代谢工程改造熊蜂生假丝酵母生产酸型槐糖脂

论文摘要

槐糖脂是利用微生物代谢合成的一种表面活性剂,它不仅具有日常表面活性剂所具有的增溶、乳化、润湿、发泡、分散、降低表面张力等通用性能,而且对环境的耐受性也是极强。熊蜂生假丝酵母（Starmerella bombicola）能够发酵生产槐糖脂,但槐糖脂具有酸型、内酯型和乙酰化型等不同类型,结构多样。本文拟通过代谢工程改造,构建高产单一的酸型槐糖脂的熊蜂生假丝酵母工程菌株。论文主要结果如下:（1）利用生物信息学工具,从熊蜂生假丝酵母基因组中分离出了1条可能的过氧化物酶体合成影响因子PEX10并且鉴定其功能。构建了PEX10基因缺失菌株,该基因的缺失对十二烷和葡萄糖的代谢没有影响,但严重阻碍了细胞对菜籽油的利用使得槐糖脂的产量也大幅度下降。（2）通过基因敲除和基因过表达的基因工程手段,构建了SBLE基因缺失菌株和SBLE过表达菌株评价该基因功能。通过荧光定量PCR（qPCR）检测了各菌株的SBLE基因转录水平,SBLE过表达菌株的SBLE的转录量是野生型菌株的30多倍,SBLE基因缺失菌株没有检测到;发酵结果显示,SBLE基因缺失菌株的发酵产物中只检测到了酸型槐糖脂,SBLE过表达菌株的发酵产物主要是内酯型槐糖脂,没有检测到酸型槐糖脂。（3）通过合理的设计,构建了潮霉素基因重复利用系统。在熊蜂生假丝酵母S.bombicola半乳糖诱导型启动子控制下,结合β-Rec丝氨酸重组酶,构建了潮霉素抗性筛选标记自弹出系统,该系统主要包括潮霉素抗性基因表达盒、β-Rec丝氨酸重组酶和两个SIX重组位点。该系统的构建实现了潮霉素抗性基因的自我弹出及潮霉素标记的多次使用,从而可以对熊蜂生假丝酵母进行多基因的改造。（4）在潮霉素抗性标记基因重复利用系统Rec-six基因编辑系统基础上构建了几株高产酸型槐糖脂的重组菌。通过将合成内酯型槐糖脂的关键基因—内酯酶基因SBLE敲除获得一株只产酸型槐糖脂的工程菌株SBSL1（Δsble::six）,进一步同源过量表达葡萄糖基转移酶基因UGTB并敲除过氧化物酶体膜转运蛋白编码基因PXA1,构建了高产酸型槐糖脂的酵母工程菌。与出发菌株相比,重组熊蜂生假丝酵母发酵油酸能够合成单一的酸型槐糖脂,而不再合成内酯型槐糖脂,同时酸型槐糖脂的产量由20 g·L-1提高到44g·L-1。

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第一章绪论

1.1 表面活性剂

1.2 槐糖脂

1.2.1 槐糖脂的概述

1.2.2 槐糖脂的性质

1.2.3 槐糖脂的应用

1.2.4 槐糖脂的结构特点

1.3 槐糖脂代谢通路及关键酶

1.3.1 细胞色素氧化酶

1.3.2 葡萄糖基转移酶

1.3.3 乙酰基转移酶

1.3.4 内酯化酶

1.4 熊蜂生假丝酵母菌基因工程改造技术

1.4.1 熊蜂生假丝酵母遗传操作体系建立

1.4.2 槐糖脂产生菌的基因改造

1.5 立题意义及研究内容

第二章材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 引物

2.1.3 主要试剂

2.1.4 培养基

2.1.5 仪器和设备

2.2 方法

2.2.1 过氧化物酶体合成因子PEX10氨基酸序列分析

2.2.2 熊蜂生假丝酵母基因组的提取

2.2.3 PCR扩增体系

2.2.4 敲除盒的构建

2.2.5 过表达盒的构建

2.2.6 含潮霉素自弹出系统的敲除盒构建

2.2.7 基因的敲除潮霉素hph标记基因的弹出

2.2.8 熊蜂生假丝酵母的转化

2.2.9 熊蜂生假丝酵母总RNA的提取

2.2.10 cDNA的合成

2.2.11 荧光定量PCR

2.2.12 发酵培养方法

2.2.13 生长量测定

2.2.14 葡萄糖含量测定

2.2.15 槐糖脂产量测定

第三章结果与讨论

3.1 PEX10基因的分离与功能鉴定

3.1.1 PEX10基因的生物信息学分析

3.1.2 PEX10基因敲除盒的构建

3.1.3 PEX10基因敲除菌株的构建

3.1.4 PEX10基因敲除菌株的生理功能评价

3.1.5 摇瓶发酵测试菌株产槐糖脂的能力

3.2 槐糖脂合成中内酯酶的功能评价

3.2.1 内酯酶SBLE敲除盒的构建

3.2.2 内酯酶SBLE敲除菌株的构建

3.2.3 内酯酶SBLE过表达盒的构建与鉴定

3.2.4 内酯酶SBLE基因的过表达

3.2.5 不同菌株内酯酶SBLE基因的表达

3.2.6 槐糖脂产物测定

3.3 潮霉素自弹出系统的构建及应用

3.3.1 潮霉素自弹出质粒Ts-sble-six-sble构建

3.3.2 潮霉素自弹出质粒SSRH（Ts-sble-six-recex-hphex-sble）构建

3.3.3 潮霉素抗性自弹出系统的应用与评价

3.4 高产酸性槐糖脂工程菌株的构建

3.4.1 ΔsbleΔpxa1 菌株构建

3.4.2 UGTB过表达菌株构建

3.4.3 构建的工程菌株发酵评价

主要结论与展望

主要结论

展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张疆睿

导师: 陈献忠

关键词: 熊蜂生假丝酵母,氧化,过氧化物酶体合成因子,酸型槐糖脂,内酯酶,代谢工程

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 江南大学

分类号: Q78;Q93

总页数: 56

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