李阳[1]2004年在《RNAi抑制SARS病毒复制与感染的实验研究》文中研究说明严重急性呼吸综合征(Severe acute respiratory syndrome,SARS)又称传染性非典型肺炎,是由一种人类从未发现过的新型冠状病毒所导致的、严重危害公共卫生安全的疾病。WHO已将该病原体命名为SARS冠状病毒(SARS Coronavirus,SARS-CoV)。该病突出特点是来势凶猛、可爆发流行、传染性强、死亡率较高。目前虽然在全球范围内已完全控制了该病,但由于对其认识不深,并不能排除其再度爆发的可能性,因此很有必要继续深入探索防治SARS的方法。迄今为止,没有治疗SARS的特效药,主要依靠对症支持疗法和中西医结合疗法。临床上应用糖皮质激素曾取得较好疗效,但其使用的时机、剂量和持续时间仍是争论的焦点,因为一旦使用不当,可能会抑制机体的抗病毒免疫应答,不利于病毒清除,而且毒副作用很大。抗病毒药物方面,使用最多的是利巴韦林,但缺乏对照研究,体外抗病毒试验也未发现其有抗冠状病毒活性,所以作用尚待进一步明确。使用恢复期SARS患者血清治疗虽说有效,但应用的对象太局限,且危险性和风险性大,故限制了其临床应用。另外,中西医结合治疗虽也取得了积极的疗效,但作用机制无法明确。理论上,控制SARS理想的方法首选是接种疫苗,但是一种安全、有效的疫苗研制周期很长,到目前为止仍然没有对人起保护作用的疫苗可利用。现在,研究其他治疗SARS的新方法正在进行,其中,RNA干扰(RNA interference,RNAi)可能非常有希望成为一种潜在的控制SARS病毒的方法之一。RNA干扰是一种由双链RNA介导的转录后基因沉默机制,当外源导入的dsRNA被Dicer酶切割成19～23nt的小分子干扰RNAs(siRNAs)后,siRNAs就与体内其他成分聚合形成RNA诱导的基因沉默复合体(RISC),然后活化的RISC通过由siRNA决定的碱基配对原理来切割具有同源序列的转录体,最终导致特异的基因沉默效应。RNAi技术发展十分迅速,不仅已成为研究基因功能的有力工具,还正在被用于人类疾病基因治疗的实验研究中。除了将RNAi运用于抑制肿瘤外,在由病毒介导的感染病研究领域,利用RNAi技术来特异的抑制HIV、HCV、HBV和流感病毒的复制及蛋白表达都取得了初步成功。这些都为本课题研究RNAi抑制SARS病毒复制与感染提供了理论依据。本研究受中国国家重点基础研究发展规划资助项目(“973”项目): SARS防治基础研究(2003CB514108)的资助。
王刚[2]2006年在《SARS病毒RdRp基因的RNA干扰研究》文中指出严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)是1种传染性强、病死率高的疾病，目前尚无公认的有效治疗方法。其病原体已被确认为冠状病毒的1个变种，称为SARS冠状病毒。RNAi(RNA interference，RNAi)可以高效、特异地下调靶基因的表达，不仅是研究基因功能的有力工具，而且为特异性基因治疗提供了新的技术手段。能有效抑制靶基因表达的siRNA(small interfering RNA)正在被开发成新型特异性药物，用来治疗病毒感染性疾病、肿瘤以及遗传性疾病等。本研究的目的就是针对SARS病毒筛选出高效、特异的siRNA，为进一步的药物研发奠定基础。 生物信息学分析结果表明，RNA依赖性的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)基因是SARS病毒基因组中最保守的基因；在病毒的所有蛋白质中，RdRp是最重要的蛋白质，是病毒复制增殖所必需的酶。因此，本研究选择SARS病毒的RdRp基因为RNAi的靶基因。我们首先设计了1种安全、高效而可靠的方法来合成该基因：根据DNA shuffling技术的原理和SARS病毒RdRp基因的序列，设计并合成了多条寡核苷酸片段，每个片段末端都两两互补，从而在PCR过程中相互延伸，最终精确地组装成RdRp基因。所得基因的序列与预期设计完全吻合。 利用pcDNA3.1(+)和pEGFP-C1载体构建了3类真核重组表达质粒，并以增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)作为标记基因。构建的表达质粒包括：1)分别表达RdRp和EGFP基因的质粒：pcDNA-RdRp(pcDNA-R)和pcDNA-EGFP(pcDNA-G)。转染Vero E6细胞后，pcDNA-G可表达明显的绿色荧光蛋白；2)表达RdRp和EGFP融合基因的质粒：pcDNA-GR和pcDNA-RG，pEGFP-CR1和pEGFP-CR2。转染Vero E6细胞后，前2个质粒表达的蛋白质荧光
陈维灶[3]2006年在《RNAi抑制口蹄疫病毒复制与感染的相关研究》文中研究指明RNA干扰(RNA interference，RNAi)是20世纪90年代末发现的一种真核生物细胞在转录后引发基因沉默的分子机制，该机制的发现被美国Science杂志评为2001年世界十大科技进展之首，是近年来分子生物学最引人关注的研究进展。诱发RNAi的最关键分子是长度为19—27个核苷酸的双链RNA，称作小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，并由一系列蛋白复合物介导，对与之具有序列同源性的基因在转录、转录后、翻译等水平进行表达调控。SiRNA可以由细胞内源性产生，或者外源性由病毒感染、转座子侵入、或质粒转染表达。该机制在从酵母到哺乳动物等真核生物中普遍保守，并证明在这些物种中发挥着发育调控、病毒免疫等重要功能。目前，RNAi的分子机制及其功能仍然有待更加细致地阐明，但作为一种反向遗传学手段已经在基因功能研究中广泛运用，并已作为一种治疗策略运用于人类抵抗重大遗传性疾病和病毒性疾病的研究当中。本文将对RNAi的分子机制，及其抗病毒功能的相关研究作出简要的概括和展望。口蹄疫(foot-and-mouth diseas，FMD)是偶蹄类动物的高度传染性疾病，引发FMD的病原体是小RNA病毒科口蹄疫病毒属的口蹄疫病毒(FMD virus，FMDV)。VP1基因是FMDV的四个结构蛋白基因之一，在病毒感染过程中该蛋白与易感细胞表面受体结合，介导病毒对细胞的感染。我们设计并构建了两个靶向FMDV VP1基因的shRNA表达质粒(pNT21和pNT63)，首先在BHK-21细胞中评估了该shRNA表达质粒对VP1／绿色荧光蛋白(EGFP)融合报告基因表达的抑制效应，接着在BHK-21细胞和乳鼠动物模型中进一步检验了它们的抗病毒活性。结果表明，当shRNA表达质粒与报告基因表达质粒(pVP-EGFP-N1)共转染BHK-21细胞时，报告基因的表达水平降低了80-90％。在病毒攻击实验中，转染了shRNA表达质粒的8HK-21细胞能够显着抵抗100个半数细胞感染剂量(50％tissue culture infective dose，TCID_(50))FMDV的感染，抗病毒效应持续时间超过48小时。在乳鼠动物模型中，用100微克shRNA表达质粒通过颈部皮下注射乳鼠，约80％的动物在6个小时后能够抵抗20个半数动物致死剂量(50％animal lethal dose，LD_(50))FMDV的攻击。此外，我们发现了一种增强RNAi效应的新途径，我们构建了一个表达VP1基因mRNA的质粒pVP1，将该质粒与shRNA表达质粒共同注射乳鼠可以显着提高动物的保护率。实验结果暗示，RNAi可能成为预防或治疗FMDV感染的可行方法。发展RNAi技术使其成为一种可行的FMDV防御策略面临一个重大的挑战，那就是RNA病毒普遍具有的高度的遗传多变性。这里，我们通过序列分析确定了FMDVHKN／2002基因组的5个保守区(分别是5’NCR、VP4、VPg、POL和3’NCR)，并采用T7 RNA聚合酶体外转录长dsRNA、人重组Dicer酶体外剪切的策略获得鸡尾酒siRNA(cocktail siRNA)。实验结果表明，这些siRNA的转染能够有效降低相应的保守区基因与EGFP融合基因在BHK-21细胞中的表达水平。在病毒攻击实验中，能够诱导BHK-21细胞对O型同源(HKN／2002)和异源(CHA／99)毒株的交叉抑制，在病毒感染48 h检测到约10-1000倍的抑制效率，而且，抑制效应至少持续了6天。有趣的是，这些HKN／2002特异性的siRNA还能够显着抵抗Asial型病毒YNBS／58的感染，在感染后12、24和48 h均检测到了约10倍的抑制效率，但是该抑制效应最多只能持续约60 h。此外，我们观察到在事先感染了FMDV的BHK-21细胞中，siRNA的转染对病毒复制的抑制似乎更加有效。我们的实验结果表明，靶向病毒基因组保守区的RNAi是克服病毒遗传多变性的一种可行的策略。业已证明RNAi作为FMDV防御策略在细胞水平是有效的，但是在动物个体水平的有效性仍然有待评估。在这里，我们采用复制缺陷型的人重组腺病毒(Ad5)作为载体构建能够表达靶向FMDV 1D和3D基因shRNA的新型重组腺病毒(分别为Ad5-NT21和Ad5-POL)。实验证明，Ad5-NT21和Ad5-POL能够完全保护猪IBRS-2细胞不受同源FMDV毒株的感染，Ad5-POL还能够抵抗异源FMDV毒株的感染。接着我们利用豚鼠作为动物模型，评估了新型重组腺病毒在动物个体内对FMDV感染的抑制效应，结果表明，每头豚鼠肌肉注射10~6PFU剂量Ad5-POL，在面对24 h后50 ID_(50)同源FMDV攻击时，有3／5的动物没有明显的口蹄疫疾病症状(即在脚掌发生病毒性水泡)；但是，两次免疫、或者提高重组腺病毒的剂量、或者同剂量Ad5-NT21／Ad5-POL混和注射等对免疫方法简单地进行改进并不能提高对动物的保护效率；令人惊讶的是，Ad5-NT21／Ad5-POL的混和注射使豚鼠能够即刻有效地抵抗50 ID_(50)同源FMDV攻击，这暗示腺病毒介导的RNAi能够十分快速地抑制病毒的复制。以豚鼠动物模型的抗病毒实验数据为参照，我们进一步以易感动物而且也是主要的经济型动物之一的家猪作为对象，评估了重组腺病毒的抗病毒潜力，结果显示，给家猪颈部肌肉注射4×10~9 PFU剂量Ad5-NT21／Ad5-POL混合腺病毒，有2／3的猪能够抵抗24 h后100 ID_(50)同源FMDV的攻击而不发生任何明显的口蹄疫疾病症状。Ad5-NT21和Ad5-POL的抗病毒潜力是特异的，因为作为对照的能够表达靶向大肠杆菌LacZ基因shRNA的重组腺病毒Ad5-LacZ没有任何显着的抗病毒活性。绝大多数真核生物细胞拥有一套由dsRNA诱发的对具有序列同源性的mRNA产生表达抑制效应的分子机制，称为RNA沉默(RNA silencing)。大量的研究资料表明，RNA沉默是植物和无脊椎动物细胞主要的病毒防御机制。近年来发现，该分子机制也十分保守地存在于哺乳动物细胞当中，尽管哺乳动物细胞诱发的RNA沉默反应的能力似乎比植物或无脊椎动物细胞有所减弱。由于脊椎动物具备一套完善的蛋白质水平的免疫系统(protein-based immune system)，因此，在脊椎动物细胞中发现RNA沉默分子机制使科学界对脊椎动物病毒防御机制的发展进化有了更新的认识。我们认为，脊椎动物拥有的另一套病毒防御机制——干扰素系统(IFN system)可能是真核生物免疫系统从RNA沉默进化到蛋白质免疫过程当中的中间产物：干扰素系统的出现可能解释了RNA沉默机制在脊椎动物细胞中的弱化以及蛋白质免疫系统的发展与成熟。此外，我们在本文中亦强调，RNA沉默机制的发现为人类更深地了解脊椎动物病毒防御机制乃至生命进化提供一个契机。
陈杰斌[4]2006年在《RNA干扰技术对柯萨奇B组3型病毒的抑制作用研究》文中研究指明第一部分：CVB_3-VP_1 siRNA对CVB_3体外复制的抑制作用 目的：RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年发现的研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术，是由小干扰RNA引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象。利用RNAi技术研究对CVB_3的复制的抑制作用，观察柯萨奇B组病毒3型衣壳蛋白1(CVB_3-VP_1)特征性小干扰RNA(small interferingRNA，siRNA)对CVB_3复制及VP_1蛋白表达的抑制作用，探索抗CVB病毒感染的基因治疗新的方法。为CVB感染性疾病的治疗提供理论基础。 方法：根据CVB_3 VP_1基因的序列及其结构特征，设计并用化学方法合成4对siRNA。以CVB_3感染HeLa细胞，实验病毒用量为100μL内含100TCID_(50)病毒液／孔，18小时后通过脂质体介导以siRNA转染HeLa细胞，siRNA用量为3μL(60pmol)。七组HeLa细胞分别为转染CVB_3 VP_1-1 siRNA组，转染CVB_3 VP_1-2 siRNA组，转染CVB_3 VP_1-3 siRNA组，转染CVB_3 VP_1-4 siRNA组，转染no silencing-siRNA组，阳性对照组，空白对照组。48h后观察细胞病变的程度、TCID_(50)法测定病毒滴度、用免疫荧光法测定CVB_3-VP_1蛋白表达，RT-PCR法检测CVB_3-RNA的水平。 结果：(1)CVB_3 RNA检测 siRNA组中VP_1-1、VP_1-2和阴性对照组无扩增条带，而阳性对照组与非特异siRNA及VP_1-3、VP_1-4组均可见827bp靶基因的条带。(2)免疫荧光法测定CVB3-VP1蛋白表达半定量分析表明，感染病毒后再转染VP_1-3、VP_1-4组及非特异siRNA与阳性对照组相比较无统计学意义(P＞0.05)；而转染VP_1-1，VP_1-2 siRNA与阳性对照组比较差异有显着性(P＜0.05)。(3)HeLa细胞病理变化 在相差显微镜下观察到在VP_1-3和VP_1-4组大多数细胞肿胀、变圆、卷缩变形及空斑形成，而转染VP_1-1和VP_1-2组的细胞则只有少数细胞死亡。提示VP_1-1和VP_1-2组对CVB_3感染的HeLa细病变程度较轻，具有明显的保护作用，而VP_1-3和VP_1-4的保护作用不明显。(4)病毒滴度测定显示，VP_1-1和VP_1-2 siRNA组病毒滴度为0，而VP_1-3、VP_1-4
张守峰[5]2007年在《狂犬病病毒的RNA干扰研究》文中研究指明RNA干扰(RNAi)是广泛存在于生物体内的小双链RNA诱导的mRNA水平的基因表达沉默现象,RNAi对基因表达的调控、病毒感染的防护、基因转座的控制等都具有重要的意义。随着RNAi机制及其应用研究的不断深入,许多学者以人工诱导RNAi的方式进行了病毒复制的干扰研究,并取得了良好的进展,也为狂犬病的暴露后治疗研究开辟了新的探索领域。本研究针对狂犬病病毒的体内外复制进行了RNA干扰的成功探索,为siRNA应用于狂犬病病毒的基因功能研究以及狂犬病的暴露后乃至发病后治疗积累了必要的实验数据。基于质粒pSilencer2.1-U6 Hygro(Ambion),构建了以小鼠U6启动子为调控元件的siRNA表达载体共31个;上述载体转染BHK-21细胞,在潮霉素压力下,筛选获得siRNA稳定表达细胞株22株,其中BHK-N19(98.9%)和BHK-G69(94.6%)对狂犬病病毒复制的抑制率超过90%,RNAi效应与细胞培养时间无明显相关;针对靶序列N19、G69合成的21nt的双链siRNA分子,瞬时转染BHK-21单层细胞后,对狂犬病病毒的复制抑制率分别为86.7%和78.9%,但随转染时间延长,RNA干扰效率降低;质粒p2.1-G69及合成分子siRNA-G69对小鼠感染模型体内狂犬病病毒的复制具有明确的干扰效应,肌注后可使小鼠模型发病率显着降低,发病时间显着延长;但以p2.1-G69进行小鼠狂犬病感染模型的前驱期治疗,无明显疗效。
王崇龙[6]2006年在《RNAi技术抑制家蚕杆状病毒增殖研究》文中进行了进一步梳理RNA干扰(RNAi, RNA interference)是dsRNA介导的特异性基因表达沉默现象,是生物界一种古老而且进化上高度保守的基因表达调节机制。RNAi在生物体中普遍存在,原虫、线虫、真菌、昆虫以及哺乳类动物中都已发现RNAi现象。本研究将IE-1基因+18~+446区以反向串联方式连接,构建在细胞内能利用IE-1基因启动子转录形成发夹状dsRNA的RNAi表达载体pSK-IE,和转基因RNAi载体pigA3-IE-Neo。将pSK-IE转染细胞,注射蚕蛹均表现出对BmNPV抑制作用。表明IE-1启动子可以用作构建RNAi DNA载体的启动子,转染效率的高低直接影响到RNAi的检测。用pigA3-IE-Neo转染细胞,G418筛选4个月,获得了转pigA3-IE-Neo细胞,阳性率可达到80%。感染BmNPV后,转基因细胞相比正常细胞表现出对BmNPV更强的抑制作用。另外,克隆了BmNPV的alk-exo基因,并构建了基于alk-exo基因的系统进化树;用原核表达系统和昆虫表达系统成功实现了SARS-CoV S与M基因的融合表达。
刘美[7]2009年在《RNAi靶向NP、L基因抑制鹅源副黏病毒的复制》文中研究说明根据鹅源副黏病毒NA-1株已发表的NP、L基因序列,鸡胚及禽类已知基因序列,以及siRNA表达载体要求和RNAi靶位基因序列选择原则,应用BLAST工具筛选出特异性地针对鹅源副黏病毒的siRNA序列,同时设计阴性RNAi靶位。根据所设计的RNAi的靶位分子和表达载体的要求,将RNAi靶位分子经过退火、纯化后连接到酶切后的RNAi专用表达载体上,进而转染感受态细胞,通过筛选即可获得阳性重组质粒。根据GenBank上鹅源副黏病毒NA-1株NP、L基因的序列,在保守区域设计并合成两对引物,以鹅源副黏病毒NA-1株反转录产物cDNA为标准品,优化反应获得一系列条件,建立了标准曲线,并进行融解曲线分析。建立了采用荧光嵌合法(SYBR GreenⅠ)来检测鹅源副黏病毒的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法。将构建好的RNAi质粒按照脂质体2000说明书转染鸡胚成纤维细胞(CEF)及鸡胚,6h后接种病毒。接毒后36h时分别用Real Time RT-PCR、病毒滴度测定、间接免疫荧光、细胞病变情况来观察RNAi对GPMV NA-1在CEF中复制和繁殖的影响情况。并用血凝试验检测RNAi在鸡胚中的抑制作用。实验结果显示,针对GPMV NA-1株NP及L基因设计了4个RNAi靶位,在RNAi过程中表现出了很强的抑制效果,其中针对NP基因的抑制效率最高可达到96.5%,针对L基因的抑制效率最高可达到91.6%。说明了NP及L基因的这两个位点是鹅源副黏病毒复制所必需的。将RNAi用于抑制鹅源副黏病毒复制研究,可为鹅源副黏基因组功能研究、抗病毒药物的研发和转基因动物的研究奠定基础。
丁艳华[8]2007年在《古菌组蛋白（HphA）介导小发夹RNA抑制HCV 5'NCR和C区表达的研究》文中指出全世界目前己有1.7亿HCV感染者,我国普通人群抗-HCV阳性率为3.2%。急性HCV感染者中,大约80%可发展为慢性持续感染,其中20%的患者经历20-30年将发展为肝硬化,1%-5%的患者可进展为肝细胞癌。HCV所导致的终末期肝病是重要的死亡原因之一,也是肝移植的原因。目前慢性丙型肝炎的标准治疗是干扰素联合利巴韦林,但有效率仅仅40%-80%左右,人们试图开发新型、高效的治疗药物来解决这一问题。自RNAi技术发现以来,已广泛应用于分子生物学领域的研究,并且已经证实其在细胞水平能有效抑制HIV、脊髓灰质炎病毒、HBV及HCV的复制和表达。本文构建了叁个靶向(targeting to)HCV 5'NCR和C区的小发夹RNA质粒表达载体,与含有HCV 5’NCR和C区部分基因及荧光素酶报告基因的质粒共转染人肝细胞HL-7702。通过检测荧光素酶报告基因和Western blot来检测目的蛋白表达。发现靶向HCV 5'NCR NCR和靶向C区的shRNA能明显抑制HCV 5'NCR和C区的表达。目前小干涉RNA进行体内实验的主要障碍是缺乏安全有效的转基因载体。我们应用了一种非病毒类载体古菌组蛋白(HPhA)作为转基因载体。在实验中发现HPhA能与DNA结合,毒性很小,能在血清存在的条件下转染小干涉RNA表达质粒进入细胞抑制HCV 5’NCR和C区的表达。所以HPhA有潜力发展为适合体内实验的转基因载体。本文首次应用HPhA作为转基因载体,为小干涉RNA抗病毒基因治疗的体内实验提供了重要的理论基础、技术路线和实验方法。
闫秀英[9]2008年在《淋巴囊肿病毒中国分离株（LCDV-cn）系统关系分析与功能基因研究》文中提出淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus, LCDV),属于虹彩病毒科(Iridoviridae),淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus),其分布遍及全球;能引起9个目34科计140种以上淡、海水鱼的淋巴囊肿病,在淡、海水鱼组织细胞中可以增殖并引起宿主细胞病变,在病鱼体表等处形成囊肿物。该病毒病在发病的养殖场的感染率可达90%以上,病鱼不仅外形丑陋,且会发生死亡,严重影响了商品价值和市场销售。1962年,Walker首次在鲽形目鱼类中发现淋巴囊肿病的病原,并命名为淋巴囊肿病毒(LCDV);1997年Tidona等测得了LCDV-1的全基因组序列,报告LCDV-1基因组长102653 bp、编码195个ORF。在中国,1997年底首次在威海地区呈亚急性暴发;1998年,孙修勤等从患病养殖牙鲆体内首次分离出淋巴囊肿病毒、称之为淋巴囊肿病毒中国分离株LCDV-cn,并开始对淋巴囊肿病毒进行了系统的研究。2000年,徐洪涛等获得了LCDV-cn mcp基因的部分序列,认为LCDV-cn的mcp基因序列与LCDV-1的mcp基因序列的同源性为78%。2004年,张奇亚等LCDV-C的全基因组序列,认为基因组长186250 bp、编码240个ORF。本文以LCDV-cn核衣壳蛋白基因(mcp)为分子标记,通过PCR扩增和克隆测序获得了长度为1356 bp的、含178个信息位点的mcp基因序列;用最大简约法、最大似然法、邻接法和Bayesian法构建了分子系统树并进行了置信度检验,从DNA水平上分析了LCDV-cn与淋巴囊肿病毒韩国鲈鱼分离株(LCDV- sb)、淋巴囊肿病毒日本牙鲆分离株(LCDV-jf)、淋巴囊肿病毒欧洲分离株(LCDV-1)、淋巴囊肿病毒日本岩鱼分离株(LCDV-rf)及淋巴囊肿病毒中国军曹鱼分离株(LCDV-rc)的系统关系。结果表明,LCDV-cn的mcp基因序列与LCDV-C的mcp基因序列是一致的,构建的淋巴囊肿病毒ML、NJ、MP和Bayesian系统树的拓扑结构也一致,LCDV-rc与LCDV-sb聚为一支;LCDV-cn与LCDV-jf聚为一支;LCDV-1独为一支;LCDV-rf也独为一支。在对35种虹彩病毒的系统关系分析中,LCDV-cn与其他淋巴囊肿病毒分离株聚为一大支,说明LCDV-cn与淋巴囊肿病毒的关系近于其他虹彩病毒。遗传距离和系统关系分析认为,LCDV-1属于基因型Ⅰ型,LCDV-cn和LCDV-jf属于基因型Ⅱ型,LCDV-rf属于基因型Ⅲ型,LCDV-rc和LCDV-sb属于基因型Ⅳ型。本研究经PCR扩增、克隆和测序,证明了获得的11个LCDV-cn的基因DNA序列与已登陆的LCDV-C相应序列一致。据此,本研究以LCDV-C基因组序列为参考序列进行分析,结果表明,LCDV-cn基因组中有119个ORF与其它虹彩病毒无同源区域、是LCDV特有的;而LCDV-cn还有52个自身特有的、含有功能结构或重复序列的ORF,该52个ORF与其他淋巴囊肿病毒和LCDV无同源区域。锌指蛋白在基因的表达调控、细胞分化、胚胎发育及疾病的发生等生命过程中发挥重要作用。本文通过PCR法从LCDV-cn基因组DNA中获得了锌指蛋白基因序列,将DNA序列装入pET24a(+)表达载体,在E.coli中进行蛋白表达并获得成功。生物信息学软件分析表明:lcn61编码的锌指蛋白含有4个C2H2型锌指结构域,lcn140编码的锌指蛋白含有4个C3H1型锌指结构域和4个简单重复序列。LCDV-cn锌指蛋白的研究将有助于进一步了解LCDV的发生与发展,为阐明病毒致病的分子机理提供科学依据。迄今,病毒DNA疫苗在抗病毒性疾病上取得了很大成功,但在抑制病毒编码功能蛋白时却可能影响宿主细胞内的功能蛋白。RNAi是一种新型基因沉默方法,已成功应用于多种生物体和组织细胞的基因功能研究。有文献报道,RNAi也存在于海洋生物中、并在海洋生物功能基因等研究中得到应用。本文根据LCDV-cn和LCDV的特有基因序列设计siRNA,将siRNA注射入牙鲆体内,首次研究了RNAi对LCDV-cn基因表达的影响,结果发现,注射mcp-siRNA1和mcp-siRNA3后,LCDV-cn的mcp基因表达量有所减少,说明LCDV的mcp基因在RNAi技术处理后有所抑制。
杨帆[10]2004年在《1. 慢性粒细胞性白血病融合基因bcr/abl第一外显子条件性基因打靶的实验研究 2. RNA干扰在哺乳动物细胞中的初步应用性研究》文中指出9号和22号染色体相互易位形成融合基因bcr／abl，是慢性粒细胞性白血病(CML)的主要发病机制。bcr／abl所编码的融合蛋白p210~(BCR/ABL)具有异常增高的酪氨酸激酶活性，与白细胞的恶性转化密切相关。研究发现，bcr／abl融合基因中bcr基因第一外显子(即bcr／abl的第一外显子bE1)所编码的肽段为激活原癌蛋白c—ABL的酪氨酸激酶活性所必需。本课题拟利用定点打靶系统Cre／loxP系统作用原理，通过同源重组将loxP序列引入CML细胞系K562基因组的bE1两侧，并通过调控Cre酶的表达调控细胞内bE1基因的敲除过程，观察bE1敲除后K562细胞在生长、转移及致癌性等方面的变化，从而为深入阐明CML的发病机理、演变过程、改善治疗方案及估计预后提供有力的理论依据。 我们首先通过四方面的实验全面分析和检验了我们所采用的基因打靶体系的有效性：1)利用染色体检查和核型分析检测了K562细胞内染色体的数目和特点，同时采用原位荧光杂交(FISH)测定了细胞内bcr／abl融合基因的拷贝数和分布情况。染色体检查和核型分析结果显示，K562细胞核内有67～69条染色体，其中22条染色体有2～3条，未见典型的Ph′。而FISH结果却表明，K652细胞虽然没有Ph′，但却有叁对或多对bcr／abl或abl／bcr融合基因，无论是bcr、abl还是二者产生的融合基因都存在过度扩增现象。结果表明，K562可以作为针对bcr／abl的基因打靶的靶细胞；不过由于bcr／abl过度扩增，可能需要多次打靶才能观察到打靶的效果。2)应用Tet—on系统的作用原理，分别构建了调控蛋白的表达载体pIREShyg2-rtTA及Cre酶表达载体pTREneo-Cre(含有Tet反应元件TRE)，将这两种载体联合转染后，以不同浓度强力霉素(Dox)诱导Cre酶的表达，Western blot检测结果显示：Dox可通过激活调控蛋白rtTA，显着诱导细胞中Cre酶的表达，Cre表达水平与Dox浓度呈正相关。这一结果说明我们建立了可调控型Cre酶的表达体系，为下一步对基因打靶进行调控打下了基础。3)将不同剂量的K562细胞通过尾静脉注射到NOD／SCID小鼠体内，观察尾静脉注射K562细胞对小鼠存活的影响，并对死亡小鼠的内脏进行病检。结果显示，静脉注射1×10~6～10~7K562细胞后，除1×10~6注射的小鼠外，其余剂量组小鼠均发生急性白血病并在13～49天内死亡，小鼠存活时间与注射细胞剂量之间呈明显的负相关关系；死亡小鼠极度消瘦，内脏病检可见肿瘤细胞浸润，有叁只小鼠大脑组织中亦可见到肿瘤细胞浸润，这是静脉注射K562细胞导致中枢神经系统白血病的首例报道。上述结果表明NOD／SCID小鼠可作为尾静脉注射K562诱发白血病的良好模型。4)利用PCR分别扩增bE1序列、紧邻其上游、下游的内含子序列以及Abl基因第
参考文献：
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