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DDT降解菌Ochrobactrum sp.DDT-2谷胱甘肽S-转移酶的克隆、表达和功能研究

2020-12-02阅读(424)

DDT降解菌Ochrobactrum sp.DDT-2谷胱甘肽S-转移酶的克隆、表达和功能研究

论文摘要

有机氯农药曾广泛用于农业害虫与公共卫生防治,虽早已被禁,但如DDT等及其主要代谢产物在自然环境中的残留依然可以检测出来,存在一定的健康与生态风险。谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）作为一类保守的具有多种功能的超基因家族酶系,普遍存在生物体中。GSTs主要功能是催化内源、外源等有毒物质形成低毒易溶于水的化合物而排出体外,减少或避免对机体造成损害。本文通过对实验室保存的DDT降解菌Ochrobactrum sp.DDT-2进行全基因组测序分析,主要研究结果如下:（1）通过使用Illumina Hiseq和SOAPdenovo（v2.04）,测序、组装、优化和补洞后获得了 DDT降解菌Ochrobactrum sp.DDT-2基因信息。通过组装序列、ncRNA信息、编码基因、COG、GO、KEGG功能注释,绘制得到了 DDT降解菌Ochrobbactrum sp.DDT-2基因组圈图。预测全基因组注释中编号为U1GM001187的基因序列,编码谷胱甘肽S-转移酶,命名为dhc基因,作用于DDT→DDE的转化。（2）利用PCR方法从DDT降解菌Ochrobactrum sp.DDT-2菌株中克隆到谷胱甘肽S-转移酶基因dhc,构建重组表达菌株,在IPTG（Isopropylβ-D-Thiogalactoside）的诱导下,在26kDa左右有明显的表达蛋白条带。试验表明其具有降解DDT、DDE和DDD的作用,DDT在dhc基因作用下降解为DDE,随后继续脱氯化氢生成DDMU,DDE和DDD都降解为DDMU。（3）纯化经IPTG诱导的重组表达蛋白,研究其酶学基础特性。纯化后的蛋白酶可在一个较宽的温度（20-45℃）和pH（6.0-7.0）范围内具有降解作用,同时还能降解七氯、林丹、百菌清和β-666,通过对代谢产物的分析得到纯化酶对其作用途径是:β-HCH→五氯环己烯;林丹—→五氯环己烯→三氯苯;百菌清→1,3-二酰胺-四氯苯;七氯→外环氧七氯。本研究获得的降解酶具有较好的降解能力,且具有较好的底物广泛性,有较好的潜在应用价值。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 微生物对有机氯农药的降解
  •     1.1.1 微生物的降解机制
  •       1.1.1.1 直接作用
  •       1.1.1.2 间接作用
  •   1.2 脱氯酶的作用机制
  •     1.2.1 有氧条件下脱氯酶的作用机制
  •     1.2.2 厌氧条件下脱氯酶的作用机制
  •   1.3 细菌谷胱甘肽S-转移酶
  •     1.3.1 细菌谷胱甘肽S-转移酶的分类
  •     1.3.2 细菌谷胱甘肽S-转移酶的功能
  •     1.3.3 细菌谷胱甘肽S-转移酶的潜在应用
  •   1.4 本研究的目的与意义
  • 第二章 DDT降解菌Ochrobactrum sp. DDT-2全基因组测序
  •   2.1 引言
  •   2.2 材料与方法
  •     2.2.1 材料
  •     2.2.2 设备与仪器
  •     2.2.3 培养基
  •     2.2.4 DDT降解菌Ochrobactrum sp.DDT-2的保存和复苏
  •     2.2.5 DDT降解菌Ochrobactrum sp.DDT-2的基因组DNA提取
  •     2.2.6 基因组序列的测定和拼接
  •     2.2.7 基因注释和预测
  •     2.2.8 DDT降解菌Ochrobactrum sp. DDT-2中DDT降解基因的预测
  •   2.3 结果与讨论
  •     2.3.1 基因组的基本特征和结构
  •       2.3.1.1 COG数据库
  •       2.3.1.2 GO数据库
  •       2.3.1.3 KEGG数据库
  •       2.3.1.4 DDT降解菌Ochrobactrum sp. DDT-2基因组圈图
  •     2.3.2 DDT降解菌Ochrobactrum sp. DDT-2中DDT降解基因的预测
  •     2.3.3 预测基因表达蛋白的分析
  •   2.4 小结
  • 第三章 构建谷胱甘肽S-转移酶基因dhc的克隆和表达载体
  •   3.1 引言
  •   3.2 材料与方法
  •     3.2.1 菌株和质粒
  •     3.2.2 试剂与材料
  •     3.2.3 设备和仪器
  •     3.2.4 培养基
  •     3.2.5 DDT降解菌Ochrobactrum sp. DDT-2菌液的制备
  •     3.2.6 质粒DNA的小量提取
  •     3.2.7 E.coli DH5α、Arctic-Express（DE3）普通感受态细胞的制备
  •     3.2.8 引物的合成
  •     3.2.9 重组质粒的构建
  •     3.2.10 表达菌株的构建
  •     3.2.11 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
  •     3.2.12 重组表达载体工程菌的降解验证
  •   3.3 结果与讨论
  •     3.3.1 表达载体的构建
  •     3.3.2 谷胱甘肽S-转移酶基因dhc在Arctic-Express（DE3）中表达
  •     3.3.3 重组表达菌株的降解验证
  •   3.4 小结
  • 第四章 重组表达蛋白的酶学初步研究
  •   4.1 引言
  •   4.2 材料与方法
  •     4.2.1 试验材料
  •     4.2.2 设备与仪器
  •     4.2.3 培养基
  •     4.2.4 重组蛋白酶的纯化
  •     4.2.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
  •     4.2.6 Western blot分析
  •     4.2.7 BSA标准曲线的绘制
  •     4.2.8 温度对纯化酶活性的影响
  •     4.2.9 pH对纯化酶活性的影响
  •     4.2.10 纯化酶对其它农药的降解
  •     4.2.11 降解酶动力学常数测定
  •   4.3 结果与讨论
  •     4.3.1 纯化重组蛋白及浓度测定
  •     4.3.2 温度对纯化酶活性的影响
  •     4.3.3 pH对纯化酶活性的影响
  •     4.3.4 酶促反应动力学研究
  •     4.3.5 纯化酶底物特异性
  •   4.4 小结
  • 第五章 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 何怡雯

    导师: 虞云龙

    关键词: 全基因组,有机氯农药,微生物修复,谷胱甘肽转移酶

    来源: 浙江大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑,农业科技

    专业: 生物学,生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用,农业基础科学

    单位: 浙江大学

    分类号: Q78;X592;X172

    总页数: 84

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