USP49通过去泛素化MITA负调控抗病毒天然免疫反应的机制研究

论文摘要

病毒感染与复制中产生的病原相关分子模式（PAMPs）,如RNA、DNA、RNADNA杂合体可以被模式识别受体（PRRs）识别,随后模式识别受体发生构象变化,招募接头蛋白或催化第二信使招募并激活接头蛋白,进而诱导发生一系列信号级联反应,最终介导信号转导与抗病毒天然免疫应答。有研究显示,胞浆中的DNA可以被cGAS识别,cGAS催化ATP和GTP产生cGAMP,cGAMP继而与MITA相结合并激活MITA,从而激活下游信号通路产生I型干扰素和炎症因子。MITA敲除小鼠对HSV-1感染更加敏感,在MITA敲除小鼠的细胞中,HSV-1感染或转染dsDNA后,IRF3的磷酸化以及下游基因的表达几乎完全受到抑制,这些实验说明MITA是介导胞内DNA信号转导的关键蛋白,在抗病毒天然免疫信号通路中发挥着关键的作用。MITA的功能受到各种翻译后修饰的调控,其中包括泛素化和去泛素化修饰。近年来,大量研究报道了E3泛素连接酶在MITA介导的信号通路中发挥的作用及机制。然而,到目前为止,我们对MITA的去泛素化过程、相关的功能与机制尚不完全清楚。为了进一步了解去泛素化作用对MITA调控的信号通路的影响,我们筛选了与MITA存在潜在相互作用的去泛素化酶,结果显示USP49与MITA存在相互作用,并且,两者的相互作用受HSV-1、dsDNA或cGAMP的诱导。在THP-1细胞中敲低或敲除USP49可以促进MITA介导的信号通路的激活。Usp49敲除小鼠的细胞受HSV-1、dsDNA或cGAMP诱导产生的I型干扰素和炎症因子的表达显著升高,病毒复制的强度显著降低,Usp49敲除小鼠对HSV-1的感染更加抵抗。机制研究结果表明,在HSV-1感染之后,USP49能够特异性去除MITA上K63-连接的泛素链修饰,抑制MITA的寡聚化,进而抑制MITA对下游激酶TBK1的招募以及抗病毒天然免应答。以上研究揭示了USP49在抗病毒天然免疫应答中发挥的重要作用,并且为研究MITA介导的信号通路的调控机制提供了新的思路。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第1章研究背景

1.1 抗病毒天然免疫

1.1.1 模式识别受体

1.1.1.1 Toll样受体（TLRs）调控的信号通路

1.1.1.2 RIG-I样受体（RLRs）调控的信号通路

1.1.1.3 胞浆DNA受体调控的信号通路

1.1.2 转录因子IRF3、NF-的激活以及对I型干扰素的调控

1.2 MITA的功能与调控机制

1.2.1 MITA在天然免疫中发挥免疫防御作用

1.2.2 MITA过度激活造成自身免疫疾病

1.2.3 MITA在抗肿瘤过程中发挥免疫作用

1.2.4 MITA的翻译后修饰

1.3 泛素化修饰在病理生理中的功能

1.3.1 泛素化概述

1.3.2 去泛素化酶概述

1.3.2.1 泛素C端水解酶（UCHs）家族

1.3.2.2 泛素特异性加工酶（USPs）家族

1.3.2.3 卵巢肿瘤相关蛋白酶（OTU）家族

1.3.2.4 Machado-Josephin蛋白酶（MJD）家族

1.3.2.5 JAB1/MPN/Mov34蛋白酶（JAMM）家族

1.3.3 PRRs的泛素化与去泛素化修饰

1.3.4 接头蛋白的泛素化与去泛素化修饰

1.4 去泛素化酶USP49 的结构与功能概述

第2章实验材料与实验方法

2.1 实验材料

2.1.1 抗体与试剂

2.1.2 细胞与细胞培养

2.1.3 小鼠饲养

2.2 实验方法

2.2.1 质粒构建

2.2.2 双荧光素酶报告基因实验

2.2.3 shRNA相关

2.2.4 RT-PCR实验和ELISA实验

2.2.5 慢病毒感染建立细胞系

2.2.6 小鼠感染实验

2.2.7 Knock out细胞系的建立

2.2.7.1 构建CRISPR载体

2.2.7.2 转染THP-1细胞

2.2.8 小鼠肺成纤维细胞的制备

2.2.9 小鼠巨噬细胞（BMDM）和树突状细胞（BMDC）的分化与培养..

2.2.10 蛋白质免疫印迹与免疫共沉淀实验

2.2.10.1 蛋白质免疫印迹

2.2.10.2 免疫共沉淀

2.2.11 蛋白纯化和GST pull down实验

2.2.12 基因敲除小鼠的鉴定

2.2.13 蛋白纯化和GST pull down实验

2.2.14 非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳

2.2.15 Digitonin渗透法转染cGAMP

2.2.16 空斑实验

2.2.17 磷酸钙转染以及Lipofectamine2000转染

2.2.18 流式细胞术

第3章研究结果与讨论

3.1 研究背景与立项依据

3.2 USP49与MITA的相互作用

3.3 USP49参与调控MITA介导的信号通路

3.4 在人源细胞中敲除USP49促进HSV-1诱导的信号通路的激活

3.5 Usp49基因敲除小鼠的制备与检测

3.6 在小鼠细胞中敲除Usp49促进DNA病毒诱导的信号通路的激活

3.7 在小鼠细胞中敲除Usp49对SeV诱导的信号通路没有影响

3.8 Usp49敲除小鼠对HSV-1 的抵抗力更强

3.9 USP49依赖其去泛素化酶活性抑制MITA介导的信号通路

3.10 USP49依赖其去泛素化酶活性去除MITA上K63-连接的泛素

3.11 USP49抑制MITA的寡聚化,抑制TBK1与MITA的相互作用

3.12 总结

第4章讨论与展望

参考文献

缩略词表

硕士期间发表的科研成果目录

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 叶莉亚

导师: 钟波,林丹丹

关键词: 抗病毒天然免疫,泛素化

来源: 武汉大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 武汉大学

分类号: Q939.91

总页数: 66

文件大小: 2155K

下载量: 31

USP49通过去泛素化MITA负调控抗病毒天然免疫反应的机制研究

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢