贾慧敏[1]2003年在《先天性肛门直肠畸形胎鼠腰骶髓副交感神经元的定量研究》文中提出目的 先天性肛门直肠畸形(anorectal malformation，ARM)是小儿常见的消化道畸形，其发生率为1／5000-1／1500，其病因、病理机制复杂。近年来研究显示先天性肛门直肠畸形除肛门直肠的解剖结构异常外，其脊髓运动神经元和盆底肌肉的感觉和运动神经末梢均存在明显发育异常，并推测可能是导致术后便失禁的主要原因之一。生理状态下排便控制受多种因素影响，其中来自腰骶段脊髓的副交感核(sacral parasympathetic nucleus，SPN)的副交感神经对直肠活动有显着影响，当其兴奋时促进直肠蠕动，使肛门内括约肌松弛，利于粪便排出。如果骶髓副交感神经元(sacral parasympathetic neurons，SPN neurons)存在异常，可能明显影响直肠的收缩和蠕动功能，导致排便功能异常。但关于先天性肛门直肠畸形的骶髓副交感神经元发育是否存在异常，至今未见报道。本研究将胎儿外科、显微外科和显微注射技术相结合，应用荧光金神经逆向示踪技术，对先天性肛门直肠畸形胎鼠支配直肠的骶髓副交感神经元的形态、分布和数量进行研究，旨在探讨先天性肛门直肠畸形是否同时存在副交感神经支配异常以及对术后排便功能的影响，进而为临床治疗方法的改进提供一定依据。 方法 实验共采用Wistar孕鼠20只，其中致畸组15只，孕10天时经胃管注入1％乙烯硫脲(ethylenethiourea，ETU)，剂量为125mg／kg·w，制作肛门直肠畸形动物模型；对照组5只孕鼠，注入等量生理盐水。孕20天时，进行胎儿外科手术，通过显微注射方法，将5％荧光金（luorogold，FG）注射人正常胎鼠直肠壁及畸形胎鼠的直肠盲端肌层内。待孕鼠成活24小时后，取出手术的胎鼠，于显微镜下取其腰骰段脊髓进行固定和冰冻切片，在荧光显微镜下观察副交感神经元的数量、形态和分布，并进行统计学处理。 结 果 致畸组胎鼠手术存活率为60％，对照组存活率为71．4％。正常胎鼠标记神经元分布情况JG标记的副交感神经元位于脊髓侧角，分布在腰6到骰1脊髓节段。神经元体积较大，分布均匀。ETU致畸组根据畸形情况分为两组，一组为外观正常组，有胎鼠7只。另一组为肛门直肠畸形组，有胎鼠14只，其中高位畸形6只，低位8只。外观正常组的标记神经元数量为899。36个与正常对照组 90 t 46个相比统计学无显着性差异，低位肛门直肠畸形组标记神经元数量为588。102个，高位畸形组标记神经元数量为242。92个，与对照组和外观正常给药组相比均明显减少，统计学差异显着，而且神经元细胞体积明显减小。 结 论 1．本研究首次发现先天性肛门直肠畸形胎鼠骰髓副交感神经元数目减少，体积减小，呈发育不良改变。畸形位置愈高，副交感神经元数量降低愈明显。 2．本研究结果提示人类肛门直肠畸形术后便秘可能与骰髓副交感神经元数目减少及发育不良有关。
杨中华[2]2018年在《肛门直肠畸形胎鼠腰骶髓发育异常机制及其宫内骨髓间充质干细胞移植修复的实验研究》文中指出目的:先天性肛门直肠畸形(Anorectal Malformations,ARMs)是最常见的小儿消化道畸形,是世界卫生组织常规监测的先天畸形之一,占消化道畸形的1/4,发病率为1/1000~1/1500。尽管长期不断改进手术方式,挽救了患儿的生命,但术后肛门直肠功能的恢复面临很大的挑战,至少有1/3的患儿术后存在不同程度的便失禁和便秘等排便功能障碍,并需要终生进行治疗,严重影响患儿的生活质量、心理发育,给患儿、家庭和社会带来沉重的负担。研究人员已经逐渐意识到肛门直肠畸形病理改变复杂,术后肛门直肠功能不良取决于许多因素。前期课题组提出了先天性肛门直肠畸形腰骶段脊髓神经发育存在异常,并提出排便中枢所在的脊髓发育异常是导致先天性肛门直肠畸形术后排便功能障碍的重要原因之一。同时,提出了对于先天性肛门直肠畸形要进行恢复神经功能的治疗新思路。研究已经证实,在肛门直肠畸形患者及胎鼠模型中,肛门直肠存在畸形的同时多伴随发生不同程度的腰骶段脊髓发育异常。有研究表明高中位肛门直肠畸形患儿骶髓前角运动神经元神经元数量较正常儿减少,无肛患儿在组织学上存在骶髓发育不良。而在ARMs动物模型的研究中发现,支配肛提肌的感觉神经元、运动神经元以及支配直肠的副交感神经元在大鼠胚胎期便存在发育异常,神经元数目明显减少、神经元发育不良,是无肛畸形的神经病理改变之一。但是,迄今为止,ARMs神经元发育异常的胚胎发生机制尚不清楚。因此本研究采用高通量测序的方法在全转录组水平上筛查ARMs胚胎腰骶髓中异常表达的基因,探讨神经元异常发育的机制。脊髓神经发育过程需要迁移、增殖、分化、凋亡的等一系列细胞活动的参与,而这些细胞活动受到多种信号组成的复杂网络严格调控。其中,骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic,BMP)、无翅型MMTV整合位点(the wingless-type MMTV integration site,WNT)、声猬因子(Sonic hedgehog,Shh)信号在神经前体细胞分化过程中发挥着重要作用。BMP、WNT信号在脊髓背侧中间神经元区域表达最高,促使神经前体细胞向中间神经元方向分化。Shh在运动神经元区域表达最高,对于维持运动神经元和胶质神经元分化、轴突导向、突触形成起到了重要的作用。位于脊髓平面不同区域的BMP、WNT和Shh家族成员,浓度不同,相互协同或拮抗,共同维持各种神经细胞的分化、迁移、增殖、轴突导向以及和靶器官建立联系,这一过程的任一环节发生改变均可导致神经元的发育异常。在脊髓发育过程中,凋亡起到了非常重要的作用。凋亡可以清除神经管中多余的神经前体细胞以及没能有效建立突触连接的神经元。这个过程会促使神经元的数目适配其所支配的靶器官,并且对于保持神经系统的生理形态和功能起到了非常重要的作用。经典的中枢神经细胞凋亡理论认为过多的神经细胞凋亡是由于靶器官的发育不良引起的,靶器官发育不良而不能产生足够的神经营养因子反馈给中枢神经系统的神经细胞。这个过程清除了所谓的“无用”的神经细胞,而只有较少的神经细胞存活。课题组前期的研究显示,ARMs胎鼠胚胎形成过程中,盆底肌肌细胞过度凋亡、横纹肌复合体和肛门内括约肌发育不良,而支配这些靶器官的腰骶髓内神经元数目显着减少,但是凋亡是否发生异常改变目前尚不清楚,所以我们推测神经元的过度凋亡在ARMs胎鼠腰骶异常发育过程中发挥了重要的作用。针对ARMs胚胎腰骶髓神经发育不良,本研究进行了骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)移植,探索ARMs神经修复治疗方案。神经损伤的修复极其困难,近年来利用MSCs移植治疗脊髓损伤和神经系统退行性疾病已经取得不错的成果,但是在先天性神经系统疾病中的应用却少有报道。许多研究证实,MSCs同定植部位神经细胞间的相互作用,可通过自分泌或旁分泌的方式产生一些细胞因子,如神经营养因子、白细胞介素类、干细胞因子等。这些细胞因子对神经功能的恢复具有促进作用。MSCs还具有向病变组织定向迁移和发生位点特异性分化能力,可以向神经细胞方向分化,替代损伤部位神经元,有利于神经功能的修复。MSCs同定植部位神经细胞间的相互作用特性,非常适合先天性肛门直肠畸形脊髓发育异常的治疗,并且将是一个改善ARMs术后肛肠功能障碍的很有发展前景的治疗策略。本文应用乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU)对Wistar大鼠进行致畸,建立肛门直肠畸形动物模型,探索正常胎鼠及ARMs胎鼠腰骶髓发育过程中差异表达的基因、Shh-Ptch1-Gli1时空表达存在的差异和神经细胞凋亡情况,同时提取MSCs经过体外培养增殖后移植入ARMs胎鼠发育异常的腰骶髓区域,并在移植后观察脊髓神经细胞凋亡改善情况和分化情况,探索MSCs移植治疗ARMs胎鼠发育异常的腰骶髓的可行性。研究方法:1、动物模型制备及标本收集。Wistar大鼠,体重250~300 g,10~12周龄,由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供,雌雄鼠以5:l比例交配,次日清晨阴道涂片,置于显微镜下观察,发现载玻片上有精子者则定为孕0天(E0),于E10经胃管注入1%ETU(125 mg/kg)致畸,制作ARMs大鼠动物模型,对照组给予等量的生理盐水。选择E16、E17、E19、E21四个时间点,用10%水合氯醛(3.2 ml/kg)腹腔注射麻醉孕鼠,然后剖宫取胎收集标本组织,一部分标本放于4%多聚甲醛溶液中进行固定,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,常温保存,用于切片进行免疫组化染色和TUNEL染色;一部分用生理盐水和多聚甲醛对胎鼠进行心脏灌注。取其腰骶髓放入4%多聚甲醛中固定,然后放入20%的蔗糖中脱水48h,放入-80℃冰箱避光保存,用于切片进行免疫荧光染色和TUNEL染色。一部分标本在解剖显微镜下取腰骶髓组织,深度冰箱冻存,用于Western Blotting及RT-qPCR(Quantificational reverse transcriptase-polymerase)实验。2、全转录组测序筛查ARMs胎鼠与正常胎鼠的腰骶段脊髓中差异表达的基因。在E17取对照组及ARMs组腰骶段脊髓组织,进行全转录组测序实验(上海伯豪生物技术有限公司提供)。预测对照组和ARMs组中可能存在的差异表达的基因和非编码RNA以及二者之间的相互作用;并运用RT-qPCR对其中与神经发育相关的差异表达的基因进行验证。3、Shh-Ptch1-Gli1在两组大鼠胚胎腰骶髓发育过程中时空表达的研究。运用RT-qPCR技术对在正常组和ARMs组大鼠胚胎发育过程中腰骶髓中Shh-Ptch1-Gli1的mRNA表达水平进行定量分析;应用Western Blotting的方法对Shh-Ptch1-Gli1蛋白进行定量分析;应用免疫组化方法观察Shh-Ptch1-Gli1蛋白在大鼠胚胎晚期腰骶髓发育过程中的时空表达模式。初步探索叁种基因在腰骶髓发育过程中可能起到的作用。4、神经细胞凋亡及Bcl2/Bax在两组大鼠胚胎腰骶段脊髓发育过程中表达的研究。应用TUNEL染色观察大鼠胚胎晚期腰骶段脊髓发育过程中神经细胞的凋亡情况;运用RT-qPCR技术对在正常组和ARMs组大鼠胚胎发育过程中腰骶段脊髓中Bcl2/Bax的mRNA表达水平进行定量分析;应用Western Blotting的方法对Bcl2/Bax蛋白进行定量分析;应用免疫组化方法观察Bcl2/Bax蛋白在大鼠胚胎晚期腰骶段脊髓发育过程中的时空表达模式。探索神经细胞凋亡和Bcl2/Bax基因在腰骶段脊髓发育过程中可能起到的作用。5、MSCs移植修复ARMs胎鼠发育不良的腰骶髓。从4周龄的Wistar大鼠股骨分离骨髓间充质干细胞,应用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞。传代后移植入ARMs胎鼠的腰骶段脊髓区域,观察移植MSCs后ARMs胎鼠腰骶髓神经细胞分化和凋亡情况,探索子宫内移植骨髓间充质干细胞治疗ARMs胎鼠发育不良的腰骶髓的可行性。6、统计分析。所有的实验数据均以均值±标准差来表示,应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析,各胎龄正常组与ARMs组差异的比较采用t检验,相关性采用Pearson检验,统计值p<0.05表示差异有统计学意义。结果:1、高通量测序检测蛋白编码基因的同时,预测大量差异的lncRNA和circRNA,并进行差异RNA筛查(筛查条件为:Fold Change≥2.0,p≤0.05)结果显示:mRNA中,ARMs组较Normal组下调基因53个,上调基因41个;LncRNA中,ARMs组较Normal组下调63个,上调49个。CircRNA中,ARMs组较Normal组下调48个,上调31个。运用RT-qPCR技术对其中与神经发育相关的差异基因和部分lncRNA进行验证,结果显示RT-qPCR的结果与RNA-Seq检测和预测结果趋势基本一致。2、高通量测序结果显示Shh基因在ARMs胎鼠中表达异常,通过对比研究Shh-Ptch1-Gli1蛋白及mRNA在两组胚胎胚胎腰骶段脊髓组织中的时空表达,发现Shh/Ptch1在E17到达高峰,Gli1在E21达到高峰,Shh-Ptch1-Gli1表达主要集中在脊髓腹侧。而在ARMs组,与对照组相同时间点相比,Shh-Ptch1-Gli1表达明显减弱,但是表达趋势与正常组一致。3、高通量测序结果显示细胞凋亡相关基因Bax在ARMs胎鼠腰骶髓中异常表达,提示其神经元凋亡可能异常。进一步通过对比研究两组胚胎腰骶髓神经细胞凋亡情况,显示ARMs组凋亡指数(AI)明显上升,在E19天达到高峰。对Bcl2/Bax蛋白及mRNA的定性及定量研究表明,与正常组相比,ARMs胎鼠腰骶髓中Bcl2表达减弱,Bax表达明显增强。且Bcl2/Bax蛋白表达量比值与AI呈明显负相关趋势。4、提取的骨髓间充质干细胞在体外培养后48h后传代至P3-P6,移植到ARMs胎鼠腰骶髓区域,对比研究Synapsin和GFAP的mRNA和蛋白、神经细胞凋亡在对照组、ARMs组和MSCs+ARMs组叁组大鼠胚胎腰骶髓组织中的时空表达。与对照组相比,Synapsin在ARMs组明显表达减少,而移植MSCs后,虽然Synapsin表达显着增多,但是较对照组比较表达显着降低。与对照组相比,GFAP在ARMs组显着表达升高,而移植MSCs后,虽然GFAP表达显着降低,但是较对照组比较表达显着升高。通过对比研究叁组胚胎腰骶髓神经细胞凋亡情况,显示ARMs组凋亡指数(AI)明显上升,MSCs+ARMs组AI较ARMs组明显下降,但仍显着高于对照组。结论:1、大鼠腰骶段脊髓胚胎期发育是一个非常复杂的过程。高通量测序结果提示对照组和ARMs组中差异表达的mRNA,lncRNA和circRNA基因较多,除了有较多信号传导通路参与,还有mRNA-miRNA-lncRNA、mRNA-miRNA-circRNA共表达网参与调控,这些差异表达的RNA,如Shh和Bax及其所在的信号传导通路和共表达网可能是导致ARMs胎鼠腰骶段脊髓异常发育的原因。2、E16-E21,Shh-Ptch1-Gli1表达主要集中在前角区域,Shh-Ptch1-Gli1在ARMs组腰骶髓中的表达较正常组弱,Shh-Ptch1-Gli1的低表达可能与ARMs腰骶髓异常发育有关。3、E16-E21,ARMs组腰骶段脊髓中神经细胞凋亡显着增多,并且以前角为主,Bcl2在ARMs组腰骶段脊髓中的表达较正常组减弱,Bax在ARMs组腰骶段脊髓中的表达较正常组增强,Bcl2/Bax表达异常可能与ARMs腰骶段脊髓神经细胞凋亡显着增多有关。4、MSCs移植后,ARMs腰骶段脊髓神经突触增多,神经胶质细胞减少,神经细胞凋亡减少,说明MSCs移植可以影响局部的微环境及信号分子传递,使神经细胞增殖及分化。MSCs在一定程度上能够修复ARMs胎鼠发育不良的腰骶段脊髓。
参考文献：
[1]. 先天性肛门直肠畸形胎鼠腰骶髓副交感神经元的定量研究[D]. 贾慧敏. 中国医科大学. 2003
[2]. 肛门直肠畸形胎鼠腰骶髓发育异常机制及其宫内骨髓间充质干细胞移植修复的实验研究[D]. 杨中华. 中国医科大学. 2018
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