转基因猪血中重组人血清白蛋白分离纯化方法研究

论文摘要

目前,人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）由人血液提取,由于来源有限满足市场的需求,且人血来源极其复杂,可能存在血源污染等潜在威胁,因此,迫切需要一种安全可靠、成本相对低廉的HSA替代品。基于快速发展的基因重组技术,可利用该技术来生产重组人血清白蛋白（recombinant human serum albumin,rHSA）,由于该技术能够克服传统方法存在的血源供应不足以及血源污染等缺陷,目前已经成为研究和生产rHSA的重点技术。由于临床用药和生化研究对转基因猪血中分离纯化出的rHSA的要求较高,因此,如何分离纯化rHSA成为研究是关键。本研究中建立了一种从猪血中获得高纯度和高收率的rHSA分离纯化方法,为规模化的制备rHSA奠定基础。本文由四章组成。第一章前言部分对HSA和rHSA进行了概述,简单介绍了几种常见的白蛋白的纯化方法,并提出了本课题的研究目标与意义。第二章,首先采用低温乙醇沉淀法的改良方法—热乙醇沉淀法对猪血浆中rHSA进行粗提取。我们考察并优化了热乙醇沉淀法中反应体系pH、加热温度、恒温反应时间和稀释倍数等主要影响因素对rHSA提取效果的影响。由反相高效液相色谱色谱（RP-HPLC）纯度表征结果可知,在pH6.5,65℃、40 min以及2倍稀释倍数的最优反应条件下,rHSA纯度从猪血浆中的9.3%提高到热乙醇沉淀法的69.5%。第三章,我们考察了阳离子、阴离子、阳-阴离子相结合和阴-阳离子交换色谱相结合的方法对热乙醇沉淀粗纯化后rHSA进行精纯化的效果,并对色谱条件进行优化。结果表明采用阴离子交换色谱法,对热乙醇沉淀法粗纯化的rHSA进行精纯化,能达到最佳的纯化效果,所得产物经RP-HPLC纯度表征结果为85.0%。第四章,为了进一步提高纯度,采用两种路线（反相色谱（路线一）和凝胶色谱法（路线二））对阴离子交换色谱法纯化后的rHSA进行二次精纯化。RP-HPLC表征结果,反相色谱和凝胶色谱法的产物纯度均达到了100.0%。经HPLC-MS/MS表征,两种路线得到产物的纯度分别约为97.33%和93.77%,总回收率分别约为41.1%和38.6%。尽管热乙醇沉淀-阴离子-反相色谱（路线一）的纯度和回收率相对于热乙醇沉淀-阴离子-凝胶色谱法（路线二）均较高,但反相色谱的流动相中有机溶剂可能会导致目标蛋白发生变性,可能会破环蛋白的结构从而限制了此纯化路线的应用;而凝胶色谱法采用的是低浓度盐缓冲液,条件更加温和,利于保持蛋白在纯化过程中的稳定,更适用于rHSA的纯化,因此最终采用路线二作为最终转基因猪血中rHSA的纯化方案。所建立的方法有望从转基因猪血中提取出高纯度rHSA,以实现其更广泛的应用。

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缩略语索引

摘要

Abstract

第一章前言

1.1 人血清白蛋白的概述

1.2 重组人血清白蛋白的概述

1.3 常用白蛋白提取方法简介

1.4 本课题的目标和意义

第二章转基因猪血中重组人血清白蛋白粗提取—热乙醇沉淀法

2.1 前言

2.2 实验材料

2.2.1 仪器与设备

2.2.2 材料与试剂

2.3 实验方法

2.3.1 初步分离血浆—抗凝、离心去除血细胞

2.3.2 冷冻沉淀—凝血因子、纤维蛋白原等的去除

2.3.3 热乙醇沉淀法—粗提取rHSA

2.4 rHSA纯度表征方法

2.5 rHSA的回收率

2.6 结果与讨论

2.6.1 pH值对热乙醇沉淀法提取rHSA纯度和回收率的影响

2.6.2 加热温度对热乙醇沉淀法提取rHSA纯度和回收率的影响

2.6.3 恒温加热时间对热乙醇沉淀法提取rHSA纯度和回收率的影响

2.6.4 稀释倍数对热乙醇沉淀法提取rHSA纯度和回收率的影响

2.7 结论

第三章转基因猪血中重组人血白蛋白的精纯化一—离子交换色谱法

3.1 前言

3.2 实验材料

3.2.1 实验仪器

3.2.2 实验试剂

3.3 离子交换色谱法对rHSA的精纯化

3.3.1 单独利用阳离子交换色谱法对rHSA精纯化

3.3.2 单独利用阴离子交换色谱法对rHSA精纯化

3.3.3 阳离子交换色谱法与阴离子交换色谱法相结合对rHSA精纯化

3.4 rHSA纯度表征方法

3.5 rHSA的回收率

3.6 结果与讨论

3.6.1 阳离子交换色谱或者阴离子交换色谱对rHSA纯化结果的比较

3.6.2 阳-阴离子交换色谱或者阴-阳离子交换色谱相结合对rHSA纯化的结果的比较

3.6.3 阴离子交换色谱法的条件探索

3.6.3.1 弱溶剂流动相的种类和浓度

3.6.3.2 强溶剂流动相种类及盐浓度

3.6.3.3 流动相pH值对阴离子交换色谱分离纯化rHSA的影响

3.7 结论

第四章转基因猪血中重组人血白蛋白的精纯化二—反相色谱法或凝胶色谱法

4.1 前言

4.2 实验材料

4.2.1 仪器与设备

4.2.2 材料与试剂

4.3 实验方法

4.3.1 利用反相色谱法对rHSA精纯化

4.3.2 利用凝胶色谱法对rHSA精纯化

4.4 rHSA纯度表征方法

4.5 rHSA的回收率

4.6 结果与讨论

4.6.1 反相色谱法的纯化结果

4.6.2 SEC法的纯化结果

4.6.3 各个步骤产物的SDS-PAGE凝胶电泳纯度表征

4.6.4 各个步骤所得产物的液相色谱-质谱表征

4.7 结论

全文总结

参考文献

附录

致谢

综述白蛋白的纯化方法概述

综述参考文献

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 余谦

导师: 张养军

关键词: 重组人血清白蛋白,纯化,热乙醇沉淀法,离子交换色谱法,反相色谱法,凝胶色谱法

来源: 安徽医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,药学

单位: 安徽医科大学

分类号: R914;Q78

总页数: 72

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转基因猪血中重组人血清白蛋白分离纯化方法研究

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