吴大治[1]2003年在《柔红霉素C-14羟化酶基因的克隆、表达和应用研究》文中研究说明柔红霉素和阿霉素是临床上重要的蒽环类抗生素，主要用于多种实体瘤和急性白血病的治疗，在临床上作为一线抗肿瘤药物使用。阿霉素是柔红霉素C-14位羟化的衍生产物，具有比柔红霉素更广的抗肿瘤谱和更小的毒副作用。目前工业上采用化学半合成法从柔红霉素转化生产阿霉素，不仅工艺复杂、转化率低，而且污染环境严重。本研究对微生物转化法替代现有工艺生产阿霉素进行了探索，从柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌SIPI 1482中克隆了柔红霉素C-14羟化酶基因(doxA)，构建了doxA基因的链霉菌表达质粒，导入变铅青链霉菌TK24中获得了柔红霉素转化基因工程菌，并研究了doxA基因在工程菌中的表达，最后还对工程菌转化柔红霉素生成阿霉素的发酵工艺进行了初步研究。研究结果如下： 通过PCR方法，首次从天蓝淡红链霉菌SIPI 1482菌株基因组DNA中扩增出约1.4 kb大小的doxA基因片段，这在国内外还是首次报道；但是从波赛链霉菌SIPI 40141菌株中却没有扩增出任何片段。经过测序和序列比对分析，PCR扩增获得的doxA基因序列和链霉菌C5菌株来源doxA基因序列完全相同，而和公开发表的波赛链霉菌ATCC 29050来源doxA基因同源性为93.4％。 构建了一个新颖的链霉菌高拷贝表达载体质粒pYG504，以用于异源基因在链霉菌中的克隆和表达。该载体质粒采用了黑色素基因(编码酪氨酸酶)启动子(Pmel)和fd终止子，启动子下游的SphⅠ、BglⅡ、SacⅠ、XbaⅠ和HindⅢ单一酶切位点可以用于插入异源目的基因，并且在SphⅠ位点上游存在SD序列。 构建了五个doxA基因链霉菌表达质粒pYG57、pYG502、pYG503、pYG505和pYG506，使得doxA基因在上游的Pmel启动子、红霉素抗性基因启动子(PermE)或者两者的串联启动子，以及下游的fd终止子(fd terminator)控制之下。相应地将构建的表达质粒导入变铅青链霉菌TK24中获得五株基因工程菌株。 SDS-PAGE蛋白电泳实验证明，上述五个菌株都能够表达大小约45 kD的柔红霉素C-14羟化酶蛋白，并发现以在PermE启动子控制下的doxA基因表达量相对较高，而终止子对＠中英文摘要 dd基因表达似乎没有影响。而对Tm4（pYG57）菌株中doxA基因表达方式的研究表明， dd基因在 PermE启动子控制下可能是一种组成型控制表达，其表达量在接种后培养到 48－60 h左右最高并且维持相对稳定，并且表达的柔红霉素 Cl4羟化酶主要存在于菌丝体 细胞内，很少分泌到细胞外。 对所构建的doxA基因工程菌发酵转化柔红霉素的实验结果表明，它们都能将桑红霉素 转化为阿霉素和某一副产物组分，并且以 TK24（pYG505）菌株转化桑红霉素生成阿霉素 的能力相对较强。通过桑红霉素转化产物的紫外可见吸收光谱分析、LC／MS分析和‘H－NMR＠分析，最终确定工程菌的柔红霉素转化产物中主要由阿霉素和13－M氢柔红霉素组成．其中 前者由工程菌细胞内的羟化酶转化细胞中的柔红霉素形成。后者由宿主菌本身C1 酮还原 酶转化桑红霉素形成。 对TK24（pYG57）工程菌株转化柔红霉素条件进行了初步优化，在优化树下工程菌 TK24巾YG57）对桑红霉素的转化率为 74．4％，是优化前的 3．l倍；而阿霉素和 13－一氢桑 红霉素之比从0．N提高到o．叩。
谢丽萍, 尚珂, 胡又佳, 朱春宝, 朱宝泉[2]2006年在《受SnpR激活的snpA启动子调控的柔红霉素C-14羟化酶基因的克隆、表达和应用研究》文中研究指明尝试将柔红霉素经微生物转化法合成多柔比星,从Streptomyces sp.C5中通过PCR的方法扩增了含核糖体结合位点、大小为1.3kb的编码C-14柔红霉素羟化酶的doxA基因及受SnpR调控的snpA启动子。最终构建的重组质粒pYG908,能表达一大小为46.6ku的蛋白条带,CO结合差光谱分析表明所表达的酶在450nm有吸收峰。重组质粒转化Streptomyces lividans TK24后,工程菌能转化柔红霉素生成和多柔比星保留时间一样的产物。
吴大治, 朱春宝, 朱宝泉[3]2004年在《柔红霉素C-14羟化酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达》文中认为将柔红霉素C-14羟化酶基因与酪氨酸酶基因启动子和红霉素抗性基因启动子串联连接,克隆到变铅青链霉菌TK24中进行表达。经过SDS-PAGE蛋白电泳、CO结合差光谱分析结果证明,重组克隆表达的羟化酶分子量约45 kD、重组的蛋白量约占细胞总蛋白的12％,并具有细胞色素P-450的特征。
谢丽萍, 宫倩, 胡又佳, 朱春宝, 朱宝泉[4]2006年在《柔红霉素C-14羟化酶基因在E.coli中的克隆、融合表达及酶的纯化》文中研究表明doxA基因编码柔红霉素C-14羟化酶(DoxA)。本研究将来自Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482的doxA基因克隆至高效表达载体pET32a中,并在E.coli中表达。经Western blotting实验证明产物融合蛋白表达正确且以包函体形式存在,并初步研究了DoxA的分离纯化方法。
参考文献：
[1]. 柔红霉素C-14羟化酶基因的克隆、表达和应用研究[D]. 吴大治. 上海医药工业研究院. 2003
[2]. 受SnpR激活的snpA启动子调控的柔红霉素C-14羟化酶基因的克隆、表达和应用研究[J]. 谢丽萍, 尚珂, 胡又佳, 朱春宝, 朱宝泉. 中国抗生素杂志. 2006
[3]. 柔红霉素C-14羟化酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达[J]. 吴大治, 朱春宝, 朱宝泉. 中国医药工业杂志. 2004
[4]. 柔红霉素C-14羟化酶基因在E.coli中的克隆、融合表达及酶的纯化[J]. 谢丽萍, 宫倩, 胡又佳, 朱春宝, 朱宝泉. 中国医药工业杂志. 2006