显著上调,推测IL-8可能参与肢体再生早期过程。这为进一步揭示IL-8基因在肢体再生过程中的功能,解释其相关作用机制提供了基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略语对照表
  • 第一章 绪论
  •   1.1 蝾螈简介
  •   1.2 蝾螈肢体再生过程
  •   1.3 免疫系统参与再生的研究
  •     1.3.1 免疫细胞与再生
  •     1.3.2 趋化因子与再生
  •   1.4 趋化因子IL-8 的研究进展
  •   1.5 展望
  •   1.6 本论文研究的目的与意义
  • 第二章 ：东方蝾螈IL-8基因的克隆与鉴定
  •   2.1 实验材料
  •   2.2 实验试剂
  •   2.3 实验耗材
  •   2.4 实验仪器
  •   2.5 主要试剂配制
  •   2.6 试验方法
  •     2.6.1 断肢模型建立
  •     2.6.2 东方蝾螈再生组织不同时间点总RNA提取
  •     2.6.3 东方蝾螈再生组织c DNA合成
  •     2.6.4 东方蝾螈IL-8 基因的扩增
  •     2.6.5 PCR产物回收纯化
  •     2.6.6 连接反应
  •     2.6.7 转化
  •     2.6.8 菌液PCR检测及测序
  •   2.7 实验结果
  •     2.7.1 东方蝾螈肢体再生过程不同时间点总RNA提取
  •     2.7.2 PCR获取目的基因IL-8
  •     2.7.3 生物信息学分析
  •   2.8 小结与讨论
  • 第三章 重组IL-8蛋白的表达及纯化
  •   3.1 菌种和质粒
  •   3.2 实验试剂
  •   3.3 实验耗材
  •   3.4 实验仪器
  •   3.5 主要试剂配制
  •   3.6 实验方法
  •     3.6.1 PCR扩增
  •     3.6.2 pET32a/IL-8 载体构建
  •     3.6.3 重组蛋白IL-8 诱导表达
  •     3.6.4 Western Blot检测原核表达产物
  •     3.6.5 原核表达重组蛋白镍（Ni）柱纯化
  •     3.6.6 蛋白切胶再纯化
  •   3.7 实验结果
  •     3.7.1 PCR扩增IL-8 基因
  •     3.7.2 pET32a/IL-8 原核表达载体构建
  •     3.7.3 重组蛋白原核表达
  •     3.7.4 蛋白纯化
  •     3.7.5 小结与讨论
  • 第四章 蝾螈IL-8抗体的制备、鉴定与纯化
  •   4.1 实验材料
  •   4.2 实验试剂
  •   4.3 实验耗材
  •   4.4 实验仪器
  •   4.5 主要试剂配制
  •   4.6 试验方法
  •     4.6.1 制备抗原
  •     4.6.2 免疫兔子
  •     4.6.3 抗体效价测定
  •     4.6.4 抗体纯化
  •     4.6.5 抗体特异性检测
  •   4.7 实验结果
  •     4.7.1 ELISA检测抗体效价
  •     4.7.2 多克隆抗体特异性检测
  •   4.8 小结与讨论
  • 第五章 蝾螈肢体再生过程中IL-8的表达及变化
  •   5.1 实验材料
  •   5.2 实验试剂
  •   5.3 实验耗材
  •   5.4 实验仪器
  •   5.5 主要试剂制备
  •   5.6 实验方法
  •     5.6.1 HE染色
  •     5.6.2 肢体再生过程中IL-8 在核酸水平的表达变化
  •     5.6.3 肢体再生过程中IL-8 在蛋白水平的表达变化
  •   5.7 实验结果
  •     5.7.1 形态观察
  •     5.7.2 实时荧光定量PCR（QRT-PCR）定量分析
  •     5.7.3 荧光原位杂交观察IL-8 基因的空间定位
  •     5.7.4 IL-8 基因在蛋白水平的表达变化
  •     5.7.5 小结与讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读硕士学位期间取得的科研成果

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 苏娇娇

    导师: 谢鑫

    关键词: 蝾螈,肢体,再生

    来源: 西北大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 西北大学

    分类号: Q75;Q78

    总页数: 86

    文件大小: 5322K

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